Biochimica per scienze biologiche

Biochimica

Introduzione

Martedì 1 ottobre 2019 13.45

Organismi viventi = sistemi ordinati, nonostante siano spesso complessi:

• Unicità chimica
• Complessità e organizzazione gerarchica
• Metabolismo
• Reazione all'ambiente
• Sviluppo = evoluzione
• Possesso di un programma genetico = informazione che deve essere decodificata per definire strutture e funzionamento del sistema
• Riproduzione

Proprietà dei sistemi biologici

Funzioni

Ruolo funzionale di una struttura biologica all'interno dell'organismo di appartenenza. Funzionalità = esistere in funzione di qualcos'altro. Le proteine sono gli operai dei sistemi viventi.

Interazioni

Tra componenti di un sistema biologico o con l'esterno in vista di una funzione. La funzione è garantita dall'interazione.

Unitarietà

I fenomeni chiave che consentono la vita e la riproduzione degli esseri viventi presentano caratteristiche simili o identiche nei vari esseri viventi. Building blocks delle proteine = amminoacidi.

Le proteine differiscono solo per struttura e funzione, gli amminoacidi sono sempre gli stessi. La cellula è un sistema isotermo di molecole in grado di autoassemblarsi e autoperpetuarsi, che estrae energia libera e materiali grezzi dal suo ambiente. Al suo interno avvengono reazioni chimiche regolate da catalizzatori che essa produce. Le reazioni però non sono spontanee, in quanto altrimenti il processo non sarebbe governabile e regolabile. Le reazioni possono essere di natura chimica (modificazioni) o fisica (reversibili).

Questi processi sono controllati da molecole biologiche aventi natura catalitica (enzimi). L'unico modo per controllare opportunamente un processo tramite reazioni chimiche è catalizzare e di conseguenza controllare un processo. La cellula mantiene il suo stato stazionario di non equilibrio attraverso il massimo risparmio energetico. Quando un sistema biologico raggiunge l'equilibrio c'è morte, perché non c'è più attività.

Autoreplicazione = consentita da un sistema che contiene tutta l'informazione dell'intero sistema. L'informazione viene codificata in modo lineare ma deve essere sufficiente a codificare per la formazione di molecole tridimensionali. La struttura tridimensionale delle biomolecole è garantita da interazioni non covalenti reversibili che agiscono in modo cooperativo (= determinato dall'interazione simultanea di più elementi della specie che interagisce). Non sempre è un processo positivo.

Questo permette di assemblare o disassemblare componenti. Positiva = affinità maggiore della somma dei contributi dei singoli componenti. Negativa = affinità minore. Nulla = affinità pari alla somma dei singoli componenti.

Elementi che garantiscono le interazioni

Alcuni gruppi funzionali (possono formare anche legami covalenti reversibili come il ponte disolfuro, che si rompe facilmente in un ambiente riducente).

Proprietà chimico-fisiche delle soluzioni acquose

Proprietà dell'acqua: Ossigeno che lega due atomi di idrogeno in maniera non lineare. L'ossigeno ha numero atomico 8. Ha un orbitale p pieno, gli altri due semivuoti. Per una maggiore stabilità avviene ibridizzazione, con la formazione di tre orbitali ibridi sp³. Geometria tetraedrica irregolare con angoli di 104.5 per via del maggiore ingombro sterico che aumenta la repulsione.

Momento dipolare

E = carica D = distanza tra i baricentri delle cariche.

Proprietà

L'acqua, a differenza degli altri solventi, ha una densità maggiore allo stato liquido rispetto allo stato solido in quanto allo stato solido si stabilisce una vera e propria fitta rete in cui le distanze tra molecole sono determinate dalla lunghezza del legame a idrogeno.

L'acqua allo stato cristallino (cioè il ghiaccio) ha una struttura tetracoordinata. Al centro del tetraedro si trova l'atomo di ossigeno, mentre due dei vertici sono occupati da atomi di idrogeno che possono fungere da donatori di legame idrogeno, e gli altri due vertici sono occupati ciascuno da un doppietto elettronico non coinvolto in legame. Tali doppietti possono fungere da accettori di legame idrogeno.

