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Il vantaggio delle fosforilazioni è che sono processi reversibili e quindi sono uno strumento efficace per i rapidi

cambiamenti regolatori delle cellule.

Attività catalitica della GLICOGENO FOSFORILASI

La glicogeno fosforilasi è un enzima coinvolta nella degradazione del glicogeno, fosforilasi non è chinasi

ovvero chinasi mette gruppo fosforico la fosforilasi lisa con gruppi fosforici. La fosforilasi effettua una fosforolisi

ad una idrolisi ma non viene usata l’acqua per rompere il legame ma un gruppo fosfato.

che è equivalente

La glicogeno fosforilasi quindi catalizza per la idrolisi dei legami alfa 1-4 producendo un glucosio 1-P e un

glicogeno accorciato di una unità glicidica.

La glicogeno fosforilasi può essere presente in forme attive e inattive, la forma inattiva si chiama fosforilasi B

e la forma attiva si chiama fosforilasi A.

La fosforilasi B non è fosforilata ed è quindi inattiva, la fosforilasi B se fosforilata in un determinato punto si

attiva diventando fosforilasi A ma si può attivare anche in presenza di AMP che influisce come fattore

allosterico positivo.

Attivazione glicogeno fosforilasi:

1. 2 ormoni, epinefrina e glucagone, agiscono sui propri recettori transmembrana associati a proteine G e

generano come secondo messaggero cAMP, il glucagone ha recettori prevalentemente nel fegato

mentre l’epinefrina prevalentemente nei muscoli. Il glucagone è un ormone che segnala una condizione

le riserve di glicogeno ed è la controparte dell’insulina.

di digiuno e quindi una necessità di sfruttare

L’epinefrina è invece coinvolta in risposte rapide, viene chiamato l’ormone mordi e fuggi. Quello

comune tra questi due ormoni è il secondo messaggero, ovvero il cAMP, e quindi anche la sua

cascata.

L’cAMP attiva la proteina chinasi A che fosforila un enzima a valle chiamato

2. fosforilasi chinasi,

normalmente inattiva, che in presenza di calcio e fosforilata si attiva.

3. La fosforilasi chinasi attiva fosforila la glicogeno fosforilasi B che si attiva e diventa glicogeno fosforilasi

A

4. La glicogeno fosforilasi A inizia la degradazione del glicogeno, ma nella cellula la sintesi continua e in

teoria questo è un lavoro futile quindi bisogna bloccare la sintesi del glicogeno.

Interruzione sintesi glicogeno, la glicogeno sintasi:

La glicogeno sintasi può anche lei essere presente in forma attiva (glicogeno sintasi A) e in forma inattiva

(glicogeno sintasi B) ma al contrario della glicogeno fosforilasi la forma inattiva è fosforilata e la forma attiva

no. L’inattivazione della glicogeno sintasi è a carico della proteina chinasi A che oltre a fosforilare la fosforilasi

chinasi fosforila la glicogeno sintasi A inattivandola in glicogeno sintasi B

Attivazione sintesi glicogeno:

L’insulina si associa al suo recettore che attiva la

1. proteina fosfatasi 1

2. La glicogeno sintasi viene attivata grazie alla proteina fosfatasi 1 che la defosforila, ma

contemporaneamente vengono anche defosforilate la fosforilasi chinasi e la glicogeno fosforilasi A che

ambedue tornano ad essere inattive e la sintesi del glicogeno può ricominciare.

Effetti delle fosforilazioni su siti diversi della stessa proteina: porta all’attivazione in

Possiamo avere ridondanza, ovvero la fosforilazione in punti diversi di un substrato

egual modo. Abbiamo la somma ovvero che fosforilazioni in diversi punti generano una parziale attivazione

della proteine ma se le fosforilazioni sono presenti simultaneamente allora abbiamo una attivazione completa

C’è la

della proteina. sinergia ovvero la fosforilazione in siti differenti non attiva la proteina ma la presenza

contemporanea delle fosforilazioni attiva la proteina. In fine abbiamo l’antagonismo ovvero la fosforilazione in

un sito genera attivazione la fosforilazione in un secondo sito genera inattivazione.

Ciclo cellulare

Il ciclo cellulare fu introdotto quando guardando cellule che si dividevano al microscopio si potevano osservare

cambiamenti che avvenivano in modo ciclico, inizialmente questi cambiamenti erano solo morfologici ma con

studi successi si vide che non erano solo cambiamenti morfologici. Quindi il ciclo cellulare era strettamente

associato all’aumentare del numero delle cellule. A livello microscopico si potevano quindi osservare 2 eventi

importanti nel ciclo cellulare ed erano la mitosi e che successivamente alla mitosi le cellule si dividevano, la

divisione cellulare viene anche detta citodieresi.

La crescita a livello cellulare e non è inteso come la divisione cellulare e l’aumento del numero cellulare e ciò

comporta un assorbimento di sostanze con conseguente aumento della massa, ma anche con un aumento

sostanziale della massa la grandezza delle cellule non varia bensì aumenta il loro numero. Questo è dovuto

all’omeostasi della massa ovvero le cellule tendono a mantenere le loro dimensioni dividendosi.

Per mantenere l’omeostasi della massa la cellula effettua un particolare controllo sul DNA deve esattamente

raddoppiarlo prima di dividersi, ma questo controllo non è presente per le altre componenti che formano

La massa raddoppia sino a che la cellula si divide, quindi c’è un

biomassa (quindi proteine amminoacidi ecc.).

progressivo aumento della massa sino ad un punto “critico” dopo il quale la cellula si divide, in tutto questo

arco di tempo la cellula aumenta di massa, il DNA non segue questo profilo di accrescimento, raddoppia anche

lui ma in un particolare segmento di quell’arco temporale, e questa fase viene chiamata fase S ovvero sintesi.

Quindi abbiamo già una distinzione in 2 fasi ovvero la fase M(mitosi) e la fase S(sintesi). Tra la fase S e la fase

M c’è un certo intervallo di tempo e questo intervallo viene chiamato G2, G sta per Gap ovvero intervallo in

inglese e 2 vuol dire che in quella fase la cellula ha già il doppio del corredo cromosomico e che quindi la fase

S è già avvenuta. Le cellule neonate, ovvero quelle che hanno appena finito la fase M e si sono divise, non

iniziano la loro vita in fase S ma da quando sono nate a quando inizia la fase S c’è un intervallo di tempo

chiamato G1, dove G è sempre Gap e 1 vuol dire che hanno il corredo cromosomico non duplicato quindi la

fase S non è ancora iniziata.

Quindi il ciclo cellulare viene diviso in 4 fasi:

1. G1: da neonate a quando iniziano la sintesi del DNA

2. S: sintesi DNA

3. G2: dalla fine sintesi DNA ad inizio mitosi

4. M: mitosi e citodieresi

Tutte le cellule quindi seguono questo ciclo ma non è detto che una cellula si debba dividere per forza, c’è

quindi un momento nel ciclo cellulare dove la cellula si “chiede” se è necessario o meno se si deve dividere e

questa domanda se la pone in modo specifico nella fase G1. Se la chiede anche nelle altre fasi ma ha più

valenza nella G1.

La domanda sostanzialmente consiste nel valutare se le condizioni intracellulari ed extracellulari sono

divisione cellulare, quindi se c’è abbastanza “cibo” e in alcuni casi “spazio” e deve controllare se

favorevoli alla

non ci sono problemi nei meccanismi vari della cellula.

Oltre a questa “domanda” importante che determina il proseguimento o meno nel ciclo cellulare vi sono altre

punti dove la cellula controlla che tutto funzioni correttamente, questi punti vengono chiamati checkpoint.

Questi checkpoint sono associati principalmente alla sinestesi del DNA e alla mitosi.

Il ciclo cellulare appena descritto è rappresentativo per cellule eucariotiche ma non procariotiche. Di fatto non

avendo il nucleo non hanno una vera e propria fase S ed sotto alcuni versi hanno un ciclo più complesso di

quello eucariotico.

Per studiare meglio il ciclo cellulare e i controlli del ciclo stesso, furono sfruttati mutanti condizionali particolari,

i mutanti cdc. I mutanti cdc fan sì che nelle opportune condizioni le cellule mutanti si blocchino in una

determinata fase del ciclo. La differenza con gli altri mutanti condizionali è appunto questa che i mutanti

condizionali classici se posti nelle opportune condizioni si bloccano nella fase in cui sono quando sono posti

nelle opportune condizioni mentre i mutanti cdc si bloccano solo in quella determinata fase del ciclo se posti

nelle opportune condizioni.

Il vantaggio di questi studi è che il ciclo cellulare è conservato, quindi anche se organismi diversi con cicli

apparentemente diversi, sfruttano molecole e meccanismi conservate e questo è stato constatato con un test

di complementazione. 14/10/14

Quando le cellule decidono di non continuare a riprodursi si fermano in una fase chiamata fase G0, e non è

che non ha materiale genetico (per via dello zero) ma indica che non ha avviato il ciclo riproduttivo.

Le condizioni che influenzano la scelta se o meno iniziare il ciclo sono sostanzialmente di 2 tipi, ovvero le

condizioni nutritive, se quindi ci sono abbastanza nutrienti per iniziare il ciclo cellulare, e la presenza di ormoni

o fattori di crescita.

Per cellule che intraprendono il ciclo si sapeva solo che nella fase S si sintetizzava il DNA, ma poi si è

scoperto che nelle fasi precedenti e non solo si sintetizzavano subunità regolatorie per specifiche proteine

chinasi e che queste subunità sono diverse in base alla fase in cui sono sintetizzate e in oltre hanno un

semivita molto breve (degradate praticamente appena sintetizzate). Le proteine chinasi con cui queste

subunità interagiscono sono chiamate chinasi ciclino-dipendenti (CDK), in organismi più semplici come il

lievito ce né una sola ovvero CDK 1 o cdc 28, in mammifero ve ne sono molte di più e si susseguono.

Le subunità regolatorie vengono chiamate cicline.

Il prodotto attivo delle chinasi ciclino dipendenti è costituito da una subunità catalitica cdk e una subunità

ciclinica.

L’interazione tra una specifica ciclina e la opportuna cdk che in qualche modo guida il ciclo cellulare in ogni

fase, quindi si può dire che il ciclo cellulare è controllato da una successione di attività chinasiche ordinate.

