Biochimica - Infermieristica

PCR

Questa duplicazione del DNA fu sperimentata negli anni '80 anche in vitro cercando di riprodurre in una provetta ciò che succedeva dentro la cellula. Fu inventata una nuova tecnica che prende il nome di reazione a catena della polimerasi o PCR. La PCR viene utilizzata per amplificare i frammenti di DNA.

Nella provetta viene inserito il doppio filamento di DNA; sottoposto a calore i ponti idrogeno tra le basi si degradano e quindi la doppia elica si apre. Successivamente viene inserito nella provetta un innesco già sintetizzato, aggiungo la DNA polimerasi e comincia a polimerizzare.

Applicazioni della PCR:

• In medicina viene utilizzata nel settore diagnostico, utilizzando primer specifici si può identificare la presenza di virus o batteri. Ad esempio può essere identificata la presenza del virus della immunodeficienza umana (HIV).
• Permette di identificare mutazioni a carico del genoma e quindi di prevenire, con l'uso di terapie specifiche, eventuali

di restrizione. Una volta che il frammento di DNA è stato inserito nel plasmide, questo viene inserito in una cellula ospite, come ad esempio un batterio. La cellula ospite replicherà il plasmide e produrrà la proteina codificata dal frammento di DNA inserito. La tecnica dell'ingegneria genetica ha molte applicazioni, tra cui la produzione di farmaci, come l'insulina. Inoltre, può essere utilizzata per modificare geneticamente piante e animali, al fine di ottenere caratteristiche desiderate, come ad esempio una maggiore resistenza alle malattie o una migliore resa agricola. L'ingegneria genetica solleva anche questioni etiche e di sicurezza, poiché può avere conseguenze impreviste sull'ambiente e sulla salute umana. È quindi importante regolamentare attentamente l'uso di questa tecnologia e condurre studi approfonditi sugli effetti a lungo termine.direstrizioni che tagliano il DNA per far inserire il DNA esogeno. Si crea così la molecola di DNA ricombinante. Il plasmide ha varie caratteristiche tra cui la resistenza all'ampicillina. Per verificare la ricombinazione metto il plasmide dentro ad un batterio che crescerà in un terreno in cui è presente tale antibiotico per avere la certezza che in quel terreno crescano batteri che hanno quel DNA ricombinante al loro interno, perché non sempre l'inserimento del plasmide in una cellula ha successo. Ad esempio questa tecnica viene utilizzata per far esprimere proteine umane in cellule batteriche per ottenere così proteine umane in grandi quantità senza passare dall'uomo. L'espressione però di questo gene in questo batterio deve essere regolata, attraverso un meccanismo di controllo dell'espressione genica. Tutte le cellule del nostro corpo contengono un DNA identico anche se svolgono funzioni diverse o sono diverse.morfologicamente questo si verifica perché in una cellula viene espresso di più un gene quindi una proteina rispetto ad un'altra cellula grazie ad un meccanismo di controllo. Prendiamo l'esempio dell'operone LacOperone Lac → insieme di geni che mediano il metabolismo del lattosio. Sito O (operatore) → sito in cui si lega una proteina (repressore) che inibisce l'espressione dei geni andando a bloccare la RNA polimerasi. Se è presente il lattosio esso andrà a legarsi al repressore inibendo la sua azione, il repressore non si potrà legare all'operatore e quindi la RNA polimerasi è libera di scorrere lungo il filamento e sintetizzare i geni d'interesse. Se il lattosio non è presente è inutile che avvenga questa via metabolica per questo il repressore si lega all'operatore bloccando la RNA polimerasi. Quindi per fare in modo che la cellula esprima determinati geni gli va dato un induttore chegli diail segnale per l'espressione in questo caso il lattosio. I farmaci che sono stati prodotti con la tecnologia del DNA ricombinante sono molti, tra questi uno dei più importanti è l'insulina (l'insulina è una proteina). Oltre ai farmaci vengono anche prodotti i vaccini tramite questa tecnica, come ad esempio il vaccino per l'epatite B. L'organismo è in grado di sintetizzare nucleotidi, e li degradiamo ogni volta che le cellule muoiono. Sintesi dei nucleotidi Ci sono due tipi di sintesi: - Di recupero; - Ex novo. La sintesi per via ex novo prevede la sintesi delle basi azotate, quindi dell'anello che varia a seconda se si tratta di una purina o di una pirimidina. Le purine sono prodotte sotto forma di ribonucleotidi, quindi attaccate allo zucchero e non di basi azotate libere, mentre le pirimidine prima viene sintetizzato l'anello pirimidinico staccato dallo zucchero, successivamente viene legata allo zucchero. Gli atomi persintetizzare le basi azotate purine vengono presi da vari composti come alcuni residui amminoacidi tra cui l'aspartato, la glicina, la CO proveniente dal ciclo di Krebs, il formiato. Gli atomi per sintetizzare le basi azotate pirimidine provengono dal bicarbonato, ammoniaca, aspartato. Sintesi per via di recupero: quando il nucleotide si degrada, la base azotata invece che andare incontro ad ulteriore degradazione viene recuperata e riattaccata ad un altro zucchero. Ci sono degli enzimi che riattaccano la base azotata ad un nuovo zucchero, prendono il nome di: - Adeninafosforibosil transferasi: riattacca l'adenina al nuovo zucchero attivato. - Ipoxantinaguanina fosforibosil transferasi: riattacca la guanina o la ipoxantina sullo zucchero attivato. Il deficit di quest'ultimo provoca una malattia che è la sindrome di Lesch-nyhan → malattia mortale, comportamenti come la autofagia (si mangiano le mani), disturbi neurologici importanti. Trasformazione diribonucleotidi in deossiribonuceotidi. L'enzima ribonucleotide reduttasi è in grado di trasformare i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi. Nel sito catalitico dell'enzima entra il substrato, ad esempio il nucleotide riboadenilato, dove viene trasformato in prodotto dall'enzima → deossiadenilato. È un enzima allosterico di regolazione, infatti se nella cellula ci sono molti deossiribonucleotidi non è necessario che vengano ancora trasformati i ribonucleotidi, perché i deossiribonucleotidi stessi si legano all'enzima ribonucleotide reduttasi impedendo l'attacco con il substrato andando a inibire questa via metabolica. Il ribonucleotide uridilato viene trasformato in deossiuridilato. Il deossitimidato non esiste come ribonucleotide ma deriva direttamente dal deossiuridilato attraverso un altro enzima che prende il nome di timidilato sintasi. Via metabolica del deossitimidilato (timina, DNA). I folati sono molecole con struttura a doppio.