Mentre allo stato liquido il movimento delle molecole permette una densità maggiore. Tuttavia ci sono Flickering clusters = sorte di isole nelle quali per un certo tempo si stabiliscono interazioni stabili tra molecole d'acqua (legami a idrogeno). Sono separati da molecole d'acqua non legate e la conseguenza è che le molecole non sono totalmente libere di muoversi.

Effetto idrofobico

Fenomeno per cui un composto apolare minimizza la superficie di contatto con un solvente (esempio olio-acqua). Una delle misure dell'idrofobicità è andare a misurare l'angolo di contatto tra le due superfici.

• Molecola idrofilica (polare) = dotata di elevato momento dipolare
• Molecola idrofobica (apolare) = dotata di momento dipolare piccolo o nullo
• Anfifilico (anfipatico) = dotato di porzioni idrofiliche e idrofobiche

Il processo per cui due molecole idrofobiche in acqua si legano tra di loro ha natura entropica. Infatti, se due molecole apolari si associano tra loro, la loro superficie apolare esposta si riduce, di conseguenza si riduce il numero di molecole d'acqua che si trovava in "ordine". Un aumento del disordine corrisponde a un aumento di entropia nel sistema, che porta quindi la reazione alla spontaneità. La spinta entropica ci dice che il sistema preferisce organizzarsi in questo modo per prevenire un'eccessiva quantità di disordine.

Le molecole d'acqua hanno la possibilità di muoversi liberamente, dunque di passare liberamente da un legame all'altro con le stesse molecole. C'è un contributo entropico e uno entalpico. Un numero N di molecole d'acqua indica N gradi di disordine possibili. Le molecole d'acqua non potendo interagire con le code sono bloccate e legate alle molecole adiacenti di acqua accanto a cui si trovano legate in un dato istante. Se in questo istante ci sono N molecole legate forzatamente tra loro attorno a una coda idrofobica si perdono N gradi di libertà/disordine. Se ci sono 3 molecole idrofobiche immerse in un liquido, il sistema perde tre volte i suoi gradi di libertà iniziali. Inoltre, se le molecole si avvicinano, vengono persi altri gradi di libertà, ma si guadagna un certo numero di questi, ovvero quelli che si trovavano su uno/due dei lati di ciascuna molecola in quanto le molecole iniziano a interagire tra loro.

Micelle = nessuna porzione idrofobica è a contatto con l'acqua.

Le interazioni molecolari sono possibili grazie a:

• Cooperatività
• Specificità = selettività, il legame deve avvenire in una direzione specifica, anche per minimizzare il dispendio energetico
• Complessità molecolare
• Reversibilità

L-alfa-amminoacidi

Polimeri ottenuti dall'assemblaggio di un repertorio di 20 L-alfa-amminoacidi naturali.

Quasi tutti gli amminoacidi, eccetto la glicina (che ha due sostituenti identici H), portano sul carbonio alfa la catena laterale, ovvero ciò che differenzia tra loro i vari amminoacidi. Il carbonio alfa della catena è un centro stereogenico, ed è chirale. Essendo un centro stereogenico, possiamo avere una forma D e una forma L. Noi abbiamo a che fare solo con amminoacidi L. La carica complessiva, a prescindere dalla forma dell'amminoacido, è neutra.

La forma zwitterionica è la più comune in condizioni neutre. Questo perché gli amminoacidi saranno più propensi a stringere legami (per esempio con acqua). Infatti, porzioni cariche (positivamente o negativamente) si legano a molecole polari molto più facilmente. Sono strutture molto versatili.

Assemblaggio lineare = ogni amminoacido è legato al successivo e al precedente tramite un legame ammidico tra gruppo amminico e gruppo carbossilico. È una reazione di condensazione. Si formano poliammidi o polipeptidi.

Equazione di Henderson-Hasselbalch

Costante di equilibrio acido/base. Consente, conoscendo la pKa, di sapere la concentrazione delle specie dissociate.

Curva di dissociazione = variazione del pH in rapporto alle moli di base per moli di acido. Si calcola aggiungendo una base molto forte a una soluzione acida. Acido formico e ammoniaca.

• Man mano che si aggiungono moli di un acido avviene una dissociazione, fino a quando tutte le moli di acido saranno dissociate. L'acido formico reagisce liberando protoni in numero di moli pari a quelle di base che vengono aggiunte. Si osservano valori di pH più elevati, questo perché le pKa sono diverse. Titolare = neutralizzare. Il pH in una titolazione dipende dalle moli di base, mentre nell'equazione di Henderson-Hasselbalch il pH dipende dalla concentrazione di H⁺.