La prima ciclina che interviene in lievito è la Cln3 e la controparte cdk è la Cdk1 e questa serve per uscire dalla

fase G1 poi abbiamo cicline che servono per passare della fase G1 alla fase S che sono, sempre in lievito la

Cln1 e 2, abbiamo le clicline della fase S che sono la ciclina Clb 5,6 e poi le cicline della fase M che sono le

cicline Clb 1,2,3 e 4.

Le cicline hanno quindi la funzione di conferire specificità quando complessate con le Cdk e di fatti nei

lieviti vi è una sola Cdk che cambia specificità in base alle cicline che lega.

Il complesso ciclina-cdk si può trovare in forma attiva o inattiva e questo è controllato da una serie di

meccanismi che funzionano sullo stesso complesso.

Regolazione complesso

Il legame con la ciclina è uno dei meccanismi principali per l’attivazione del complesso ma è una attivazione

parziale, l’attivazione completa del complesso avviene grazie alla cdk-activating kinase (CAK) che fosforila il

stesso dal sito attivo permettendo un’attivazione completa. Ma

T-loop consentendo lo spostamento del T-loop

abbiamo anche la fosforilazione di siti specifici che attivano o inattivano il complesso. Un’altra regolazione del

complesso è dato dal legame di proteine come nel caso del p27 che legandosi al complesso inattiva il

complesso stesso, p27 è un inibitore del complesso ciclina-cdk.

Abbiamo anche eventi di tipo proteolitico o trascrizione controllata, la trascrizione controllata sintetizza le

subunità quando necessarie onde evitare attivazioni in momenti non opportuni ed eventi proteolitici controllati

degradano le subunità quando non + necessarie.

La degradazione delle subunità è dato dalla poliubiquitinazione della subunità stessa.

I geni RAS

I geni ras codificano per delle proteine, le ras, che sono delle proteine G monomeriche. Isolati negli anni ’80

perché presenti in geni di virus in grado di indurre tumori in cellule di topo.

Furono inizialmente identificati due varianti di questi oncogeni virali responsabili dei sarcomi muri di Harvey(v-

H-ras) e di Kirsten(v-K-ras)

Successivamente sono stati isolati di omologhi cellulari chiamati c-H-ras e c-K-ras.

I geni presenti nelle cellule e i geni virali erano praticamente identici eccetto per una mutazione, un singolo AA

era cambiato nella versione virale rispetto a quello cellulare.

L’identificazione dei geni ras nei virus portò alla definizione del termine ONCOGENE, un oncogene è un gene

che presente su un virus è in grado di indurre la trasformazione tumorale di cellule immortalizzate. Studiando

meglio gli oncogeni si è visto che gli oncogeni non differivano molto dalle controparti nell’organismo, e di fatto

e quindi i geni dell’organismo non mutati vengono chiamati

differivano per delle mutazioni puntiformi, PROTO-

ONCOGENI ovvero dei geni che se mutati possono causare la trasformazione di una cellula.

Studi successivi alla loro scoperta hanno rivelato che molti tumori derivavano da mutazioni di proto-oncogeni

che a loro volta diventano oncogeni.

Le proteine ras sono proteine G monomeriche, piccole, con due regioni chiamate switch I e switch II e questa

regione è molto conservata.

Struttura di Ras:

GAP= proteina che accelera idrolisi GTP perché permette la fuoriuscita di GDP e l’ingresso di

GEF= proteina che aumenta la presenza di Ras-GTP

GTP

Lo switch I viene chiamato dominio effettore perché è associato a strutture che permettono la trasduzione del

segnale o comunque a molecole effettori

Lo switch II è il dominio che lega GEF e GAP quindi è il dominio che lega i regolatori.

TRASDUZIONE DEL SEGNALE DI RAS

Questa trasduzione del segnale si avvale di recettori tirosin chinasici, (parliamo di ras in cellule di mammiferi):

Il fattore di crescita si lega al recettore tirosinchinasico, si associano le due catene di recettore che si auto

fosforilano i domini citosolici a vicenda, dopo la loro fosforilazione si può legare ad esse il complesso Grb2-

Sos, Sos come detto prima lega Ras, che grazie a modifiche post-traduzionali è legata alla membrana

citoplasmatica interna, Ras in questo momento è legata a GDP. Quando il complesso Grb2-Sos si lega Sos si

dissocia da Grb2 e si lega a Ras facendo fuoriuscire GDP e poi viene a sua volta sostituito da GTP e in questo

stato, Ras risulta attiva e può attivare tutta la cascata a valle.

VIE A VALLE DI RAS

Le map-chinasi

La prima proteina che interagisce con Ras-GTP è Raf, Raf è una proteina chinasi. Nella forma legata a Ras la

chinasi Raf1 si attiva (vi sono diverse Raf).

La prima proteina che viene fosforilata da Raf1 si chiama MEK che è anch’essa una chinasi. MEK fosforilata

fosforila un’altra chinasi ovvero la MAP-chinasi (MAPK), la MAP-chinasi fosforilata entra nel nucleo e fosforila

fattori di trascrizione come Ets e Jun che attivano la trascrizioni di geni necessari.

La cascata di trasduzione del segnale che va da Raf fino a MAPK viene definito MODULO MAP-CHINASICO.

Un modulo map-chinasico è un insieme di proteine con una specifica attività biochimica che funzionano

insieme e che si trova in una forma o in un’altra a funzionare in diverse vie di trasduzione del segnale.

I prodotti dei geni Ras sono coinvolti nella transizione G1-S sia in eucarioti inferiori che in eucarioti superiori.

Negli eucarioti superiori lo stimolo mitogenico è un fattore di crescita che attiva Ras che a sua volta attiva la

ciclina D1 cioè viene trascritta. La ciclina D1 agisce su Retino Blastoma ed E2F. Retino Blastoma è una

proteina il cui scopo è quello di inibire il fattore di trascrizione E2F. E2F serve per attivare la trascrizione G1-S.

La fosforilazione di Retino Blastoma la inibisce e quindi non inibisce più E2F che è libere di attivare la

trascrizione G1-S.

Gli ANTI-ONCOGENI sono geni i cui prodotti sono in grado di bloccare lo sviluppo di un tumore. Quindi

qualunque proteine che controlli negativamente l’attività di un proto-oncogene è codificata da un anti-

oncogene.

Quindi se Ras è un proto-oncogene, perché se mutato diventa un oncogene, allora tutte le proteine che ne

controllano la sua attività in modo negativo sono anti-oncogeni un esempio sono le GAP che

riducono/inattivano le Ras perché accelerano il passaggio da Ras-GTP a Ras-GDP. Anche RB (retino

blastoma) è un Anti-oncogene.

In generale l’attivazione di un proto-oncogeni è un evento dominante ovvero basta solo che una copia sia

attivata per attivare la sua via, viceversa gli anti-oncogeni se muta una sola copia di anti-oncogene non avrà

effetto perché sono mutazioni recessive.

In natura l’attività di un proto-oncogene è regolato, nel senso che non è costantemente attivo, questo per

evitare una proliferazione non controllata. Per deregolare tale attività vi sono diversi sistemi che si possono

attuare:

1. Il controllo della produzione della proteina è alterato, bisognerebbe produrre 10 proteine invece se ne

producono 100, in questo modo la proteina, che è teoricamente inattiva, raggiunge una attività tale per

cui riesce a mandare avanti il processo ad essa adibita. Questo perché le proteine inattive in realtà

hanno una attività basale tale per cui non riescono a svolgere la loro funzione biologica, ma hanno una

attività, se vi sono tante copie della stessa proteina si riesce a raggiungere una attività complessiva tale

per cui questo pool di proteine riesce a svolgere la propria attività biologica. Questo è possibile se per

esempio il proto-oncogene viene riarrangiato male e finisce sotto un promotore costitutivamente

espresso o ancora più semplicemente vi è una mutazione nel gene tale per cui la proteina sia attiva

anche in situazioni di inattività.

2. Mutazioni puntiformi del proto-oncogene tali per cui la capacità di scambio del GTP sia accentuata

senza il bisogno del cofattore di scambio, in questo modo otteniamo una attivazione costitutiva del

proto-oncogene.

Ogni map-chinasi è un proto-oncogene perché se attivate quando non necessario attivano un sistema che

dovrebbe essere spento quindi in generale una mutazione in un qualsiasi punto della trasduzione del segnale

l’instaurarsi di un tumore. Quindi in generale i proto-oncogeni

genera sono fattori di crescita, recettori,

trasduttori intracellulari, recettori intracellulari, fattori di trascrizione, proteine che controllano il ciclo cellulare,

ovvero tutti elementi che in ambito di un network cellulare ricoprono lo stessa funzione e che se deregolati

portano alla formazione di un tumore.

ANTI-ONCOGENI= ONCOSOPPRESSORE

I retrovirus sono potenzialmente virus che possono indurre tumori perché possiede materiale genetico che si

integra nel genoma e se in questo materiale genetico è presente un oncogene questo verrà espresso.

Questi retrovirus portanti oncogeni si formano quando durante la fase di excisione quando il loro materiale

genetico viene exciso dal genoma dell’ospite, e per qualche ragione, avviene una excisione imperfetta e che

quindi il materiale genetico exciso conterrà sia i geni del virus che materiale genetico dell’ospite e se in quel

materiale è presente un proto-oncogene è possibile che questo finisca sotto il controllo del promotore del virus

e che quindi quando avverrà una seconda infezione il proto-oncogene viene espresso e si attiva diventando a

tutti gli effetti un oncogene.

Trasformazione Ras-dipendente

La solo mutazione di ras non causa la trasformazione di un organismo perché è finemente controllato da

oncosoppressori, infatti ras come oncosoppressore fu scoperto in cellule aventi oncosoppressori mutati o non

funzionale.

Da questo si deduce che l’instaurarsi di un tumore non è un evento così frequente, in generale vi sono degli

step da seguire per far sì che un proto-oncogene diventi un oncogene.

I network che portano ad una funzione conteneti prot-oncogeni vengono chiamati HALLMARK e la somma di

mutazioni in questi hallmark genera una cellula tumorale ma non è detto che tutti gli hallmark debbano essere

mutati per generare il tumore, di fatti si dice che ogni tumore è diverso, questo perché non solo c’è la

combinazione di hallmark a genereare il tumore ma anche quali proto-oncogeni di quegli hallmark sono mutati

a differenziare il tumore stesso.

