Riassunto esame Biochimica, prof. Attinà 

Enzimi

Gli enzimi sono delle proteine, che durante una reazione, non vengono modificati o consumati e alla fine della reazione si ritrovano inalterati. Questi agiscono, dando poca importanza alla temperatura e al pH e hanno peso molecolare molto maggiore rispetto ai substrati o ai gruppi funzionali sul quale agiscono. Alcuni sono costituiti solo da amminoacidi, altri richiedono la presenza dei cofattori.

Cofattori

I cofattori sono piccole molecole di natura non proteica o degli ioni metallici che si associano all'enzima e grazie ad esso possono iniziare l'attività catalitica. Si distinguono in:

• Ioni metallici: Cu²⁺, Fe³⁺, Zn²⁺
• Coenzima: NAD, FAD

Se i cofattori sono associati in modo temporaneo, vengono chiamati cosubstrati, se sono associati in modo permanente sono chiamati gruppi protosterici. Un enzima cataliticamente attivo con i suoi coenzimi o ioni metallici è detto oloenzima, mentre la parte proteica di un enzima è detta apoenzima o apoproteina.

I coenzimi vengono modificati chimicamente durante le reazioni (NADH, FADH₂) ma per completare il ciclo catalitico, devono tornare al loro stato iniziale, attraverso anche l'uso di reazioni di rigenerazione che possono essere fatte anche attraverso l'uso di un altro enzima.

Molti organismi non riescono a sintetizzare alcuni coenzimi essenziali e per farlo hanno bisogno delle vitamine, che devono essere presenti nella dieta dell'organismo dell'animale. Si pensa che la capacità di sintesi delle vitamine negli animali superiori sia andata perduta perché superfluo, dove le vitamine utili per i coenzimi essenziali sono tutte idrosolubili, quelle liposolubili come la vitamina D e A non sono componenti di coenzimi.

Coenzimi specifici

NAD (Nicotinammide Adenin Dinucleotide) e NADP (Nicotinammide Adenin Dinucleotide Fosfato) sono i due coenzimi tipici delle deidrogenasi piridiniche. Il NADP differisce dal NAD per avere il ribosio adenosinico fosforilato in posizione 2'. Il gruppo funzionale è la nicotinammide, derivata dall'acido nicotinico o niacina. La nicotinammide accetta uno ione idruro (un protone con una coppia di elettroni) dal substrato, riducendosi, mentre il secondo idrogeno viene rilasciato nel mezzo come ione H⁺.

FAD e FMN sono i coenzimi tipici delle flavoproteine, cioè enzimi che trasferiscono elettroni. Nel FAD (Flavin Adenin Dinucleotide), la riboflavina è legata tramite il CH₂OH terminale al gruppo pirofosforico di un ADP. Il FMN (Flavin Mono Nucleotide) è invece semplicemente la riboflavina fosforilata sul CH₂OH terminale, non è pertanto un vero e proprio nucleotide, perché non contiene uno zucchero. Gli elettroni (atomi di H) possono essere trasferiti singolarmente o in coppia ed entrambi i coenzimi sono saldamente legati alla proteina quindi sono gruppi prostetici talvolta mediante un legame covalente (ad es. succinicodeidrogenasi). A differenza dalle flavoproteine, i coenzimi piridinici non sono legati saldamente alla deidrogenasi, ma funzionano piuttosto come cosubstrati.

Il Coenzima A ha la funzione di trasportare un gruppo acile o acetile in forma "attivata". Il gruppo trasportato è legato al gruppo funzionale tiolico (-SH) tramite un legame tioestere dove rilascia una elevata energia libera di idrolisi. Grazie a questa caratteristica le reazioni di trasferimento del gruppo acile o acetile possono procedere spontaneamente. L'acido pantotenico (vitamina B5) è un componente essenziale del coenzima A.

Funzionamento degli enzimi

Gli enzimi in generale non influiscono sull'equilibrio tra reagenti e prodotti, infatti aumentano la velocità della reazione allo stesso modo in tutti e due le direzioni, ma non sono in grado di far partire reazioni non spontanee (ΔG > 0). La reazione dell'enzima (catalisi) avviene nel sito attivo, che è una tasca o fenditura sulla superficie dell'enzima dove all'interno c'è il sito di legame che si lega per il substrato (è la molecola su cui agisce l'enzima) e i gruppi catalitici che garantiscono la rottura e la formazione dei legami. Il legame del substrato con il sito attivo coinvolge interazioni non covalenti, la forma e la polarità del sito di legame sono responsabili della specificità enzimatica.