Catena laterale non dissociabile

Nella glicina lo ione ammonio è più acido rispetto al corrispettivo catione nella metilammina.

pI = flesso ottenuto con l'aggiunta di un equivalente di base. Aggiungendo mano a mano moli si ottiene:

1. Forma zwitterionica = molecola neutra
2. Forma basica = carica negativa

Punto isoelettrico = passaggio da carica -1 a carica +1 (punto che corrisponde al punto di aggiunta di un equivalente). Per gli amminoacidi che non hanno catena laterale o non l'hanno dissociabile (glicina), il punto isoelettrico coincide con il valore di pH in cui la molecola ha carica netta = 0 ed è dato dalla media tra i due valori di pKa che precedono e seguono la comparsa della forma isoelettrica nel corso della titolazione. Da ciò deriva la definizione di potere tampone, vale a dire la capacità di mantenere il pH costante o far sì che vari molto meno rispetto all'equazione di Henderson-Hasselbalch. Graficamente, minore è l'ampiezza della curva, maggiore sarà il suo potere tampone.

Esercizio

Calcolare la carica del gruppo imidazolico a pH 7.2.1. Applicare l'equazione di Henderson-Hasselbalch.

Catena polipeptidica

Segue che una catena polipeptidica è determinata dai legami torsionali dei carboni alfa, i quali sono dipendenti dalla catena laterale. A ogni coppia di angoli torsionali è associata una coppia di amminoacidi.

Numero di ossidazione

Carica che un atomo è in grado di possedere se vengono tolti gli elettroni di valenza (se venissero assegnati all'atomo più elettronegativo).

Proteina globulare

Una proteina globulare solubile (a eccezione di una di membrana) presenterà i residui idrofobici rivolti verso l'interno, mentre quelli idrofilici rivolti verso l'esterno (saranno in quantità maggiore, in modo da "coprire" tutti quelli idrofobici).

Protein folding

La struttura di una proteina è determinata dalla conformazione spaziale dei suoi componenti. Il processo che porta alla formazione di determinate strutture tridimensionali si chiama folding = ripiegamento. Si parla di strutture secondarie e terziarie, la quaternaria si forma in seguito a interazioni tra catene.

1. Sequenza degli amminoacidi senza interazione (casuale) = UNFOLDED.
2. Iniziano a stabilirsi interazione intramolecolari = struttura parzialmente ripiegata.
3. Le interazioni aumentano, così aumenta anche il ripiegamento.
4. Struttura più ripiegata = STRUTTURA NATIVA. Essa corrisponde allo stato di minore energia libera tra le conformazioni possibili della proteina. Ne esiste una e una sola. È la più stabile in condizioni fisiologiche.

Il processo di denaturazione è opposto al folding. Da forma nativa si srotola fino ad arrivare alla forma di RANDOM COIL = forma filamentosa senza proprietà biologiche. Non ha vincoli conformazionali, dunque può assumere tutte le conformazioni teoricamente possibili. L'informazione sul ripiegamento è intrinseca nella proteina. Il DNA mantiene in sé tutte le informazioni necessarie.

Tra forma nativa e random coil si instaura un equilibrio, che prevede la possibilità di interconvertire una forma nell'altra. Il passaggio da forma denaturata a nativa avviene in seguito/contemporanea a sintesi proteica a opera dei ribosomi grazie a fattori co-traduzionali, anche se l'informazione sul ripiegamento è già intrinseca nella proteina. Il passaggio contrario avviene in seguito a denaturazione per shock termico.

Unboiling an egg (esperimento di Perutz)

Per dimostrare che tutte le proteine possiedono in se stesse tutta l'informazione per ripiegarsi correttamente. Il bianco dell'uovo (ovalbumina) forma un gel (si ottiene per aumento della temperatura). L'albumina si srotola e le catene polipeptidiche espongono anche le porzioni idrofobiche (è una proteina globulare). Non riuscendo a riarrotolarsi per via dell'energia cinetica troppo elevata, formano delle interazioni intermolecolari. Da globulari le ovalbumine diventano filamentose e formano un vero e proprio reticolo che intrappola acqua, cercando di minimizzare il contatto con il liquido.