Hallmark identificati sino ad oggi. 16/10/14

Abbiamo visto fino ad esso 2 pathway di tradsuzione del segnale: quello delle Ras e quello

dell’Adrenalina/glucagone. Ogniuno di questi pathway abbiamo gli stessi punti di interesse che costituiscono la

struttura di un pathway di trasduzione del segnale e quel che è il compito attuale è quello di saper identificare

tali caratteristiche quando si guarda in dettaglio i pathway stessi.

È importante per l’esame sapere le cose studiate in biochimica 1 tipo gli aa o cos’è l’alfa eliche beta foglietto

ecc. ESPRESSIONE E MUTAGENESI DI PROTEINE

Lo scopo di questo argomento è quello di suggerire dei possibili approcci per esprimere, purificare,

mutagenizzare e far evolvere una proteina di interesse in base alle nostre conoscenze. Le tecniche che

permettono ciò nel corso degli anni si raffinano sempre di più ma la logica che sta dietro queste procedure è

costante. Quindi non è importante sapere esattamente come funzione la tecnica bensì sapere la logica dietro

la tecnica e quando bisogna applicare queste tecniche.

Le prime applicazioni di organismi furono involontarie come nel caso della birra, invece applicazioni più

conscie come quella di utilizzare enzimi nel conciamento della pelle.

Dopo avere appreso cos’erano gli enzimi ecc. si scoprì che erano molecole molto versatili e che potevamo

utilizzarle a nostro vantaggio. Queste molecole venivano utilizzate per fare qualcosa che non era propriamente

la sua funzione ma che comunque sfruttava le sue caratteristiche natie, come nel caso delle proteasi che in

opportune condizioni possiamo “convincerle” a fare sintesi di legami anzi che rotture.

E quindi si è sempre di più cercato il modo di far fare alle proteine quel che volevamo noi, per esempio una

proteina di un mesofilo che opera al meglio a 35° vorremmo che operasse allo stesso modo a 15 o a 50° e

quindi o si cercava in natura una proteina con quelle caratteristiche o si cercava di modificare la prima.

nell’alterazione strutturale o funzionale della proteina stessa e quindi si modificava la

La modifica consisteva

catena amminoacidica, e per modificare la catena amminoacidica bisogna modificarne il gene.

Però prima di iniziare a modificare una proteina bisogna poterla estrarre e isolare in modo efficace, in

organismi che la sintetizzano però poteva risultare che l’organismo stesso ne producesse poche quantità

(poche per noi ma adeguate per lui) quindi risultava complessa l’estrazione, non solo per l’esigua quantità di

materiale da estrarre ma anche perche necessitavo di una enorme quantità di materia prima(batteri o lieviti,

biomassa diciamo) per ottenere un quantitativo significativo.

Grazie all’avvento dell’ingegneria genetica si potè però prendere il gene che esprimeva la mia molecola di

interesse e introdurlo in organismi, più o meno complessi di quello di partenza, che ne esprimevano una

quantità maggiore. Successivamente in casi dove ci interessava ottenere delle varianti con ulterirori

caratteristiche di interesse ci si pose la domanda su come modificare tali proteine.

Quindi ricapitolando, attualmente coltivazione purificazione e modificazione risultano essere fasi pressocchè

unificate, e con queste tecniche di ingegneria genetica si sviluppano:

 Enzimi

 Vaccini

 Antibiotici

 Biosensori

 Studi strutturali e funzionali (delle proteine stesse)

 Sviluppo di farmaci

 Ricerca per interattori INGEGNERIA GENETICA

Il DNA sintetiza un RNA che poi viene convertito in proteine, questo processo avviene in vivo e quel che si

cerca di fare è la stessa cosa in assenza di cellule, cell free, in questo modo possiamo modulare ogni aspetto

senza dover per forza fare ingeneria metabolica, questo però attualmente non porta a grandi produzioni.

Questo perché bisogna ottenere grandi quantità di RNA stabile e le proteine prodotte devono essere stabili, in

vitro mancano le ottimizzazioni per far sì che ciò avvenga. Questi stessi problemi risultano in organismi

eterologhi ma grazie all’ingegneria metabolica possiamo integrare meglio ogni punto che portano ad una gran

quantità di prodotto stabile.

Questi punti sono :

 questo punto è ottimizzabile in base alla scelta dell’ospite in cui si vuole

efficienza trascrizionale:

esprimere la tua molecola, storicamente il primo organismo scelto è quello di coli, però se devo

esrpimere proteine di organismi eucarioti i suoi geni contengono gli introni e quindi doverei toglierli, per

ovviare a questo si utilizzano cDNA in modo da non avere introni e in modo da avere la sequenza

esatta.

 Sistemi inducibili di vantaggio: a livello genetico la sola introduzione di un gene nel genoma non

comporta necessariamente la sua espressione, ci deve essere un contorno tale per cui il gene venga

espresso e questo contorno è costituito sostanzialmete da promotore e operatori e terminatori. Quindi

vengono scelti promotori inducibili in modo da scegliere quando far esprimere il mio gene.

Lo scopo principe di tutto questo è quello di ottenere tanto proteine e per far si che ciò avvenga è necessario

che il mio gene sia sotto un promotore molto forte in modo che vengano prodotte molte molecole di RNA

messaggero, in coli i migliori promotori sono quelli dei batteriofagi T7 però lo svantagio di questi promotori è

che vengono riconosciuti da specifiche polimerasi e non da tutte. Quindi si sfruttano i promotori dei geni LAC

che hanno il vantaggio di essere un promotre inducibile perché l’operone LAC viene espresso al meglio solo in

presenza di lattosio come fonte di C.

In generale si cerca di distinguere la fase di accumolo di biomassa da quella di produzione della mia proteina

eterologa. Questo è utile perché un accumolo di proteina eterologa può risultare tossica in generale e quindi se

la facessi produrre anche mentre la cellula sta crescedo questa crescerebbe male e produrrebbe meno

proteina. In altri casi la produzione può competere per le risorse e quindi ottenere lo stesso effetto ovvero

poche prroteine e crescita non ottimale.

Il sistema inducibile elimina questo problema.

Sistema inducibile pET

Parto da un sistema ospite che è coli, ed avrò creato un plasmide che contiene una cassetta di espressione,

ovvero l’insieme di segnali che consentono alla cellula di trascrivere in modo corretto e controllato il mio gene

e anche di modularne la trascrizione a mia scelta. Quindi integro il plasmide nella cellula e a questo punto ho

nella cellula il mio plasmide con il mio gene sotto il promotore di T7 ma attualmente in quella cellula il gene non

verrebbe espresso perché coli non contiene le polimerasi specifiche di T7, quindi dovrò cooesprimere anche la

polimerasi di T7 e dovrò avere un costrutto che mi permetta di esprimere la polimerasi di T7 in coli.

L’inducibilità è data dal fatto che nel costrutto del mio plasmide è presente nei promotori per la sintesi della

polimerasi di T7, riconosciuti dalle polimerasi di coli, è presente il sito per il repressore di lac in questo modo io

posso modulare la sintesi della polimerasi di T7 e di conseguenza la sintesi del mio gene, aggiungendo IPTG

(omologo strutturale del lattosio)

Per il mio costrutto sia efficiente devo avere :

 Stabilità dell’mRNA

 L’mRNA deve interagire bene con i sistemi di traduzione e qindi deve avere le sequenza shine-

dalgarno

 Codon usage, ovvero il gene da esprimere deve essere compatibile con le “preferenze” dei codoni

sinonimi del genoma utilizzate dall’organismo ospite. Se il mio gene non presenta i codoni delle giuste

preferenze posso semplicemente cambiare i codoni con quelli preferiti dall’ospite o ingegnerizzo il

ceppo di partenza in modo da avere l’abbondanza di tRNA sia alterata rispetto al ceppo WT in modo da

avere una prefernza di codoni favorevole al mio gene. Seguendo questo ragionamento sono stati

prodotti i ceppi di coli detti ceppi ROSETTA che hanno i codon bias favorevoli a geni di

mammifero/eucarioti.

Le proteine etorologhe sono funzionali se raggiungono il loro stadio adeguato di folding, in oltre è possibile che

proteine uguali si aggreghino a formare degli agglomerati non funzionali (vi sono malattie causate da ciò come

l’halzimer) 17/10/14

fattori che possono ridurre l’efficacia di produzione di proteine eterologhe è che quest’ultima sia

Uno dei

instabile, dove per esempio la proteina non si folda bene o viene degradata o ancora si accumula a formare

placche proteiche senza attività catalitica.

Ma non solo proteine mal foldate o sintetizzate male poi si possono aggregare o venir degradate ma anche

proteine correttamente foldate possono essere riconosciute come proteine estranee ed essere degradate.

Onde evitare l’accumolo proteico, che tra l’altro non fa bene per la cellula, si sono escogitati metodi per evitare

l’accumulo stesso, uno di questi è quello di far secernere la proteina eterologa quando possibile. Questo è

possibile grazie alle sequenze segnale che permettono di localizzare le proteine aventi queste sequenze in

appositi scompartimenti cellulari. In coli la secrezione non avviene direttamente nel terreno ma avviene nel

periplasma essendo GRAM - , i GRAM + possono secernere direttamente nel terreno, ed organismi eucarioti

vengono secrete nel terreno o vengono asscoiate a secrezioni (il latte per esempio).

Per aiutare il giusto folding proteico vengono fatte esprimere delle proteine chaperon che appunto aiutano il

folding proteico. Quindi in generale io non faccio esprimere la proteina nativa ma una versione modificata che

mi permetta la giusta secrezione e quindi evitare l’accumulo. In linea di massima poi la mia proteina secreta

durante la via di secrezione è protetta perché integrata nel sistema stesso e in oltre risulterà essere

abbastanza pura dato che una cellula di coli non secreta molte proteine.

Uno dei problemi delle proteine non foldate corretamente è dato da ponti di solfuro formati con residui sbagliati

comportando un folding scorreto. Si può operare su questo aspetto cercando di variare le proteine che

controllano questo aspetto del folding.

