Biochimica per le Biotecnologie

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del mutante con quella del Wild Type. Que che si deduce da questa tabella è che in ogni caso l’interazione

K

D è maggiore allora l’interazione

con il recettore peggiorava dopo la sostituzione, se la K con il ligando è

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peggiorata (+K vuol dire + enzima per legare) in oltre questo esperimento ci consente, anche se abbiamo un

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peggioramento in prestazioni, di iniziare ad intuire quali residui sono importanti nell’hGH per l’interazione con il

suo recettore.

A questo puto ci si domanda quali residui sono davvero importanti e come interagiscono nella struttura

tridimensionale dell’hGH, se non si hanno dati sulla struttura 3D della proteina si possono ricavare poche

questo esperimento non si conosceva la struttura 3D dell’hGH ma si conosceva

informazioni. Quando si è fatto

la struttura 3D dell’ormone porcino e quindi lo si utilizzò come modello dell’hGH.

Quel che si vede dal modello di hGH partendo dalla struttura 3D del pGH è che vi sono 4 alfa eliche che

formano un bundle di alfa eliche, non sono presenti elementi beta ma vi sono parecchie anse. In oltre sono

mostrate le alfa eliche viste dall’alto con i residui splicitati. Ora con questo modello si possono identificare le

posizioni ipotetiche dei residui mutati che davano forti cambiamenti.

In questo grafico si possono vedere gli effetti delle varie sostituzioni in corrispondenza della posizione dei

residui in hGH, con questo grafico ci si domanda dove sono posizionati struturalmente i residui da 60 ad 80

(picco grigio) e quelli da 160 a 180 (picco bianco) e si nota che sono in 2 aree della proteina orientate nello

stesso verso che sono quindi potenzialmente in grado di interagire con il recettore. 4/11/14

Un effetto sul binding o una qualunque attività, può essere di tipo diretto o indiretto. Un effetto diretto è quando

la specifica mutazione fatta agiscono sulla parte della proteina che stiamo studiando, quindi nel nostro caso

che stiamo analizzando interazione proteina proteina si intende quella zona di proteina che interagisce con il

recettore. Un effetto indiretto è dato da mutazioni che possono indurre cambiamenti strutturali partendo da una

zona che non ha a che fare con la funzione studiata.

Per capire in quali casici troviamo dobbiamo avere informazioni sulla struttura della proteina in analisi che nel

caso affrontato è l’hGH. Dato che l’identità tra l’hGH e il pGH si aggira al 90% possiamo dire che

strutturalmente parlando sono molto simili quindi sulla base di ciò possiamo identificare la locazione spaziale

dei residui identificati con l’esperimento di homolog scanning. Si è visto quindi che i residui identificati che

sostanziale nell’attività dell’hGH erano residui collocati spazialmente nella stessa

portavano un cambiamento

zona, ma nella sequenza potevano essere anche molto distanti, e quei residui erano importanti per la

interazione proteina-recettore. il recettore dell’hGH si peresume che si leghi, otterremo la figura sovrastante

Se si disegnasse un cerchio dove

e se analizziamo i residui coperti dal cerchio noteremo chela maggior parte dei residui identificati con

l’homolog scanning si trovano all’interno del cerchio, ma sono presenti anche altri residui, quei residui non

risultano essere importanti per la forza di legame ma non vuol dire che non siano coinvolti con l’interazione con

il recettore.

Nel momento in cui voglio studiare l’interazione proteina proteina devo avvalermi di tutte le conoscenze

possibili sui siti in cui intervenire per risparmiare tempo.

Alanine-scanning

Un approccio che non si basa su conoscenze pregresse è quello che si chiama alanine-scanning ovvero

scansione ad alanine. Consiste nel mutagenizzare un certo numero di residui cambiando il codone codificante

per l’aa con il codone dell’alanina. L’alanina è l’aa preferito per questi tipi di studio perché non interferisce

come la glicina(un’H soltanto senza quindi effetti sterici). La scelta dei residui

troppo sulla struttrua terziaria

ricade per scelte storiche e non solo sui residui carichi, il perché dato dal fatto che è + probabile che i residui

carichi possono trovarsi maggiormente all’esterno rispetto ai residui idrofobici e in oltre sono in numero

inferiore rispetto agli altri residui. Una volta sostituiti i frammenti di DNA contenente i gruppi carichi con

frammenti di DNA con alanine, bisogna studiare i mutanti in base alla caratteristiche di interesse che nel nostro

caso sono l’interazione proteina proteina ovvero la K dell’hGH.

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I risultati sono praticamente gli stessi dell’Homolog scanning e che quindi tutti gli aa cambiati porducevano una

WT, e analizzando

proteina che aveva un effetto peggiore risspetto all’hGH le posizioni spaziali si nota che i

residui mutati ricadono nella stessa zona evidanziata dal precedente esperimento.

Quindi quei residui sono importanti per l’interazione dell’hGH con il suo recettore dal punto di visto della forza

di legame.

L’hGH interagisce con il recettore della prolattina perché sono molto simili, quel che si vuole fare è rendere il

legame tra l’hGH e il suo recettore migliore. Dai dati evidenziati sin’ora tutti i mutanti ottenuti evidenziavano

hGH che si legavano peccio del WT.