Può anche avvenire flocculazione = In seguito a denaturazione ed esposizione di molecole idrofobiche, esse si aggregano in masse di proteina insolubile che si depositano sul fondo del recipiente. Entrambi questi fenomeni testimoniano la perdita della solubilità che acquisisce una proteina denaturata. Variando il pH con piccole aggiunte di acido per poi riaggiungere a poco a poco una base, la proteina riesce a rompere le interazioni e a poco a poco tornare alla forma nativa (viene riportato il pH alla condizione fisiologica).

A pH molto acidi o molto basici la proteina torna a essere solubile (la carica aumenta), ma i vari aggregati idrofobici acquistano tutti la stessa carica, quindi tornano in soluzione ma per via dell'effetto repulsivo diventano molecole sparse alla forma denaturata. Gradualmente allora viene aggiunta di alcali (metalli che in acqua hanno comportamento basico) per ristabilire le condizioni fisiologiche e far tornare una proteina allo stato nativo.

Tutte le proteine, se sottoposte ad opportune condizioni, sono in grado di tornare alla loro forma nativa. Questo perché l'informazione sul loro ripiegamento è inscritta nella struttura primaria. La rinaturazione è un processo però molto lungo.

Urea

È in grado di aumentare la solubilità delle porzioni apolari della proteina, che dunque non precipiteranno ma rimarranno all'interno della soluzione come proteine denaturate. 2-mercaptoetanolo = riduce i ponti disolfuro. L'aggiunta di una miscela di tali composti portava alla totale denaturazione della proteina. Successivamente questi vengono rimossi dalla proteina mediante dialisi.

Dialisi

Separare con una membrana semipermeabile due sostanze diverse tra loro per garantire il passaggio solo di determinate sostanze (piccole molecole). Le proteine essendo grandi (ordine dei kilodalton) riescono facilmente ad essere separate e i due composti a fuoriuscire.

Conclusioni sull'esperimento

La maggiore conclusione di questo esperimento è che la sequenza genica determina la sequenza amminoacidica, la quale determina la struttura tridimensionale, la quale determina la funzione di una proteina. Non tutte le proteine denaturate in vitro sono in grado autonomamente di tornare alla loro forma nativa. Esistono degli stati di ripiegamento che pur non essendo la forma nativa sono a contenuto energetico molto basso, quindi bloccano il ripiegamento. Per continuare il ripiegamento ci sono degli enzimi che accelerano il ripiegamento e prevengono l'aggregazione delle proteine senza però istruirle riguardo alla loro conformazione nativa = chaperoni molecolari.

Importanza dei meccanismi di ripiegamento

• Biotecnologie industriali = produzione di proteine eterologhe (produrre proteine umane all'interno di cellule di altri organismi mediante l'uso di DNA ricombinante). Le cellule vengono trasformate grazie a un opportuno vettore che contiene il gene codificante per la proteina di interesse. Spesso però proteine "estranee" vengono rifiutate e finiscono nel citosol all'interno di corpi di inclusione in modo da non arrecare fastidio alle attività biologiche dell'organismo stesso essendo estranee e sovraespresse. Normalmente questi corpi di inclusione, essendo depositi di scarto, si trovano proteine in forma denaturata. Bisogna farla ritornare alla forma nativa.
• Capire le basi molecolari di alcune patologie causate da scorretto folding (= misfolding) per esempio l'Alzheimer.

Il progressivo ripiegamento delle proteine avviene sotto spinta termodinamica e porta alla formazione della struttura più stabile (con il minor numero di energia libera). La proteina per raggiungere la sua forma nativa segue delle vie preferenziali e non tutte quelle possibili, perché altrimenti impiegherebbe un numero grandissimo di anni = paradosso di Levinthal. Non tutte le conformazioni sono permesse e non tutte hanno la stessa probabilità. Deve esserci un processo mosso da un processo sequenziale. I primi stadi del protein folding (passaggio a struttura secondaria) si svolgono in tempi brevi, in quanto le sequenze che li generano hanno una forte tendenza intrinseca a ripiegarsi in questo modo. Questa intrinsecità diminuisce i gradi di libertà nel ripiegamento, favorendo una direzione preferenziale nel ripiegamento.