Gli aggregati proteici

Come detto prima, proteine mal foldate possono aggregarsi a formare degli aggregati proteici o placche

proteiche. Questi aggregati possono essere più o meno grandi e le forze che li mantengono sono date dai

residui idrofobici che, in una produzione in gran quantità di proteine tutte uguali, perdono il loro aiuto

nell’assunzione del folding corretto ma si aggregano immediatamente anche tra redidui di catene proteiche

diverse e vanno a formare gli aggregati. Questi aggregati vengono chiamati corpi di inclusione.

Per evitare la formazione di questi corpi di inclusione si cerca modulare aspetti ambientali e fisiologici per

evitare la loro formazione.

Un’alternativa è quella di non evitare la formazione di corpi di inclusione ma la si sfrutta per ottenere una

proteina pura al 90% il problema è che si ottiene un aggregato puro di proteina ma non funzionale e quindi

questa alternativa non è valida se ci si ferma a questo step.

Si può sciogliere il corpo di inclusione utilizzando specifici reagenti ovvero gli agenti cautoprici come il cloruro

di guanidinio che si frappongono tra le varie proteine separandole.Quel che si ottiene è però la proteina

unfolded in tampone cloruro di guanidinio, per foldarla si cerca di eliminare il cloruro di guanidinio in modo

molto controllato e per farlo effetto delle dialisi successive dove ad ogni step ridurrò in modo controllato la

concentrazione di cloruro di guanidinio.

In base a come scegliamo di produrre la proteina bisogna assumere delle accortezze, per esempio se voglio

produrre tramite corpi di inclusione devo esere sicuro che la proteine finale non presenti urea o altre sostanze

poteinzialmente nocive, o ancora se voglio ottenere una produzione ottimale devo utilizzare ceppi in grado, per

esempio , di crescere a temperature più favorevoli alla porduzione (+ alta la T + veloce è la produzione).

Proteine di fusione

Un altro modo per evitare la produzione di corpi di inclusione è quello di utilizzare proteine di fusione.

Una proteine di fusione è l’unione di 2 proteine mettendo in frame al gene della prima proteina il gene della

seconda proteina, ma togliendo in modo opportuno i codoni di stop ed aggiungendo delle triplette per la sintesi

di piccoli AA per distanziare le due proteine e per evitare che si folidino male.

Si è visto che se si fonde ad una proteina che nell’ospite stesso si folda bene, una proteina che nn si folda

bene è possibile che quest’ultima proteina sia in grado di foldarsi a sua volta.

Il problema che sussiste nell’utilizzo delle proteine di fusione è che ottengo una proteina che non è la proteina

che desidero ma un proteina grezza che devo raffinare staccando la mia poroteina senza danneggiarla o fargli

perderla di folding.

In linea di massima in una produzione industriale si desidera avere più proteina possibile con la purezza più

alta. Ma questo non è possibile otterlo in tutte le produzioni perché bisgona tener conto dei costi e dell’utilizzo

che se ne fa della proteina/ sostanza prodotta. Di fatto si segue lo schema :

più la sostanza prodotta è vicina al consumo umano (bibite farmaci ecc) più puro deve essere la sostanza

stessa.

In base a quel che ne devo fare della proteina devo anche poterla seguire, in alcuni casi devo poter saggiarne

l’attività in altri casi mi basta solo sapere quante ne sto producendo, e generalmente questi casi dipendono dai

vari stadi di produzione/purificazione della proteina.

Nella produzione di proteine c’è anche la possibilità di produrre proteine in sistemi cell-free. Questi sono i

vantaggi:

Strategie di purificazione proteica.

Se devo esprimere una proteina eterologa posso sapere a priori se delle modificazioni strutturali della proteina

stessa possono aiutarmi a purificarla ?

Potrei effettuare delle proteine di fusione per aiutarmi a purificare la proteina stessa.

Quindi devo immaginare quale proteina devo fondere e come posso usarla per purificare la mia proteina.

Affinity tag

Questo processo viene chiamato affinity tag ovvero fondo alla mia proteina di interesse un tag che poi sfrutto

per purificarla. Quindi l’affinity tag è un sequenza amminoacidica che è in grado di interagire con un ligando

che può essere immobilizzato su una resina e posto in una colonna cromatografica, il ligando in oltre dovrebbe

legare poche o nessuna proteinia/molecola cellulare, deve avere un’alta specificità con il TAG e una buona ma

non ottima affinità con il TAG, questo perché altrimenti sarebbe impossibile staccare la proteina isolata dal tag

quindi buona affinità non ottima.

Quindi in generale l’affinity tag è la fusione del tag alla proteina di interesse, la purificazione di essa grazie al

tag che si lega al ligando immobilizzato sulla resina, la separazione del ligando e quindi il recupero della

proteina+tag ed in fine la separazione del tag dalla protina.

Vi sono diversi tipi di tag che si possono dividere in classi :

 Small affinity tag

 Large affinity tag

Ovviamente la scelta ricade alle caratteristiche del tag/matrice e a quali caratteristiche conosiamo della

proteina che vogliamo purificare.

I large affinity tag vengono usati anche perché aumentano stabilità e solubilità della proteina fusi ad essi.

Il link tra l’affinity tag e la proteina fusa con esso oltre a legare le due proteine è anche il sito di taglio per delle

proteasi di restrizione che permettono quindi di separe le due strutture proteiche 21/10/14

La proteasi deve essere specifica, e devono svolgere un’attività simile a quella degli enzimi di restrizione, e

deve essere specifica per la zona linker situato nella catena che collega il tag con la proteina di interesse.

Il costrutto genetico diventa più complicato perché dobbiamo avere il solito promotore, il tag e nella sequenza

aggiunta tra il tag e il gene della proteina bisogna inserire una sequenza detta linker che codifichi per una

sequenza amminoacidica riconosciuta dalla proteasi scelta.

La proteasi che usiamo per separare il tag dalla proteina è un contaminante perché se lasciato nel medium

perché non è detto che non trovi altre sequenza che può ricnoscere e quindi degradare la proteina stessa o

altre proteine qualora questa debba essere miscelata con altre. Quindi ci sono diversi modi per eliminarla uno

di questi è quello di usare una proteasi non nativa ma ingegnerizzata dove è presente un tag in modo tale che

dopo aver svolto il suo compito possiamo allontanarla facendo una colonna apposita, e potenzialmente

possiamo usare come tag la stessa associata alla proteina in modo tale che dopo aver svolto il suo compito si

potranno allontanare in una sola volta sia la proteasi che il tag che era associato alla proteina di interesse,

ottenendo così solo la proteina di interesse.

Quest’ultima parte della tecnica di purificazione si chiama cromatografia ad affinità sottrattiva.

Le proteasi usate in questa tecnica sono endo proteasi ovvero proteine che tagliano all’interno della proteina:

I residui in grassetto sono quelli che rimangono dopo il taglio, e il taglio è segnato con un asterisco, come

vediamo dalla tabella alcune proteasi necessitano come sito solo una sequenza amminoacidica e tagliano alla

fine di questa sequenza, altri invece tagliano all’inerno della sequenza lasciando dei residui fissi attaccati alla

proteina tagliata. Il vantaggio di usare quelli che tagliano alla fine della sequenza specifica è che non siamo

vincolati nel lasciare residui non necessari attaccati alla proteina.

Serina Proteasi

Le serina proteasi sono una classe di enzimi il cui termine serina non indica il sito di taglio bensì indica il

principale residuo coinvolto nel sito attivo. In particolare parleremo delle subtilasi che hanno come modello la

subtilisina ma tra le subtilasi troviamo anche la famiglia delle pro-ormone convertasi che sono delle proteasi di

processamento,cioè proteasi che effettuano tagli specifici su ormoni che devono essere processati per

passare da pre-pro-ormone ad ormone.

Le proteasi vengono suddivise in base al residuo coinvolto nella catalisi e troviamo:

 Serina proteasi

 Cisteina proteasi

 Aspartato proteasi

 Metallo proteasi (parte del sito attivo è costituito da un metallo che è di solito da atomi di zinco)

Sono tutti in grado di idrolizzare legami peptidici.

Le serine proteasi possiedono 3 residui al sito catalitico, e si parla di triade catalitica, costituita da serina ,

istidina ed aspartato la loro azione coordinata consente il taglio nel sito catalitico.

la tripsina la chimotripsina la subtilisina l’elastasi, ovvero

I principali rappresentanti delle serine proteasi sono

tutte proteine di tipo degradativo aspecifico. La tripsina e la chimotripsine sono presenti negli apparati digestivi

degli organismi superiori come gli eseri umani, la subtilisina è presente nei batteri e le proteine della famiglia

delle chepsine e delle forine sono implicate nel processamento degli ormoni.

La triade catalitica e il meccanismo d’azione delle serina proteasi

che si lega all’ossidrile della serina

Le serina proteasi possono essere inibite da molecole come il DIPF

impedendo quindi il completo funzionamento della triade catalitica:

La serina è fondamentale per il funzionamento delle serine proteasi ma funziona solo se è presente un’istidina

che hanno la funzione di rendere reattivo l’ossidirle della serina stessa. Nel

che forma una catena di cariche

senso, per rendere attivo l’ossidrile della serina, l’idrogeno dell’osidrile deve essere parzialmente condiviso con

l’azoto della serina (vedi figura sopra), l’istidina però riesce ad attrarre l’idrogeno dell’ossidrile solo se

interagisce con il gruppo carbossilico dell’aspartato.

Il meccanismo di catalisi è un meccanismo covalente , nel senso che la serina proteasi formerà un intermedio

di reazione dove forma un legame covalente con il substrato.

Nella prima parte della reazione catalizzata dalle serina proteasi abbiamo la scissione del legame peptidico

della proteina substrato con la conseguente formazione di un legame peptidico tra un’estremità del peptide

scisso e la serina proteasi stessa e la liberazione dell’altro frammento di proteina substrato.

substrato appena

Nella seconda parte una molecola d’acqua stacca il frammento di proteina liberando il sito catalitico e

permettendo alla serina proteasi di riiniziare il ciclo.

Il complesso che si forma dopo la rottora del legame peptidico della proteina substrato si chiama complesso

acile-enzima.

Questo meccanismo è uguale per tutte le serine proteasi ma è indipendente dal tipo di substrato.

una serina proteasi per una proteina o un’altra è la tasca di specificità

Quel che rende specifica che ha il

compito di accogliere gli amminoacidi che si trovano in prossimità del legame peptidico da scindere.

