Biochimica per le Biotecnologie

Biochimica per le biotecnologie

Informazioni del corso

Prof. Vanoni, u3, 5^o piano 5015
Data: 02/10/14
Modalità d'esame: Corso di 8 cfu, orale.

Programma

• Trasduzione del segnale, definizione elementi che ne fanno parte, esempi in campo farmacologico
• Processamento e secrezione proteine
• Approcci di mutagenesi di proteine
• Enzimi, regolazione, aspetti generali uso industriale
• Studio interazione proteina-proteina (proteine intrinsecamente disordinate)
• Tecnologie omiche
• System biology

Trasduzione del segnale

Qualunque cellula è un sistema aperto da un punto di vista termodinamico. Un sistema aperto è un sistema che scambia energia e materia con l'esterno, mentre un sistema chiuso invece non scambia nulla. La cellula quindi scambia energia e materia con l'esterno, che sia uno zucchero che assume o un acido che secernere o anche calore che emana, questo equivale a scambiare energia e materia con l'esterno proprio come un sistema aperto dal punto di vista termodinamico.

L'esterno per una cellula, è per esempio per un batterio che vive sulla terra allora il suo esterno sarà la terra, per un batterio che vive nell'intestino di un animale il suo esterno sarà l'intestino e la mucosa dell'intestino. Per organismi pluricellulari l'esterno è ciò che è esterno al complesso pluricellulare, se consideriamo le cellule di fegato il loro esterno è ciò che circonda il fegato stesso. E in questo caso lo scambio avviene tra le cellule del fegato e i vasi sanguigni.

Ciò che scambiano sono nutrienti come gli zuccheri o scarti come l'anidride carbonica, ma possono anche ricevere, trasportati dal sangue, segnali chimici prodotti da altre cellule, anche molto distanti tra loro, e questi segnali sono chiamati ormoni.

In generale quindi le cellule devono crescere e quindi assumere nutrienti ma devono anche essere informate di ciò che accade intorno a loro, per esempio con gli ormoni per organismi pluricellulari. Questo vale sia per organismi unicellulari che per organismi pluricellulari.

Questi segnali quindi sono importanti per far sì che la cellula risponda a diversi tipi di situazioni e dietro ad ogni segnale c'è un sistema che li interpreti. I modi in cui la cellula interpreta e risponde ai segnali sono vari e non univoci, ovvero può rispondere e modulare più segnali contemporaneamente. Le risposte sono ad esempio: alterazione superficie cellulare, modifica affinità enzimatiche, spostamento di sostanze tra compartimenti cellulari o tra cellule e cellule in organismi superiori, rimodellamento della sua forma, migrazione o morte.

Comunicazione tra le cellule

Le cellule devono comunicare tra loro e possono comunicare con giunzioni cellula-cellula che oltre a trasportare sostanze trasporta anche informazioni. Ma possono comunicare anche tramite ormoni per comunicare ad ampie distanze, tali ormoni vengono trasportati dal sistema circolatorio dalla cellula che lo secerne sino alla cellula che deve ricevere il bersaglio.

Segnalazioni tramite contatto:

• Tramite giunzioni cellula-cellula: gap junction (cellule animali), plasmodesma (cellula vegetale)
• Contatto con cellula: la cellula si sposta ed arriva a contatto con altra cellula, ma non si riconoscono perché sono vicine ma perché vi sono molecole specifiche su ambedue le membrane delle cellule che sono in grado di interagire e di creare un complesso.

Tipi di segnalazione

La molecola che riceve il segnale si chiama recettore, qualunque molecola che porta il segnale si chiama ligando, in generale li distinguo perché il recettore è immerso nella membrana mentre il ligando è libero in soluzione.

• Paracrina: cellule secernono segnali chimici che hanno come bersaglio cellule vicine che si legano ad appositi recettori.
• Endocrina: una cellula, detta cellula endocrina, secerne una molecola, ormone, che verrà secreto nel sistema circolatorio e avrà come bersaglio una cellula che potrà anche essere molto lontana dalla cellula secreta.
• Autocrina: la cellula secerne segnali chimici che si legano a recettori specifici sulla sua membrana e porta ad una risposta della cellula stessa che ha secreto tali segnali.