Dagli esperimenti pregressi sappiamo già alcuni residui importanti e anche quali residui in quella posizione

sfavoriscono il legame, ma non sappiamo l’effetto di tutti i residui quindi quel che si può far è una mutagenesi a

saturazione in tutte le possibili mutazioni, e sfruttando uno screening che ci permetta di identificare quali

mutanti si legano meglio al recettore del WT possiamo ottenere i mutanti di interesse.

Il metodo proposto ai tempi dai ricercatori era un metodo che permetteva di studiare in modo massivo

l’interazione propteina-proteina che prevedeva l’accoppiamento di una selezione allo studio. Questa tecnica si

chiama Phage display e consiste in :

Si parte da un fago filamentoso, il fago M13, che possiede un capside con delle proteine codificate dal suo

DNA. Si è visto che si poteva introdurre in esso delle varianti proteiche che però erano delle proteine ibride,

nello specifico la proteina 8 in cui sono presenti poche copie alle estremità del fago, può essere sostituita da

una proteina ibrida cioè la proteina 8 + un’altra proteina, nel nostro caso l’hGH, che si andrà a posizionare nel

capisde ottenendo un capide che mostra hGH.

Se io ho un fagemide, ovvero un DNA circolare con origine di replicazione fagica e non che si può comportare

sia da fago che da plasmide, ed infetto un batterio questo si comporta come plasmide ma se oltre al fagemide

introduco un fago helper che attiva le funzionalità fagiche del fagemide questo genererà dei fagi.

Quello mostrato in figura è il fagemide utilizzato nel phage display. Abbiamo le due origini, un gene per la

resistenza all’ampicilinna e poi abbiamo il costrutto gene hGH+ Gene proteina 8 e tra i due geni è presente

una tripletta stop TAG. Se il fagemide viene trascritto dall’origine normale la trascrizione si ferma allo stop se

invece viene trascritta dall’ori del fago la tripletta viene ignorata e si forma una proteina di frusione ovvero la

un’alanina) e può

proteina8+hGH. Nel coli sfruttato però presenta un tRNA che ignora il codone stop (inserisce

amplificare il fagemide.

A questo punto infetto i coli con diversi fagemidi con varie versioni di hGH in modo che i fagi prodotti

presentino sul capside l’hGH che era presente nel fagemide che aveva infettato il coli e quindi genero una gran

quantità di fagi con diverse versioni dell’hGH presentato.

A questo punto dobbiamo saggiare queste versioni ottenute cercando versioni aventi K migliori del WT

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facendo uno screening ottenendo così una quantità ipotetica di varianti che dovremmo saggiare ulteriormente

perché utilizzando hGH legati all fago otterremo dati non veritieri ed è per questo che è stato introdotto il

senza fago helper e senza il tRNA soppressore ottengo solo l’hGH che

codone stop. Infettando quindi un coli

posso usare per i saggi di screening. Grazie al fagemide posso poi conoscere la sequenza amminoacidica

delle varianti di hGH di interesse cioè con una K migliore del WT.

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La tecnica di Phage display segue il seguente schema:

 la proteina è legata al capisde

 il recettore è immobilizzato sulla capsula petri

 faccio interagire le proteine con i recettori e seleziono solo i fagi che hanno espresso proteine che si

sono legate al recettore.

 Ripeto la procedura con i fagi legati per controllo, e se alzo la T posso ottenere quelli che si legano

meglio.

 Sequenzio le variante legate.

Nel caso dell’hGH abbiamo qualcosa di + specifico perché sappiamo già che si lega al sua recettore, quel che

volevlamo era screenare varianti che si legavano meglio del WT e quindi quel che si fa è :

 Legiamo innazzitutto tutte le varianti e facciamo dei lavaggi in modo da eliminare già quelli che si

legano male.

 Stacco le proteine legate abbassando il pH per un brevissimo tempo.

 Ottengo tutti quei fagi che sono in grado di legarsi al recettore, quindi ci sono tutti i tipi di hGH si quelli

che si legano bene che si legano male o meglio del WT.

 Faccio rilegare le proteine e rilavo

 Faccio staccare le proteine in modo + blando sfruttando hGH WT, questa entrerà in competizione con

le varianti legate e se trova varianti legate peggio del WT si sostituirà ad esse.

 Quel che rimane legato sono varianti che si legano meglio del WT o che sono ugali ad esso.

 Stacco i fagemidi e faccio esprimere la proteina hGH non fusa e saggio la sua affinità ottenendo dati +

affidabili rispetto a quelli dell’hGH fusa.

Le varianti vengono generate in base a quel che si sà sulla proteina da saggiare, e quando è stato fatto il

che i residui di interesse erano situati sull’elica 4 in particolare i residui n°172,174,176

phage display si sapeva

e 178. Un’ulteriore zona di variabilità era nell’elica 1 in posizione 10,14,18 e 21. Quindi l’approccio degli

scenziati fu quella di fare mutagenesi localizzata su questi residui che avevano importanza e fecero

mutagenesi a cassetta. In ogni posizione fu effettua una mutazione a saturazione a 32 varianti. I risultati:

Dopo di ciò si sono saggiate le varianti ottenendeo:

Tutti i risultati aventi una K minore del WT in grassetto vuol dire che abbiamo ottenuto il mutante che ci

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interessa. Sono state fatte + library per abbassare la possibilità di perdere varianti ottimali quindi sono state

fatte 3 library per identificare meglio le varianti. 5/11/14

L’hGH oltre a legar