Se si guardano la struttura delle diverse famiglie di serine proteasi la posizione della triade nella struttura

primaria è diversa, quindi si presume che non derivino tutte da uno stesso gene ancestrale ma da geni

indipendenti che per selezione hanno prodotto queste famiglie di proteine funzionalmente uguali. 28/10/14

A livello evolutivo si pensa che le serina proteasi derivassero dalla duplicazione di una parte di un gene dato

che strutturalmente sembra speculare, ma analizzando i geni risulta improbabile perché vi sono 3 residui

importanti (la triade catalitica) e non 4 residue in coppia. Quel che si è provato a fare è stato ingegnerizzare la

subtilisina e vedere come variava la sua attività, e rimovendo l’istidina la proteina era virtualmente inattiva,

virtualmente perché se gli si forniva unsubstrato avente nella sua struttura terziaria una istidina che si va a

posizionare dove dovrebbe esserci l’istidina della subtilisina nativa la proteina torna attiva ed effettua il taglio.

realtà le prime serina proteasi non possedevano l’istidina e che erano specifiche per

Quindi si pensa che in

quei tipi di proteina che aveva un’istidina che si posizionava a formare la triade catalitica, e che nel corso

dell’evoluzione le serine proteasi hanno acquisito l’istidina ed abbiano così declassato le vecchie serina

proteasi essendo queste specifiche per un maggior numero di proteine non avendo + bisogno di substrati che

fornivano l’istidina.

Pro-ormone convertasi un’alta

Una classe di enzimi facente parte della famiglia delle serina proteasi che sono subtilisina-like aventi

specificità sono le pro-ormone convertasi, sono degli enzimi che di per se non hanno una funzione digestiva,

cioè non tagliano proteine in modo indiscriminato, ma tagliano siti specifici su proteine bersaglio. Le loro

proteine bersaglio sono ormoni inattivi che devono essere tagliti per raggiungere la forma attiva. La pro-

ormone convertasi modello è la Kexina che deriva dal gene Kex2 di cerevisea.

Le pro-ormone convertasi hanno tutte una struttura abbastanza conservata aventi diversi domini, e il dominio

catalitico ha lo stesso folding in tutte le pro-ormone convertasi.

Quando si studiano proteine facenti parte della stessa classe o della stessa famiglia, si va a confrontare la

sequenza primaria e se questa combacia al 99% allora significa che quelle due proteine avranno la stessa

struttura tridimensionale. Ma man mano che la percentualità scende sarà sempre più difficile prevedere se le

due proteine avranno o meno la stessa struttura tridimensionale. In termini statistici si è visto che se due

proteine hanno almeno il 25 % di identità di sequenza (sequenza primaria uguale al 25%) le due proteine

avranno la stessa struttura tridimensionale. Per proteine con una identità inferiore al 25% è difficile affermare

che abbiano la stessa struttura 3D ma non è detto.

Più l’identità proteica è alta più io posso sviluppare un modello 3D tramite tecniche computazionali, cioè si

prende la proteina della stessa famiglia di cui si conosce la struttura, si mantengono fissi le posizioni dei

carboni alfa e in ogni posizione sostituire il residuo che cambia nella proteina incognita. In questo modo

ottengo un modello di struttura 3D della proteina incognita. La struttura cambia per vari motivi, perché

l’inserzione di nuovi residui può generare squilibrio dato che hanno cariche e dimensioni differenti da quelli

originali e quindi la struttura si adatta alla loro presenza ed otteniamo l’ipotetica struttura della proteina

incognita. Ci sono anche degli errori dovuti appunto a queste modificazioni che però si possono risolvere con

studi di termodinamica sulla proteina stessa. Si è visto che partendo da proteine con una identità proteica

ragionevole (25% circa) si riesce ad ottenere un modello verosimile della proteina che si vuole studiare.

Quindi gardando i geni la subtilisina si può vedere come i geni delle pro-ormone convertasi siano simili, di fatti

abbiamo:

 la sequenza segnale in ambedue

 il dominio pro ovvero uno chaperone intramolecolare che serve per raggiungere una struttura

tridimensionale corretta

 il dominio catalitico

convertasi hanno però altre regioni che sono implicati in larga misura nell’indirizzamento della

le pro-ormone

proteina.

In che modo le pro-ormone convertasi sono specifiche per un certo tipo di ormone?

La specificità è presente perché i substrati hanno degli specifici aa basici situati immediatamente a monte del

legame scissile (il sito di taglio).

Identifichiamo i residui che sono tagliati con una sigla che inizia per P, immaginando che il sito di taglio sia in

0 si chiamano P1 P2 P3 P4 ecc fino all’N-terminale.

posizione 0 tutte le posizioni ad N terminale dopo Al C

terminale abbiamo P1’ P2’ ecc. questo serve perché in corrispondenza di questi residui vi sono dei residui

sull’enzima che li accolgono, come la tasca di specificità. Quel che si nota da studi è che la zona che accoglie

il peptide è una zona estremamente acida:

(aa della proteina acidi in rosso)

Dei ricercatori della gentech vollero ingegnerizzare la subtilisina in modo che avesse la specificità della furina e

non sapendo niente della struttura della furina, iniziarono a sostituire i residui della tasca di specificità in modo

che fossero uguali a quelli della furina e quindi misero aa acidi nella tasca di specifica. Risultò che ottennero la

specificità ipotizzata.

Approcci di ingengeria genetica: la mutagenesi

Le metodologie usate per lo studio di queste caratteristiche proteiche sono metodologie sito diretto, nel senso :

avendo una proteina di cui vogliamo cambiare alcune proprietà più o meno specifiche, queste modifiche che

attuiamo possono avere a che fare con la specificità di substrato o con le caratteristiche chimico-fisiche.

Quando si attuano queste metodologie si sa quel che si vuole ottene a livello di caratteristiche ma non si sa

cosa si deve modificare.

Le vie che si possono percorre per scegliere cosa modificare sono :

 mutagenesi sito diretta: mutagenizzo residui specifici del sito attivo che so che hanno un ruolo o

sospetto che abbiano un ruolo nell’attività dell’enzima o nella proprietà che voglio modificare. Nel caso

visto della subtilisina che volevo che tagliassero substrati con residui basici in P1 e P2 ho modificato i

residui nella tasca di specificità in posizione S1 ed S2 in modo che si posizionassero residui acidi. I

o la struttura specifica dell’enzima da modificare o del

rerequisiti specifici è che io debba sapere

substrato senza di essi non posso ipotizzare i siti coinvolti nella caratteristica di mio interesse e non

posso quindi usare la mutagenesi sito diretta.

 Mutagenesi casuale: non avendo dati sulla proteina da studiare, inseriscono in modo casuale residui in

una o più posizioni. In questo modo spero di ottenere le proprietà desiderate o di evidenziare

caratteristiche che mi aiutino a capire meglio il funzionamento della proteina. Per attuare questo

meccanismo devo avere un meccanismo di screening per evidenziare le caratteristiche che ricerco.

Quindi tanto più conosco la proteina da ingegnerizzare più specifica è la modificazione che posso sfruttare

meno conosco la proteina più random sarà l’approccio per ottenere le caratteristiche desiterate.

Un approccio particolare della mutagenesi random è l’evoluzione assistita, cioè si cerca di replicare in lab quel

che l’evoluzione ha fatto in natura ovvero si accoppia una pressione selettiva in una specifica direzione, ad

esempio proteine + termostabili, ad un proccesso di accumolo di mutazioni che porta a selezionare quella

variante che funziona meglio nelle condizioni poste.

Tecniche di mutagenesi random

Sono tecniche principalmente basate su PCR , e la si sfrutta amplificando un gene ma con polimerasi non

molto fedeli ovvero effetto un’aplificazione ERROR-PRONE.

Posso settare quanti errori accumulare ogni 1000 bp ottenendo in media 2 o 3 cambiamenti nella sua

sequenza codificante e potrebbe essere che questi cambiamenti comportino cambiamenti a livello

amminoacidico, potrebbe perché il codice genetico è generato e se la mutazione cade sul terzo codone

potrebbe non generare cambiamenti.

Quel che posso fare con questi frammenti mutati è generare vettori di espressione per coli ottenendo quindi

una library perché ogni frammento inseirto in un vettore è potenzialmente diverso.

L’error-prone PCR quindi necessiata di una polimerasi che non ha attività proof reading, posso aumentare la

concentrazione di magnesio o una sua parziale sostituzione con il manganese rendendo la polimerasi meno

efficace e quindi aumentando gli errori. Sempre per aumentare gli errori posso aggiungere alcol o introdurre

analoghi di nucleotidi che si appaiano con + basi , o usare polimerasi ingegnerizzate per effettuare errori.

In caso dovessi mutagenizzare proteine con + domini e di cui so quale dominio è da mutagenizzare posso fare

PCR non error-prone per i domini normali e una PCR errror-prone per quel dominio specifico.

Un’alternativa è l’uso della mutagenesi a cassetta dove un frammento + o meno lungo viene alterato, e viene

fatto tramite mutagenesi con PCR, il frammento alterato viene immesso in un vettore dove è presente l’intera

proteina meno il frammento, in questo modo ottengo un vettore con la proteina mutata in modo random solo

nella regione di mio interesse.

La cassetta può essere ottenuta in molti modi, PCR per esempio, o può contenere un altro DNA per esempio

se ho il gene x la subtilisina 1 e introduco il frammento del gene della subtilisina 2 otterrò una proteina ibrida, O

posso fare un DNA sintetico.

Il DNA sintetico è una sequenza di DNA sintetizzato per processi chimici e non biologici, dove parto da un

nucleotide ancorato ad una matrice dove nucleotide dopo nucelotide lo allungo sino ad ottenere il mio

filamento. Il difetto di questa tecnica è che il filamento non può essere molto lungo perché più lungo è il

filamento più alta diventa la frequenza di nucleotidi errati associati.(stessa roba vale per proteine sintetiche)

Posso sintetizzare interi geni con questa tecnica ma se accoppiata alla PCR, lo posso fare sintetizzando

frammenti che si appaiano ma alternati sulle due catene :

Il vantaggio di sentizzare un gene è che posso inserire quello che voglio, da siti di restrizione a mutazioni

puntiformi ecc.