Stadi della segnalazione

• Recezione del segnale
• Trasduzione del segnale
• Risposta del segnale

Vi sono diverse molecole chimiche che sono in grado di funzionare come molecole segnale, per esempio: proteine, amminoacidi, nucleotidi, steroidi, retinoidi, gas, solidi. Ma in tutti i casi la specificità della risposta dipende da complementarietà, che deve essere alta e specifica, tra la molecola segnale e il recettore.

Il primo evento che accade appena il segnale si lega al recettore è quasi sempre un cambiamento conformazionale del recettore stesso. Il recettore è una proteina trasmembrana, il più delle volte, con un dominio esterno alla cellula e uno interno, questi vari domini possono trovarsi in conformazioni prestabilite, e generalmente abbiamo le conformazioni: in presenza del segnale e in assenza del segnale. E distinguiamo quindi uno stato acceso e uno stato spento che possiamo associare, stato spento al recettore in assenza del segnale e lo stato acceso al recettore in presenza del segnale.

Molti segnali fanno fatica ad attraversare la membrana cellulare, altri riescono tranquillamente quindi abbiamo recettori intermembrana e recettori all'interno della cellula. In generale, quindi la trasduzione del segnale inizia con il recettore che interagisce con la molecola segnale che innesca generalmente un cambiamento conformazionale del recettore e quindi avvengono una sequenza di passaggi, chiamati cascata di traduzione del segnale, dove ogni passaggio porta ad un altro passaggio. Ogni passaggio è collegato l'un l'altro. Non è sempre successivo e non si può saltare un passaggio perché la cascata sia lineare, ma può ramificarsi. Ma indipendentemente dalla lunghezza della cascata il risultato è sempre lo stesso: una risposta da parte della cellula al segnale ricevuto.

Risposte ai segnali

• Cambiamento potenziale elettrico
• Cambiamento permeabilità parte/membrana
• Cambiamento metabolismo
• Cambiare secrezione
• Cambiamento velocità riproduzione
• Cambiamento velocità di spostamento
• Morte cellulare

Tipi di risposte

Esistono 2 tipi di risposte:

• Risposte veloci: agiscono in una scala di tempi di secondi o frazioni di secondi massimo minuti, ed hanno a che fare con l'attività o la funzione di proteine preesistenti.
• Risposte lente: agiscono su pathway e quindi agiscono su intermedi che darà quindi una risposta lenta.

La cellula può ricevere ambedue i tipi di segnali e riesce ad integrare i diversi tipi di segnale e a rispondere a tutti quanti i segnali. Il segnale non può essere eterno, ovvero in linea di massima i segnali sono prodotti per un tempo limitato e legano il recettore per un tot di tempo.

I recettori liberi nel citoplasma, chiamati anche recettori nucleari dato che sono spesso situati nel nucleo, sono proteine che sono in grado di interagire con quei segnali che riescono a passare la membrana, ovvero i segnali di tipo lipofilo come ad esempio gli ormoni steroidei e i retinoidi. Questi tipi di recettori sono generalmente attivatori trascrizionali qualora attivati ed essere spostati nel nucleo.

Recettori transmembrana

La maggior parte delle proteine segnale sono solubili in acqua e quindi fanno fatica ad attraversare la membrana. Quindi il recettore che deve "sentire" queste molecole si trova in parte all'esterno della cellula, e per fare ciò c'è bisogno che il recettore sia una molecola avente una parte all'esterno della cellula e una parte che sia all'interno della cellula. Quindi generalmente un recettore, è un recettore trasmembrana, avente 3 domini: uno extracellulare, uno trasmembrana e uno intracellulare.

Il dominio extracellulare avrà principalmente il compito di legare il recettore e quindi è il primissimo approccio della cellula con il messaggio esterno. Il dominio intracellulare ha il compito di trasdurre il segnale portato dalla molecola segnale e quindi di scatenare una cascata del segnale, ed infine il dominio trasmembrana ha il compito di collegare in modo attivo, cioè deve convogliare l'informazione da un dominio ad un altro, i due domini appena citati.