Teorie sulla catalisi enzimatica

Vennero fatte due teorie sulla catalisi enzimatica: la teoria del modello chiave-serratura di Fisher e l'ipotesi dell'adattamento indotto di Koshland.

Il modello chiave-serratura, dice che gli enzimi sono complementari al loro substrato e che quindi i due elementi si adattassero tra di loro come una chiave e una serratura, determinando un incastro perfetto. La teoria della chiave-serratura può essere non corretta quando si parla della catalisi enzimatica, infatti un enzima complementare al suo substrato potrebbe essere un "cattivo" enzima.

L'ipotesi dell'adattamento indotto dice invece che il sito attivo può modificarsi in base al substrato, che genera a sua volta un rimodellamento del sito attivo formando così un legame più stabile. In alcuni casi, come nella glicosidasi, anche il substrato può cambiare la propria forma all'ingresso del sito attivo. La nuova conformazione che viene acquistata da una maggiore capacità catalitica rispetto a prima.

Velocità di reazione

L'utilità principale dell'enzima è quella di aumentare la velocità di reazione, dove a temperatura costante, è proporzionale alla concentrazione dei reagenti (A).

• A = reagenti
• P = prodotti
• k = costante di velocità, che è anche la costante di proporzionalità

Avendo una reazione tra i reagenti A e B, le concentrazioni di questi due composti diminuiranno formando i prodotti P e Q e per fare ciò c'è bisogno di un dato tempo. La velocità con cui essa accade è dato dal rapporto tra la variazione di concentrazione di un reagente o di un prodotto e l'intervallo di tempo considerato.

Affinché questa reazione avvenga, bisogna che alcune molecole dei reagenti A e B abbiano più energia rispetto alle altre. Avendo questo requisito, lo stato iniziale della reazione viene chiamato stato basale (o attivato) che corrisponde al contributo di energia libera fornito al sistema dalle molecole dei reagenti, dove questa energia servirà a far avvenire la reazione, facendo passare le molecole a un livello energetico superiore di quello basale. Allo stadio basale segue lo stato di transizione, dove l'energia libera è massima e le molecole possono decadere diventando reagenti (rilasciando l'energia in eccesso sotto forma di luce o calore) o prodotti. Le probabilità che una reazione avvenga verso una direzione rispetto ad un'altra è data dalla variazione di energia libera (ΔG) tra reagenti e prodotti, se è negativa la reazione procede spontaneamente verso i prodotti, se è positiva procede verso i reagenti. Energia usata per fare avvenire la reazione viene chiamata energia di attivazione, che è l'energia (calorie) che servono per portare 1 mole di reagente allo stato di transizione. La velocità di una reazione chimica è proporzionale alla concentrazione di molecole che sono nello stadio di transizione.

Modi per aumentare la velocità di una reazione

• Aumentando la temperatura, perché aumenta i moti termici delle molecole e aumentano le molecole che hanno energia interna utile per portarle allo stato di transizione.
• Impiego di un catalizzatore (enzima) che diminuisce l'energia sufficiente per arrivare allo stato di transizione, facendo quindi entrare le molecole nello stato di transizione con una energia disponibile più bassa.

Questo porta a un maggior numero di molecole in una unità di tempo in grado di reagire rispetto all'assenza dell'enzima, dove alla fine della reazione viene rilasciato e può combinarsi con altre molecole dei reagenti. Esistono anche reazioni a 2 tappe, cioè reazioni che passano 2 stati di transizione e 2 diversi livelli di energia d'attivazione. La velocità della reazione, non si mantiene costante, ma va diminuendo con il passare del tempo per vari motivi: se la concentrazione del substrato non è elevata, se la reazione è reversibile il prodotto innesca la reazione contraria, l'enzima può andare incontro a denaturazione e il prodotto può inibire l'enzima. Quindi, visto che in una reazione enzimatica la velocità varia, si va a misurare la sua iniziale (V₀).