Mutazione a saturazione: sostituisco un residuo che so che è importante in una proteina con tutti i 20 aa

cercando quello che ottimizza la funzione della proteina. Il modo + semplice è quello di effettuare 19 mutazioni

sitospecifiche. Questo però non è il metodo + efficace per effettuare una mutazione a saturazione. Quel che

posso fare è sintetizzare il frammento dove è presente la tripletta da mutagenizzare e nel momento in cui devo

aprire i pozzetti del nucleotide specifico per i 3 nucleotidi apro contemporaneamente tutti e 4 i pozzetti in modo

da avere il 25% di possibilità che si associ A T C e G e quindi otterrò 4 oligonucleotidi (perché in un pozzetto

non sintetizzo una catena per volta) diversi con 3 nucleotidi randomici coprendo così tutte le possibili

combinazioni per quella tripletta. 30/10/14

Un’approccio alternativo è quello di utilizzare oligonucleotidi degenerati, questi rappresentano una famiglia

di oligonucleotidi che differenziano per nucleotidi codificanti aa in diverse posizioni. Vengono costruiti

inserendo nella posizione corrisponente alla tripletta del residuo da modificare tutte le possibili sequenze.

Queste triplette vengono indicate per esempio con : XTX dove le X sono qualsiasi nuceotidi, negli

si coprono tutti e 20 gli aa e c’è

oligonucleotidi degenerati sono XXX. Per semplificare si usano XXC e XXG,

anche una tripletta stop. La sintesi avviene tramite un sintetizzatore molecolare (sintetizzo chimicamente

l’oligo).L’utilizzo degli oligo degenerati è previsto per esempio in mutazioni a cassetta.

Dopo tutte le modificazioni quel che mi interessa è sapere quali caratteristiche ha acquisito/perso la proteina.

Ho quindi 32 varianti da saggiare (32 sono le possibili triplette quindi 32 ceppi diversi) ed aumentano se ho

modificato più residui.

Sistemi di screening

Dopo aver effettuato una qualsiasi mutazione random devo poter screenare i vari campioni ottenuti e i

prerequisiti per un sistema di screening sono: il sistema stesso di screaning e il sistema di espulsione, anche

informazioni sulla struttura e funzione della proteina se ci sono.

In seguito allo screening avrò una selezione di mutanti di interesse, che saranno quelli sopravvissuti allo

screening, questi dovranno essere confermati, nel senso che devono essere riscreenati per evitare falsi

positivi, e in fine questi subiranno 2 tipi di analisi: un’analisi di sequenza,per sapere quale aa è mutato, e

di tipo funzionale.

un’anasi

Quindi il fine utlimo dei sistemi di screening è quello di identificare i mutanti che ci interessano.

La variabilità genetica generata con le mutazioni, può essere piccola e quindi ottenere tipo 10 mutanti, oppure

8

generare una grande variabilità genetica e generare 10 mutanti. Se nel primo caso posso controllarli uno ad

uno, nel secondo caso devo avere un sistema veloce e funzionale per identificare il mutante di interesse. Dato

che si parla di library principalmente le tecniche di screening sono tecniche applicate su piastra e con piastra si

intende sia piastre petri che le multipozzetto (quelle usate in saggi elisa). Nelle piastre petri posso piastrare a

tappeto dove ogni colonia è costituita da una variante genica, mentre nelle multipozzetto posso scegliere

quante cellule piastrare per pozzetto eseguendo opportune diluizioni.

Un esempio di selezione :

una cellula deve trasportare l’azoto all’interno della cellula per far si che sopravvivere, di solito si semina in

terreno ricco di azzoto sotto forma di ione ammonio ad esempio. Se io sono interessato a visualizzare varianti

della proteina che trasporta l’azoto con Km più basse per l’ammonio quindi che sia + efficiente, posso far

crescere le cellule ad una concentrazione limitante di ammonio, nel senso che le cellule WT muoiano a quelle

concentrazioni. Quindi quel che faccio è usare cellule che non hanno il gene WT del trasportatore

dell’ammonio ma hanno solo il gene che io ho mutagenizzato randomicamente per lo stesso trasportatore,

quindi quando le semino su quell’apposito terreno cresceranno solo quelle che sono in grado di trasportare

l’azoto a quelle concentrazioni, in oltre le varianti simili al WT non crescono perché la concentrazione è settata

in modo che non crescano.

Quindi per avere una buona selezione è quello di associare in modo condizionale la proprietà di mio interesse

con una funzione vitale per l’organismo ospite in modo da avere uno screening rapido ed efficiente.

lo screening che nel caso dell’esempio è quello di

La conferma citata prima non è altro che rieffettuare

ripiastrare le cellule che sono cresciute nel primo screening e solo quelle che ricrescono hanno passato lo

screening.

Quel che si fa subito dopo è il sequenziamento del plasmide contenente il gene mutato randomicamente.

Dopo di che si può purificare la proteina e studiarne meglio la struttura e attività (saggi biochimici in pratica)

In alcuni casi è difficile ottenere subito un miglioramento di efficienza di 2 ordini di grandezza, quindi si può

fare in due step o + e screenare a concentrazioni + alte.

Dopo aver ottenuto e sequenziato delle varianti, mi segno sia la posizione che quale residuo è cambiato di tutti

i mutanti. Quel che faccio successivamente è un confronto tra i vari mutanti in modo da identificare le

caratteristiche simili o costanti. Se trovo delle modificazioni comuni nella maggior parte dei mutanti c’è un’alta

probabilità che quel residuo mutato sia associato alla proprietà che ho screenato. Quel che posso chiedermi è

che se ci sono 2 mutazioni predominanti, quali delle due è utile o lo sono entrambe? Quindi devo costruire

deimutanti che portano una sola mutazione, e visualizzare le caratteristiche della proteina, e rispondere alla

domanda “la funzionalità della proteina è direttamente responsabilee dell’interazione dei 2 residui (o + se

cen’erano di +) o è indipendente” potrei trovare i seguenti casi :

1. La proprietà si manifesta se e solo se ci sono ambedue le mutazioni, quindi la proprietà dipende dalla

loro interazione.

sola delle mutazioni ha un’effetto sulla proprietà e l’altra no.

2. Una

Le due mutazioni hanno da sole un’effetto ma se presenti assieme hanno un’effetto significativamente

3. maggiore o minore rispetto alla presenza delle singole mutazioni, quindi anche in questo caso la

funzionalità è la risultante dell’interazione dei due residui ma non è dipendente da essa perché

presente anche in presenza di una sola delle 2 mutazioni.

Se la somma dell’effetto di 2 mutazioni hanno un effetto diverso allora si dicono mutazioni additive se invece

la somma degli effetti di 2 mutazioni è + che additivo (si raddoppia o aumenta drasticamente l’effetto) si

chiamano mutazioni sinergiche.

I controlli appena citati si devono fare su tutti i mutanti per procedere poi a mutazioni sito dirette dove vado a

sommare tutte le mutazioni che portano un effetto positivo per ottenere un super mutante.

Se avessi fatto uno screening avrei fatto la stessa cosa, perché ho selezionato in modo mirato una quntità di

mutanti di interesse, l’unica cosa che cambia dalla selezione è che si può disaccoppiare la vitalità dalla

produzione della proteina. Quindi devo saggiare direttamente la proteina per screenarla e per farlo la proteina

deve essere nel medium e se lo è già bene altrimenti devo estrarla dalla cellula, e quindi isolo i mutanti

adeguati in base a quel che ottengo posso effettuare le stesso cose che sono state menzionate prima per la

selezione dopo il controllo.

Un problema che può sorgere in questi casi è che le proteine nei vari pozzetti non sono pure ovvero che nel

pozzetto c’erano + cellule è probabile che ci sono + forme della stessa proteina e quindi prima di sequenziare

ecc. bisogna purificare la proteina e saggiare ogni proteina e bisogna anche purificare le cellule in modo da

piastrare una cellula per pozzetto in modo da avere 1 proteina x pozzetto.

DNA SHUFFLING

Immaginiamo di non conoscere nulla sugli elementi molecolari che determinano le proprietà di una data

proteina. Idealmente vorrei selezionare il numero + alto possibile di mutanti per identificare il mutante per il mio

scopo. Se avessi una piccola proteina di 100 residui potrei teoricamente effettuare mutazioni a saturazione su

tutte e 100 le posizioni ma genererei un quantità enorme di mutanti. Quel che si fa è utilizzare una tecnica che

sfrutta la PCR mutagenica per imitare l’evoluzione proteica in natura, vi sono diversi metodi noi ne abbiamo

visto uno.

In natura l’evoluzione proteica consiste nell’introduzione casuale di errori durante la replicazione di DNA, dato

non è perfetto le gi errori rimangono. Un’altro fattore di variabilità è la ricombinazione.

che il sistema

L’associazione di questa variabilità genera evoluzione cioè le mutazioni vengono fissate nella sociatà grazie

alla selezione naturale studiata da Darwin. In vitro si cerca di fare qualcosa di simile, ovvero si parte da un pool

di geni con una buona variabilità genica (sintetizzano x la stessa proteina ma non sono esattamente uguali) si

generano frammenti di questi geni e li amplifico in modo non molto fedele aumentando ulteriormente la

variabilità genica, ed ottengo così geni per proteine alcune completamente diverse dalle originali alcune non

funzionali e alcune con una nuova funzionalità. 31/10/14

Descrizione procedimento

Si parte da un pool di geni omologhi, ovvero geni che codificano la stessa proteina ma di organismi diversi o

potrebbero essere geni di isoenzimi o potrebbero essere geni ottenuti per PCR mutagenica, quindi geni per la

stessa proteina ma con varianti diverse. Nella figura (A) ogni linea indica un filamento di DNA a doppia elica e

le X indicano le mutazioni. I vari filamenti vengono tagliati con degli enzimi che tagliano in modo aspecifico(B),

ad esempio si può usare la DNAsi 1 che è una endonucleasi che taglia in modo aspecifico effettuando una

digestione parziale dei filamenti di DNA. Il risultato sono una gran quantità di frammenti generati in modo

casuale e di dimensioni variabili, qesti frammenti avranno delle zone sovrapponibili tra loro(C). Quel che si può

fare una volta digeriti i filamenti di DNA è purificare i frammenti delle lunghezze desiderate in modo da

eliminare frammenti o troppo grandi o troppo piccoli. A questo punto l’interesse è quello di riottenere un

filamento di DNA con le stesse dimensioni del filamento iniziale poi frammentato ma che codifici si per la

proteina ma che non sia identico ai geni iniziali.Quel che succede è una sorta di crossing, avendo i filamenti

delle porzioni sovraponibili, ottenendo così il filamento della lunghezza del gene iniziale ma con mutazioni

provenienti da tutti i geni iniziali(D).