Diversi tipi di recettori transmembrana

• Recettori associati a canali ionici: dove il primo messaggero si lega al recettore che provoca un cambiamento conformazionale che consente l'alterazione di una parte di una proteina il cui scopo è quello di far passare degli ioni (un canale ionico) all'interno o all'esterno della cellula. Il canale ionico lo possiamo trovare in 2 conformazioni, aperto o chiuso, il legame del primo messaggero al ligando consente di cambiare conformazione generalmente da chiuso ad aperto ma non è detto. Questo cambiamento strutturale consente generalmente il passaggio di ioni che consente un cambiamento di permeabilità e di potenziale di membrana che scatena in seguito una risposta a valle nella trasduzione del segnale generando una reazione da parte della cellula.
• Recettori legati agli enzimi: il legame con il primo recettore genera un cambiamento conformazionale nel recettore che fa partire la trasduzione del segnale a valle, e possiamo avere recettori con attività enzimatica intrinseca come ad esempio una attività chinasica.
• Recettori tirosin chinasici: in questo caso il legame del primo messaggero comporta il legame di una chinasi che grazie alla sua attività fosforilasica, fosforila una proteina o una molecola organica che comporterà una risposta cellulare a valle.
• Recettori associati a proteine G: le proteine G sono delle sorte di interruttori molecolari, le particolari proteine G associate ai recettori si chiamano proteine G trimeriche perché sono costituite da tre subunità diverse (alfa, beta e gamma), l'attivazione di tale proteina G porta a cascata di una proteina effettrice che produce una specifica risposta cellulare.

Schematicamente: i recettori legano la proteina segnale, esso si attiva, a valle del recettore attivato troviamo una serie di molecole (numero variabile). È possibile anche che esista una proteina scaffold (impalcatura) che è in grado di legare contemporaneamente tutti o una parte degli elementi di trasduzione del segnale che stanno a valle del recettore, in modo che tutte le proteine siano vicine e possano interagire tra loro più facilmente e velocemente.

Dopo che il segnale è stato trasdotto avviene anche un passaggio fondamentale in tutti gli eventi di trasduzione del segnale ovvero che il segnale viene amplificato. Questo consente di rispondere a segnali anche bassi in maniera appropriata.

Caratteristiche della via della trasduzione del segnale

• Specificità: ogni segnale è specifico per un recettore complementare, esattamente come gli enzimi per i loro substrati. Ed esattamente come loro anche in questo caso ci può essere l'interazione chiave serratura ma non solo.
• Amplificazione: quando il segnale attiva un enzima, questo può attivare altri enzimi (anche diverse copie dello stesso enzima) che a loro volta attiveranno altri enzimi o molecole amplificando il segnale. (Cascata del segnale)
• Desensibilizzazione/adattamento: un segnale deve essere efficace, controllato e non irreversibile e deve poter essere bloccato. Deve sostanzialmente avere una buona amplificazione (rapido) ma soprattutto deve poter tornare allo stato basale in breve tempo, senza segnale.
• Integrazione: quando due o più segnali hanno effetti opposti su una certa caratteristica, come la concentrazione di un secondo messaggero, quello che accade dal punto di vista regolatorio dipende da se è più forte il segnale inibitorio o quello attivatorio, cioè ci deve essere un sistema che permetta di dare una risposta integrale ai due segnali.

Elementi fondamentali nella trasduzione del segnale

Un elemento importante nei sistemi di trasduzione del segnale sono quegli elementi denominati switch molecolari, sono classi di molecole il cui comportamento biochimico oscilla tra due stati, uno stato attivo e uno stato inattivo.

Classi di proteine

• La proteina è nello stato OFF: in presenza del segnale questa viene fosforilata da una kinasi consumando ATP, e questo evento (la fosforilazione) attiva la proteina. Per tornare allo stato OFF la proteina deve essere defosforilata e questo avviene grazie ad una fosfatasi. Ambedue i processi, sia quello di attivazione che di spegnimento, sono controllati e regolati da enzimi (kinasi e fosfatasi).
• La proteina è associata ad un nucleotide, generalmente GDP o GTP, troviamo la proteina in stato inattivo quando essa lega il GDP mentre quando lega GTP è in uno stato attivo. Essa può passare da stato attivo a inattivo con una sostituzione nucleotidica, ovvero il GDP viene sostituito con GTP, mentre il passaggio da stato attivo ad inattivo avviene grazie all'idrolisi del GTP a GDP liberando un fosfato.