La prima equazione generale di velocità per una reazione enzimatica fu derivata nel 1903 da Victor Henri. L'enunciato dice che la velocità iniziale della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell'enzima, ma cresce in modo non lineare al crescere della concentrazione del substrato (la molecola su cui agisce l'enzima) fino ad un valore limite massimo. Gli studi di Henri furono ripresi ed ampliati da Michaelis e Menten (1913) che ne hanno dato il nome di equazione generale di velocità di reazioni enzimatiche ad un substrato.

Il meccanismo della reazione è:

• k₁ E + S ⇌ ES ⇌ E + P
• k₂ ES → E + P

La prima assunzione (k₁ e k₂) è nota come quasi equilibrio o equilibrio rapido, questo perché la formazione del complesso ES è molto rapido e reversibile, questo equilibrio non influenza la formazione del prodotto e la velocità di formazione del prodotto è molto piccola rispetto alla velocità con cui ES si scinde in E + S (k₃ << k₂). La seconda assunzione è nota come velocità iniziale e viene valutato come quel tempo in cui la reazione inversa è praticamente trascurabile (k₄ = 0), quindi la scissione di ES in E + P è praticamente irreversibile.

Briggs e Haldane introdussero il concetto di stato stazionario che è quella fase in cui la concentrazione di ES rimane costante:

• k₂ ES → E + P

Oltre allo stato stazionario, c'è anche lo stato pre-stazionario che è il periodo in cui la concentrazione di ES aumenta. Dopo lo stato stazionario, l'S (il reagente) si esaurisce e l'enzima (E) viene rilasciato e in questo momento abbiamo la conversione massima in prodotti. La velocità di formazione del prodotto quindi si può calcolare come:

• k₂ ES → E + P

Questa velocità, è anche la velocità massima ottenibile per una data quantità di enzima in condizione di saturazione del substrato (reagente dove si attacca l'enzima).

In generale, la velocità enzimatica si può calcolare con:

V = V_max [S] / (K_m + [S])

Visto che il substrato è sempre molto maggiore rispetto agli enzimi, possiamo dire che tutto l'enzima presente è legato a un substrato e che quindi la costante di velocità data dall'unione tra il legame enzima-substrato (k₃) per la concentrazione del legame enzima-substrato ci da la velocità massima ottenibile (V_max):

V_max = k₃ [ES]

Grazie alla velocità massima possiamo determinare la velocità iniziale di una reazione enzimatica determinata da Michaelis-Menten, dove questa formula mette in relazione la velocità massima, una costante di velocità media che dipende dall'enzima considerato e la con la concentrazione del substrato (che viene considerato la concentrazione iniziale del composto e non viene calcolato l'enzima perché la sua concentrazione è molto minore rispetto a quello del substrato e quindi irrilevante).

Ricordiamo che minore sarà il valore di K_m, maggiore sarà l'affinità tra E ed S e che un enzima che catalizza due substrati diversi avrà una diversa K_m (costante di velocità) per ogni substrato. Grazie alla costante di velocità, possiamo quindi anche notare, un dato enzima con quale substrato è più affine, sapendo che quello che avrà un K_m minore è più affine, e ci da anche l'informazione in quale concentrazione agisce l'enzima: se infatti agisce in concentrazioni di substrato elevate, il K_m sarà elevato, se agisce in concentrazioni basse, il K_m sarà basso. Il metodo migliore per calcolare V_max e K_m è attraverso l'equazione di Lineweaver-Burk, che non è nient'altro che il reciproco dell'equazione di Michaelis-Menten, facendoci notare però che questa può essere rappresentata come una retta:

1/V = (K_m/V_max) (1/[S]) + 1/V_max

Questa retta occupa il I e il II quadrante, dove all'aumentare della concentrazione del substrato diminuiscono i valori della retta, la migliore situazione si ha quando il substrato è compreso tra 0,5-5 K_m.