(i vari passaggi )

Un esempio pratico è quello di LacZ alpha, una delle due catene che fanno alfa complementazione a formare

la beta galattosidasi. Lo si frammenta con DNAsi 1, ottenendo uno smear con una picco sulle 100 bp,LacZ

alpha ha in peso iniziale di 1 kb. Si purificano i frammenti in base al peso per esempio 50 bp tramite HPLC o

in colonna. A questo punto si deve procedere con la seconda parte della procedura ovvero ricostruire il

frammento iniziale del gene, per farlo si effettuano cicli di PCR ma senza primer(perché i frammenti sono

parzialmente sovrapponibili) dove ad ogni ciclo le dimensione medie aumentano sempre + e verso gli ultimi

cicli si vedrà un accumulo di dimensioni simili a quelle del gene iniziale ovvero 1kb. Quando giunti a questo

punto si fa un’ultima PCR ma con i primer che saranno disegnati appositamente per appaiarsi al 3’ e al 5’ del

neogene. A seguito di questa PCR avrò amlificato un gene da 1kb che però sarà un pool di frammenti tutti

diversi con accumuli di mutazioni derivanti dai vari geni del pool iniziale di geni per la LacZ alpha.

Dopo questo processo di evuluzione molecolare bisogna solamente saggiare quale proteine hanno delle

caratteristiche che possono interessare e bisogna saggiare ogni variante generata dal processo.

Le inteine

Le inteine sono una famiglia di proteine, le inteine sono un framento di proteina che viene exciso dalla proteina

dell’RNA avviene a

matura con un processo analogo a quello dello splicing ma che invece di avvenerie a livello

livello della proteina. Il gene codifica per una proteina che ha 2 elementi che sono gli elementi funzionali

presenti nella proteina matura che si chiamano N-exteina e C-exteina, tra questi due elementi è presente la

che sintetizza per l’inteina stessa. Quella che si forma è una catena polipeptidica

componente genica

immatura, e lo scopo è quello di ottenere una catena polipeptidica formata solo dall’N-exteina e dalla C-exteina

excidendo l’inteina in un processo che si chiama protein splicing.

Le inteine ricadono in 2 classi :

 Large inteine:

 Mini inteine da elementi presenti solo nelle Large inteine. C’è un

Sono caratterizzate da alcuni elementi in comune e

domionio chiamato N-splicing e il dominio S-splicing che sono presenti in ambedue le forme di inteine che

sono i domini che interagiscono per dare lo splicing corretto. Nelle large inteine è presente un altro dominio

che può o non può essere presente (la prarte in grigio in figura).

Gli step di protein splicing: di splicing dell’inteina, e una serina

i residui importanti sono una cisteina ,appartenente al dominio N-terminale

che è il primo residuo della C-exteina seguita da una asparagina.

1. Il primo evento che deve avere luogo è un riarrangiamento a livello della cisteina che porta alla rottura

del legame peptidico tra l’N-exteina e la formazione di un legame estere con lo zolfo della cisteina

stessa :

Avviene un legame di transesterificazie tra il nucleofilo della cisteina che è l’ossidrile della serina e il

2. tioestre, quindi l’ossidrile attacca il tioestere con la formazione di un legame estere tra l’N-exteina e la

serina della C-exteina:

Avviene l’attacco da parte del gruppo NH dell’asparagina, che si trova al C-termina dell’inteina, sulla

3. 2

serina con la formazione di un legame ciclico tra l’asparagina e la serina con però il distacco

dell’inteina:

A questo punto l’inteina è libera ma

4. non abbiamo i due domini collegati con un legame peptidico quindi

abbiamo un riarrangiamento del legame grazie all’intervento del gruppo NH legato alla serina portando

2

alla formazione del legame peptidico.

Applicazioni

Possiamo sfruttare le inteine per facilitare il processi di purificazione per affinity tag dove evitiamo di utilizzare

enzimi esogeni.

La nostra proteina è quindi fusa in frame con una inteina che a sua volta è fusa in frame con il TAG nel caso in

esempio è il chitin binding domain:

Quindi variando le condizioni ambientali posso indurre l’excisione della proteina, ma il costrutto appena citato

non genera una vera e propria excisione perché l’inteina non è situata al centro tra i due domini che si

uniscono.

Quel che faccio non è altro che mutagenizzare l’asparagina per inibire l’escisione, e qiundi induco il rilascio

della proteina con una idrolisi.

Interazione proteina proteina

Una larga parte delle proteine agiscono all’interno della cellula interagendo con altre proteine, ciò vuol dire che

le proteine svolgono la loro funzione cooperando o stando in stretta collaborazione con altre proteine.

Parleremo per esplicare meglio le interazioni proteina proteina dell’ormone della crescita GH in particlar modo

dell’ormone della crscita umano hGH. Questo perché si conoscono svariati dati sia di lui che del suo partner e

queste informazioni sono state acquisite in diversi anni di studio con diverse tecniche.

Il primo approccio utlizzato per studiare l’hGH è un antenato del DNA suffling chiamato homolous scanning

mutagenesis.

Il punto di partenza sono 4 ormoni: l’hGH , l’ormone porcino della crescita pGH, la prolattina umana (simile

all’HGH) e l’hPLR (simile alla prolattina).

L’ormone della crescita è coinvolto nell’accrescimento ponderale degli organi, quindi la sua assenza

corrisponde alla mancata crescita e sviluppo del corpo quindi si diventa nani(nanismo ipofisario) ma se viene

identificata in tempo si può fornire al paziente hGH e correggere il difetto, viceversa chi produce troppa hGH

presenta quel che viene chiamato gigantismo ipofisario.

L’oromone della crescita interagisce con il suo recettore tirosin chinasico che poi scatenerà una cascata del

segnale che però non ci interessa.

Le proteine prima citate sono simili e questo è rampresseto nella figura sopra, quelle identiche hanno lo sfondo

grigio quelle diverse lo sfondo bianco. I segmenti identificati con A,B,C,D,E ed F sono i frammenti che gli

studiosi hanno scelto di innestare nell’hGH per vedere cosa succedeva se si trapiantavano quelle sequenze

nell’hGH dal punto di vista dell’interazione con il suo recettore.

Quel che ottennero gli scenziati è riassunto nella seguente tabella :

I valori riportati sono la K (costante di dissociazione termodinamica espressa in nano molare) e il rapporto tra

D

del mutante con quella del Wild Type. Que che si deduce da questa tabella è che in ogni caso l’interazione

K

D è maggiore allora l’interazione

con il recettore peggiorava dopo la sostituzione, se la K con il ligando è

D

peggiorata (+K vuol dire + enzima per legare) in oltre questo esperimento ci consente, anche se abbiamo un

D

peggioramento in prestazioni, di iniziare ad intuire quali residui sono importanti nell’hGH per l’interazione con il

suo recettore.

A questo puto ci si domanda quali residui sono davvero importanti e come interagiscono nella struttura

tridimensionale dell’hGH, se non si hanno dati sulla struttura 3D della proteina si possono ricavare poche

questo esperimento non si conosceva la struttura 3D dell’hGH ma si conosceva

informazioni. Quando si è fatto

la struttura 3D dell’ormone porcino e quindi lo si utilizzò come modello dell’hGH.

Quel che si vede dal modello di hGH partendo dalla struttura 3D del pGH è che vi sono 4 alfa eliche che

formano un bundle di alfa eliche, non sono presenti elementi beta ma vi sono parecchie anse. In oltre sono

mostrate le alfa eliche viste dall’alto con i residui splicitati. Ora con questo modello si possono identificare le

posizioni ipotetiche dei residui mutati che davano forti cambiamenti.

In questo grafico si possono vedere gli effetti delle varie sostituzioni in corrispondenza della posizione dei

residui in hGH, con questo grafico ci si domanda dove sono posizionati struturalmente i residui da 60 ad 80

(picco grigio) e quelli da 160 a 180 (picco bianco) e si nota che sono in 2 aree della proteina orientate nello

stesso verso che sono quindi potenzialmente in grado di interagire con il recettore. 4/11/14

Un effetto sul binding o una qualunque attività, può essere di tipo diretto o indiretto. Un effetto diretto è quando

la specifica mutazione fatta agiscono sulla parte della proteina che stiamo studiando, quindi nel nostro caso

che stiamo analizzando interazione proteina proteina si intende quella zona di proteina che interagisce con il

recettore. Un effetto indiretto è dato da mutazioni che possono indurre cambiamenti strutturali partendo da una

zona che non ha a che fare con la funzione studiata.

Per capire in quali casici troviamo dobbiamo avere informazioni sulla struttura della proteina in analisi che nel

caso affrontato è l’hGH. Dato che l’identità tra l’hGH e il pGH si aggira al 90% possiamo dire che

strutturalmente parlando sono molto simili quindi sulla base di ciò possiamo identificare la locazione spaziale

dei residui identificati con l’esperimento di homolog scanning. Si è visto quindi che i residui identificati che

sostanziale nell’attività dell’hGH erano residui collocati spazialmente nella stessa

portavano un cambiamento

zona, ma nella sequenza potevano essere anche molto distanti, e quei residui erano importanti per la

interazione proteina-recettore. il recettore dell’hGH si peresume che si leghi, otterremo la figura sovrastante

Se si disegnasse un cerchio dove

e se analizziamo i residui coperti dal cerchio noteremo chela maggior parte dei residui identificati con

l’homolog scanning si trovano all’interno del cerchio, ma sono presenti anche altri residui, quei residui non

risultano essere importanti per la forza di legame ma non vuol dire che non siano coinvolti con l’interazione con

il recettore.

Nel momento in cui voglio studiare l’interazione proteina proteina devo avvalermi di tutte le conoscenze

possibili sui siti in cui intervenire per risparmiare tempo.