anello che non sappiamo sintetizzare ma prendiamo dall'alimentazione, si trova un po' in tutti gli alimenti e una loro carenza si verifica in condizioni di digiuno estremo.

La molecola che prende il nome di diidrofolato viene ridotta a tetraidrofolato attraverso una reazione di ossido riduzione in cui si ossida il NADP.

Il tetraidrofolato reagisce con la serina (un amminoacido) e diventa metilen-tetraidrofolato.

Il gruppo metilico (CH ) del metilen-tetraidrofolato viene attaccato al deossiuridilato (uracile,3RNA) facendolo diventare deossitimidilato.

Se questa via metabolica non viene attivata le cellule muoiono perché non possono replicarsi. (meccanismo della chemioterapia per impedire la crescita della neoplasia).

Agenti chemioterapici

La via metabolica di sintesi del deossitimidilato è il bersaglio di molti farmaci chemioterapici, alcuni farmaci agiscono sull'enzima diidrofolato reduttasi impedendo la formazione del tetraidrofolato, altri farmaci agiscono sulla

timidilato sintasi ovvero l'enzima che trasferisce il gruppo metilico sull'uracile per formare la timina. Questi farmaci colpiscono tutte le cellule del nostro corpo ma soprattutto vengono colpite le cellule del sangue, in particolare i globuli bianchi che mediano le difese immunitarie.

Degradazione degli acidi nucleici

Quando una cellula muore i nucleotidi vengono degradati.

Degradazione dei nucleotidi purinici (Adenilato e guanilato)

Prima fase: Distacco del gruppo fosforico → diventano nucleosidi, le basi azotate subiscono anche una perdita del gruppo NH3

Seconda fase: Si stacca lo zucchero ribosio.

Terza fase: La base azotata libera che ha subito delle modificazioni va incontro ad ulteriore degradazione → xantina.

Quarta fase: Degradazione della xantina → acido urico.

L'acido urico è una molecola di scarto che contiene alcuni gruppi amminici che se fossero liberisarebbero tossici (diventerebbero ammoniaca).

L'acido urico passa nel sangue,

viene filtrato nei reni e viene eliminato attraverso l'urina. Le nostre urine contengono anche l'urea che sappiamo deriva dal metabolismo degli amminoacidi ma in parte anche dalla degradazione dei nucleotidi perché quando dalla base azotata si stacca il gruppo NH essendo tossica, questa molecola viene detossificata nel ciclo dell'urea proprio come per il gruppo amminico che si distacca dagli amminoacidi. Si formano anche altre molecole come H2O2 (perossido di idrogeno) che è un radicale libero, una molecola estremamente reattiva che si lega alle molecole come il DNA danneggiandolo. I radicali liberi vengono detossificati grazie al glutatione. In questa via metabolica intervengono due enzimi molto importanti: - Adenosina deaminasi → trasforma l'adenosina in ipoxantina liberando il gruppo amminico. - Xantina ossidasi → trasforma la ipoxantina (adenina senza il gruppo amminico) in xantina e la xantina in acido urico. Questi due enzimi sono

Correlati ad alcune malattie. Malattie che derivano dal catabolismo dei nucleotidi purinici. Alcuni individui (rari) nascono con un deficit dell'adenosina deaminasi, ciò provoca una malattia che è la sindrome immunodeficienza combinata grave (SCID). Nascono bambini che non hanno il sistema immunitario, ciò è dovuto alla mancanza di questo enzima, i nucleotidi purinici se non vengono degradati si accumulano nella cellula, e se nella cellula sono presenti tanti deossiribonucleotidici essi agiscono sulla ribonucleotide reduttasi inibendola impedendo la trasformazione da ribonucleotidi a deossiribonucleotidi. La parte dell'organismo che ne risente di più è il midollo osseo quindi le cellule del sangue che compongono il sistema immunitario. Esiste una terapia che è la terapia genica che consiste nel prendere il gene che manca, viene clonato in un vettore virale, vengono prese le cellule del sistema immunitario attraverso un prelievo.