Attivazione e legame dei recettori

I recettori possono essere attivati dal legame con molecole segnale ma non solo anche dal cambiamento della concentrazione di metaboliti quali ossigeno, nutrienti, ecc., ma anche da agenti fisici come il calore, il contatto o la luce. Per alcuni recettori il solo legame con la molecola segnale non è l'evento attivante, un esempio è il legame dell'ormone della crescita con il suo recettore, esso infatti dopo aver legato il suo recettore, ed aver formato così il complesso recettore-ormone, dimerizza (con un altro recettore non con un altro complesso recettore-ormone) e in questo complesso il recettore è in fase attiva.

Il legame del ligando con il recettore dipende in larga misura da legami deboli e non covalenti come i legami idrofobici, legami idrogeno e interazioni di van der Waals e dalla complementarietà tra le superfici di interazione.

Come avviene il legame del ligando con il recettore? Essendo una reazione chimica i cui elementi sono il recettore, il ligando e il complesso recettore-ligando che si viene a formare, possiamo studiarne matematicamente e biochimicamente l'andamento essendo essa regolata da una costante di velocità per cui la formazione del complesso recettore-ligando dipenderà da una costante di velocità detta k_on mentre la dissociazione del complesso sarà controllata da una costante di velocità di dissociazione detta k_off.

All'equilibrio avremo dunque che \([RL]\) = \(\frac{[R][L]}{K_d}\) dove K_d è la costante di dissociazione, \([R]\) è la concentrazione del Recettore ed \([L]\) è la concentrazione del Ligando ed \([RL]\) è la concentrazione del complesso.

La K_d ci indica la tendenza del complesso recettore-ligando a stare unito, più è alta la K_d meno legati saranno recettore e ligando mentre più è piccola K_d più saldamente resteranno legati recettore-ligando.

Matematicamente parlando possiamo dire che K_d è inversamente proporzionale alla stabilità del complesso recettore-ligando.

Da questo grafico denotiamo che la risposta fisiologica segue più o meno la stessa cinetica ma con valori diversi rispetto alla cinetica di legame del ligando al recettore. Questo vuol dire che la risposta fisiologica avviene ancor prima che tutti i recettori siano saturati dal ligando. Questo ha come conseguenza che bastano poche molecole di segnale per generare una risposta fisiologica, e quindi è più facile mantenere reversibile tale risposta.

Molecole che influenzano la trasduzione del segnale

Molecole che legano recettori generano trasduzione del segnale e molte vie di trasduzione del segnale sono implicati in fenomeni rilevanti per la salute e quindi farmacologicamente parlando è utile poter modulare queste vie con apposite molecole.

Possiamo quindi creare molecole che leghino tali recettori solo che si presentano due tipi di molecole in grado di legarsi al recettore:

• Agonisti: molecola induce lo stesso effetto del ligando naturale, ovvero se il ligando attivava allora anche la mia molecola attiva.
• Antagonisti: molecole che inducono effetto opposto al ligando naturale.

Organizzazione dei recettori

Inizialmente si pensava che i recettori fossero distribuiti uniformemente su tutta la membrana ma si è visto che non è così, sono organizzati in clusters. Ciò vuol dire che la membrana può avere delle zone delimitate, dipende ovviamente di quale organismo e in quali condizioni è tale organismo.

Recettori associati a canali ionici

I recettori associati ai canali ionici sono recettori per esempio per il glutammato, per la serotonina o per l'acetilcolina, sono come una sorta di cancello che si può aprire o chiudere quando il recettore interagisce con il primo messaggero. Sono presenti principalmente nei contatti sinaptici rapidi e la loro azione è associata a un cambiamento del potenziale di membrana che è modulato da un piccolo numero di molecole come degli amminoacidi o molecole più o meno polari (sono il primo messaggero che si lega al recettore) che sono in grado di aprire in maniera transiente oppure di chiudere il canale associato al recettore.

Recettori con attività enzimatica intrinseca o associata

Sono ad esempio i recettori tirosin chinasici che fosforilano i gruppi tirosinici, sono generalmente implicati in fenomeni che hanno a che fare con la proliferazione e il differenziamento.