Alanine-scanning

Un approccio che non si basa su conoscenze pregresse è quello che si chiama alanine-scanning ovvero

scansione ad alanine. Consiste nel mutagenizzare un certo numero di residui cambiando il codone codificante

per l’aa con il codone dell’alanina. L’alanina è l’aa preferito per questi tipi di studio perché non interferisce

come la glicina(un’H soltanto senza quindi effetti sterici). La scelta dei residui

troppo sulla struttrua terziaria

ricade per scelte storiche e non solo sui residui carichi, il perché dato dal fatto che è + probabile che i residui

carichi possono trovarsi maggiormente all’esterno rispetto ai residui idrofobici e in oltre sono in numero

inferiore rispetto agli altri residui. Una volta sostituiti i frammenti di DNA contenente i gruppi carichi con

frammenti di DNA con alanine, bisogna studiare i mutanti in base alla caratteristiche di interesse che nel nostro

caso sono l’interazione proteina proteina ovvero la K dell’hGH.

D

I risultati sono praticamente gli stessi dell’Homolog scanning e che quindi tutti gli aa cambiati porducevano una

WT, e analizzando

proteina che aveva un effetto peggiore risspetto all’hGH le posizioni spaziali si nota che i

residui mutati ricadono nella stessa zona evidanziata dal precedente esperimento.

Quindi quei residui sono importanti per l’interazione dell’hGH con il suo recettore dal punto di visto della forza

di legame.

L’hGH interagisce con il recettore della prolattina perché sono molto simili, quel che si vuole fare è rendere il

legame tra l’hGH e il suo recettore migliore. Dai dati evidenziati sin’ora tutti i mutanti ottenuti evidenziavano

hGH che si legavano peccio del WT.

Dagli esperimenti pregressi sappiamo già alcuni residui importanti e anche quali residui in quella posizione

sfavoriscono il legame, ma non sappiamo l’effetto di tutti i residui quindi quel che si può far è una mutagenesi a

saturazione in tutte le possibili mutazioni, e sfruttando uno screening che ci permetta di identificare quali

mutanti si legano meglio al recettore del WT possiamo ottenere i mutanti di interesse.

Il metodo proposto ai tempi dai ricercatori era un metodo che permetteva di studiare in modo massivo

l’interazione propteina-proteina che prevedeva l’accoppiamento di una selezione allo studio. Questa tecnica si

chiama Phage display e consiste in :

Si parte da un fago filamentoso, il fago M13, che possiede un capside con delle proteine codificate dal suo

DNA. Si è visto che si poteva introdurre in esso delle varianti proteiche che però erano delle proteine ibride,

nello specifico la proteina 8 in cui sono presenti poche copie alle estremità del fago, può essere sostituita da

una proteina ibrida cioè la proteina 8 + un’altra proteina, nel nostro caso l’hGH, che si andrà a posizionare nel

capisde ottenendo un capide che mostra hGH.

Se io ho un fagemide, ovvero un DNA circolare con origine di replicazione fagica e non che si può comportare

sia da fago che da plasmide, ed infetto un batterio questo si comporta come plasmide ma se oltre al fagemide

introduco un fago helper che attiva le funzionalità fagiche del fagemide questo genererà dei fagi.

Quello mostrato in figura è il fagemide utilizzato nel phage display. Abbiamo le due origini, un gene per la

resistenza all’ampicilinna e poi abbiamo il costrutto gene hGH+ Gene proteina 8 e tra i due geni è presente

una tripletta stop TAG. Se il fagemide viene trascritto dall’origine normale la trascrizione si ferma allo stop se

invece viene trascritta dall’ori del fago la tripletta viene ignorata e si forma una proteina di frusione ovvero la

un’alanina) e può

proteina8+hGH. Nel coli sfruttato però presenta un tRNA che ignora il codone stop (inserisce

amplificare il fagemide.

A questo punto infetto i coli con diversi fagemidi con varie versioni di hGH in modo che i fagi prodotti

presentino sul capside l’hGH che era presente nel fagemide che aveva infettato il coli e quindi genero una gran

quantità di fagi con diverse versioni dell’hGH presentato.

A questo punto dobbiamo saggiare queste versioni ottenute cercando versioni aventi K migliori del WT

D

facendo uno screening ottenendo così una quantità ipotetica di varianti che dovremmo saggiare ulteriormente

perché utilizzando hGH legati all fago otterremo dati non veritieri ed è per questo che è stato introdotto il

senza fago helper e senza il tRNA soppressore ottengo solo l’hGH che

codone stop. Infettando quindi un coli

posso usare per i saggi di screening. Grazie al fagemide posso poi conoscere la sequenza amminoacidica

delle varianti di hGH di interesse cioè con una K migliore del WT.

D

La tecnica di Phage display segue il seguente schema:

 la proteina è legata al capisde

 il recettore è immobilizzato sulla capsula petri

 faccio interagire le proteine con i recettori e seleziono solo i fagi che hanno espresso proteine che si

sono legate al recettore.

 Ripeto la procedura con i fagi legati per controllo, e se alzo la T posso ottenere quelli che si legano

meglio.

 Sequenzio le variante legate.

Nel caso dell’hGH abbiamo qualcosa di + specifico perché sappiamo già che si lega al sua recettore, quel che

volevlamo era screenare varianti che si legavano meglio del WT e quindi quel che si fa è :

 Legiamo innazzitutto tutte le varianti e facciamo dei lavaggi in modo da eliminare già quelli che si

legano male.

 Stacco le proteine legate abbassando il pH per un brevissimo tempo.

 Ottengo tutti quei fagi che sono in grado di legarsi al recettore, quindi ci sono tutti i tipi di hGH si quelli

che si legano bene che si legano male o meglio del WT.

 Faccio rilegare le proteine e rilavo

 Faccio staccare le proteine in modo + blando sfruttando hGH WT, questa entrerà in competizione con

le varianti legate e se trova varianti legate peggio del WT si sostituirà ad esse.

 Quel che rimane legato sono varianti che si legano meglio del WT o che sono ugali ad esso.

 Stacco i fagemidi e faccio esprimere la proteina hGH non fusa e saggio la sua affinità ottenendo dati +

affidabili rispetto a quelli dell’hGH fusa.

Le varianti vengono generate in base a quel che si sà sulla proteina da saggiare, e quando è stato fatto il

che i residui di interesse erano situati sull’elica 4 in particolare i residui n°172,174,176

phage display si sapeva

e 178. Un’ulteriore zona di variabilità era nell’elica 1 in posizione 10,14,18 e 21. Quindi l’approccio degli

scenziati fu quella di fare mutagenesi localizzata su questi residui che avevano importanza e fecero

mutagenesi a cassetta. In ogni posizione fu effettua una mutazione a saturazione a 32 varianti. I risultati:

Dopo di ciò si sono saggiate le varianti ottenendeo:

Tutti i risultati aventi una K minore del WT in grassetto vuol dire che abbiamo ottenuto il mutante che ci

D

interessa. Sono state fatte + library per abbassare la possibilità di perdere varianti ottimali quindi sono state

fatte 3 library per identificare meglio le varianti. 5/11/14

L’hGH oltre a legare il suo recettore lega anche il recettore della prolattina e diversi studi hanno evidenziato

che la superficie di intereazione per il recettore dell’ormone della crescita e per la prolattina sono simili ma non

completamente uguali nel senso che sono sovrapposte ma non coincidono.Questa informazione è una

informazione ottenuta in modo indiretto perché derivano da analisi mutazionali, e queste informazioni sono

parziali perché otteniamo informazioni su siti importanti per il legame ma ci perdiamo tutti i residui he

interagiscono ma che non hanno effetti rilevanti nel legame.

La superficie di interazione è definibile come tutti i residui di una proteina che interagiscono con la proteina

partner. A questa superficie devo fare studi strutturali il cui miglior metodo è quello di formare un complesso

e di fare sul complesso un’analisi cristallografica a raggi X,e

proteina-recettore studi di mutagenesi già

spiegati, quest’ultimi ci permettono di identificare l’epitopo funzionale, ovvero i residui importanti per l’affinità di

legame, mentre i primi studi ci consentono di individuare l’epitopo strutturale.ovvero l’epitopo funzionale + tutti i

residui che sono coinvolti nel legame ma che quando convertiti in alanina non danno effetti.

Il fatto che l’epitopo funzionale dell’hGH con il suo ormone della crescita è parzialmente sovrapponibile con

quello che ha con il recettore della prolattina ci porta a dire che nel momento in cui lega uno dei due recettori

l’altro non può legare l’ormone quindi lega un recettore alla volta.

Per verificare ciò si è fatto un saggio di interazione ovvero un metodo per identificare quando una proteina A

lega e forma un complesso con il recettore B o il recettore C. Ci sono diversi modi per farlo ma classicamente

si usa una delle due proteine marcata e valutare il legame in termini quantitativi al complesso.

Immobilizzo su piastra petri il recettore, l’hGH marcato interagisce e se interagisce si lega e formando un

complesso, dopo opportuni lavaggi posso saggiare quanto si è legato misurando la fluorescenza o la

radioattività, dipende come ho marcato l’ormone. Queste analisi però non si fanno su piastra petri ma in

multiwell (multipozzetto) in modo da ottimizzare i tempi. Quel che si ottiene è un grafico dove abbiamo

sull'asse delle Y la radioattività e sull’asse delle X la quantità di hGH, otteniamo una curva simile a quella di

michaelis menten dove la radioattività sale sino ad arrivare ad un platò che corrisponde alla sturazione dei

recettori. Sulla base di questa curva si può calcolre la costante di dissociazione ovvero la concentrazione dove

si ha il 50% del legame massimale. Un’alternativa a questa tecnica è lo schetcher blot dove si usa una

quantità fissa di hGH marcato e man mano si aumenta la quantià di hGH non marcato, questi devono

competere essendo la stessa molecola ma l’hGH non marcata quando giunge ad alte concentrazione lega il

recettore in modo preferenziale.

Se non si volesse marcare la proteina ed effettuare comunque studi sul legame sono le tecniche label free ed

una di queste tecniche è la tecnica biacol ovvero una specifica macchina che utilizza come metodo la


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Drathir

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie
SSD:
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Drathir di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biochimica per le Biotecnologie e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Milano Bicocca - Unimib o del prof Vanoni Marco.

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