Inibizione enzimatica

L'inibizione enzimatica è l'effetto che provoca uno speciale agente, chiamato inibitore, che si lega all'enzima e che diminuisce la velocità di una reazione. L'inibizione può essere irreversibile, dove si formano legami covalenti e l'enzima lo denatura (ne cambiano la struttura proteica, con conseguente perdita originaria della sua funzione) e legami reversibile, dove si formano legami deboli e non covalenti. Delle inibizioni reversibili ne esistono 3 tipi:

• Inibizione competitiva dove aumenta la costante di velocità (K_m) e non ha nessun effetto sulla velocità massima (V_max). L'inibitore competitivo compete con il substrato per legarsi con l'enzima, è molto simile infatti al substrato e si lega all'enzima senza reagire con esso. Parte dell'enzima quindi, viene sottratto al substrato visto che si è legato con l'inibitore e quindi diminuisce l'affinità col substrato, che farà aumentare la K_m ma inalterato V_max. Anche se la velocità massima rimane uguale, la reazione viene rallentata ugualmente, questo perché la reazione ci metterà più tempo per raggiungere la sua velocità massima.
• Inibizione non competitiva dove diminuisce la V_max e la K_m rimane inalterata. L'inibitore non competitivo si lega sia all'enzima che al complesso ES, e I (inibitore) non impedisce ad S di legarsi o viceversa, questo perché il loro legame avviene su siti differenti. Ci possono essere due casi: il primo è quando si lega prima il substrato all'enzima formando il complesso ES e poi l'inibitore si lega all'enzima, qui l'inibitore per legarsi all'enzima ne cambia la sua conformazione, cambiandone la sua conformazione cambia anche la conformazione (forma) del sito attivo a cui si lega il substrato, determinando la sua espulsione. L'altro caso avviene quando si lega prima l'inibitore all'enzima formando il complesso EI, avvenuta la formazione del legame e modificando la conformazione del sito attivo dell'inibitore per procedere alla formazione del loro legame, viene a cambiarsi anche il sito attivo del substrato e questo fa in modo che il substrato non può legarsi. Questi procedimenti fanno in modo che V_max diminuisce, ma non che diminuisca la K_m, da notare anche che la presenza di un inibitore non competitivo, fa sembrare una diminuzione di enzima all'interno della soluzione.
• Inibizione incompetitiva o acompetitiva dove sia V_max che K_m diminuiscono. L'inibitore incompetitivo o acompetitivo è una sostanza che si lega reversibilmente solo al complesso ES dando vita al complesso ESI, questo avviene per due cause: o che il substrato partecipa in maniera diretta a far legare l'inibitore all'enzima, oppure che il substrato legandosi all'enzima fa cambiare la conformazione al sito attivo dell'inibitore permettendogli di entrare. L'inibitore, formando quindi il complesso ESI, fa in modo che il substrato non può essere liberando, diminuendo sia la V_max e K_m e il suo effetto, aumenta all'aumentare della concentrazione del substrato.

pH e temperatura

Ogni enzima ha il suo valore ottimale di pH, dove questo valore di solito è compreso tra 6 e 8. I diagrammi delle attività enzimatiche possono essere rappresentate con una curva, dove queste possono essere curve a campane o curve quasi piatte. A valori estremi di pH, può succedere la denaturazione dell'enzima, esso influenza anche la ionizzazione dei gruppi COOH e NH₂ importanti per l'attività catalitica (enzimatica).

La temperatura è molto importante per la velocità dei processi enzimatici, infatti questa aumenta alla temperatura tra 0° e i 35°, perché si aumenta l'energia cinetica delle molecole e può modificare la conformazione dell'enzima, aumentando la sua costante di velocità (K_m) e la sua V_max. Enzimi diversi, ma della stessa famiglia possono rispondere in modo diverso agli enzimi. A temperature inferiori a 0° e superiori ai 35-40°, c'è la denaturazione dell'enzima o la sua inattivazione. Le temperature ottimali dipendono dall'habitat delle piante, infatti per le piante alpine e artiche hanno enzimi fotosintetici che hanno la loro temperatura ottimale ai 10-15°, mentre quella dei climi temperati, ha la sua temperatura ottimale ai 30°.

Isozimi

Gli enzimi fotosintetici sono chiamati anche isozimi, infatti gli isozimi sono enzimi che agiscono sullo stesso substrato e sono in grado di convertirlo nello stesso prodotto, soltanto che agiscono a livelli di temperatura, pH e altre proprietà chimiche-fisiche. Questi sono molto simili fra di loro ma hanno piccole differenze nelle sequenze degli amminoacidi. Queste differenze possono essere state codificate a livello genetico o a livello di traduzione e una pianta che ha isozimi differenti è in grado di far avvenire la stessa reazione, avendo gli stessi prodotti, con condizioni ambientali diverse.