Biochimica generale e molecolare

Biochimica generale e molecolare

Programma

• Composizione e struttura degli amminoacidi, emoglobina e proteine: mioglobina; meccanismo d'azione degli enzimi: meccanismi catalitici e inibizione;
• Struttura e funzione dei glucidi;
• Struttura e funzione dei lipidi;
• Processi digestivi, concetti base del metabolismo e sua regolazione; energia libera; trasferimento gruppi fosfato; ATP; trasportatori di elettroni (NAD⁺, NADP⁺, FAD); il coenzima A;
• Degradazione e sintesi del glucosio: glicolisi, fermentazione, via del pentosio fosfato e gluconeogenesi;
• Glicogenolisi e sintesi del glicogeno;
• Ciclo dell’acido citrico;
• Fosforilazione ossidativa;
• Metabolismo degli acidi grassi;
• Metabolismo degli amminoacidi.

Introduzione

La biochimica si occupa dello studio della chimica degli esseri viventi, cercando di comprendere la vita in termini molecolari. Possiamo suddividere lo studio della biochimica in due ambiti:

• Lo studio della relazione tra la struttura e la funzione delle macromolecole (proteine, lipidi, carboidrati); per esempio, una proteina può avere milioni di funzioni, la cui funzione sarà decretata dalla sua forma tridimensionale;
• Lo studio del metabolismo, cioè l’insieme delle relazioni che hanno luogo all’interno delle cellule, che consentono di “fare l’economia” del nostro organismo.

Le molecole biologiche sono costituite da un numero limitato di elementi: il 97% del peso secco della cellula è costituito da C, H, O, N. Tuttavia, sono presenti anche i microelementi che, pur essendoci in quantità infinitesimali, sono importanti per la cellula. Questi elementi, in qualche modo, si sono associati a formare molecole sempre più complesse con dei gruppi funzionali, fondamentali per la loro reattività. Con l’evoluzione si è passati da molecole semplici a molecole più complesse, a polimeri, che stanno alla base delle funzioni svolte dalla cellula.

1. Proteine

Le proteine mediano la gran parte dei processi cellulari e svolgono un numero enorme di funzioni: enzimi, ormoni proteici, anticorpi, proteine contrattili, proteine strutturali, trasportatori, etc. Sono le macromolecole biologiche più abbondanti, presenti in tutti i tipi di cellule. La varietà di proteine presenti nella cellula nasce dalla combinazione di 20 amminoacidi, i quali differiscono per una sola caratteristica, ovvero il gruppo R; la sommatoria dei gruppi R determina la struttura tridimensionale della proteina.

Amminoacidi

Tutti i 20 amminoacidi standard hanno la stessa struttura generale: sono costituiti da un gruppo carbossilico e un gruppo amminico legati allo stesso atomo di carbonio (il carbonio α) e differiscono tra di loro per la catena laterale, il gruppo R, che si differenzia per struttura, dimensioni e carica. Sono tutti α-amminoacidi, ovvero il gruppo amminico è legato al carbonio in posizione α. In tutti gli amminoacidi, il carbonio α è asimmetrico (centro chirale, otticamente attivo), avendo tutti e 4 i sostituenti differenti; l’unico amminoacido che fa eccezione è la glicina, il cui gruppo R è un altro atomo di H.

I 4 gruppi differenti possono disporsi nello spazio in due modi diversi, quindi per ogni amminoacido sono possibili due forme stereoisomeriche: gli enantiomeri. Possiamo avere due forme per ogni amminoacido:

• Il gruppo NH₃⁺ si trova alla sinistra del COO^- (L);
• Il gruppo NH₃⁺ si trova alla destra del COO^- (D).

Le proteine sono costituite esclusivamente da amminoacidi L e non una miscela racemica contenente entrambi gli isomeri: questo perché gli amminoacidi nella forma L sono più solubili.

Classificazione degli amminoacidi in base al gruppo R

Le proteine, nella loro totalità, presentano una carica, tant’è che possono essere definite come macromolecole anfotere, e la loro carica è legata alla sommatoria delle caratteristiche dei gruppi R degli amminoacidi che le costituiscono.

Il gruppo R differisce per:

• Dimensione
• Struttura
• Carica
• Idrofobicità
• Reattività
• Capacità di formare legami H

I gruppi R di questa classe di amminoacidi sono alifatici non polari e quindi idrofobici. Le catene laterali dell’alanina, valina, leucina e isoleucina tendono a raggrupparsi all’interno delle proteine, stabilizzando la struttura proteica tramite interazioni idrofobiche. La minuscola catena laterale della glicina non contribuisce alla formazione di interazioni idrofobiche. La metionina, contenente zolfo, ha un gruppo tioetere non polare. La prolina ha una catena laterale idrocarburica la quale ciclizza, legando il gruppo amminico. Tale tendenza a ciclizzare caratterizza la conformazione della prolina (se analizzo delle proteine e vedo una struttura a gomito, capisco che è una prolina). Avrà una struttura rigida.

I gruppi R di questi amminoacidi sono più polari, non carichi di quelli non polari, contenendo gruppi funzionali che formano legami H con l’acqua. La loro polarità è data da diversi fattori. La polarità della serina e della treonina è dovuta al gruppo OH, mentre quella dell’asparagina e della glutammina ai gruppi ammidici. Un amminoacido particolare è la cisteina di modesta polarità, la quale presenta un residuo di zolfo che ad un’elevatissima reattività. La cisteina si ossida molto facilmente, formando dimeri chiamati cistine, legati da un ponte di solfuro. I residui di cisteina uniti da un ponte disolfuro sono molto idrofobici; tali ponti stabilizzano la struttura di molte proteine, formando un legame covalente tra parti di una stessa proteina o tra proteine diverse (quindi intervengono nel ripiegamento della proteina).

I tre amminoacidi fenilalanina, tirosina e triptofano sono relativamente idrofobici. La tirosina ed il triptofano sono più polari della fenilalanina, a causa del gruppo OH della tirosina e del N del triptofano. Inoltre, essendo delle sostanze cromofore, sono capaci di assorbire la luce UV, caratteristica sfruttata dai ricercatori.

Gli amminoacidi che presentano una carica netta positiva (basici) a pH 7 sono: la lisina con un secondo gruppo amminico nella posizione ε, l’arginina, con un gruppo guanidinico positivo, e l’istidina, con un gruppo imidazolico aromatico; sempre l’istidina, è l’unico amminoacido comune con gruppo R ionizzabile a pH fisiologico, caratteristica che gli permette di agire da catalizzatore in molte reazioni agendo da donatore o accettore di protoni.

Sono due gli amminoacidi con un gruppo R negativo a pH 7, l’aspartato e il glutammato, ognuno dei quali presenta un secondo gruppo COO^-. IMPORTANTE: i gruppi R che presentano un secondo gruppo amminico o un secondo gruppo carbossilico, potendosi ionizzare anche a pH fisiologici, possono dar luogo a delle interazioni ioniche.

In una proteina ripiegata e quindi attiva, gli amminoacidi non polari (idrofobici) si posizioneranno all’interno delle proteine solubili e sulla superficie delle proteine che interagiscono con i lipidi; mentre gli amminoacidi polari (idrofili) si posizioneranno sulla superficie e all’interno delle proteine associate alla membrana.

Essenziali e non essenziali

Di questi 20 amminoacidi, 8 di essi vengono detti essenziali, 12 non essenziali. La differenza tra amminoacidi essenziali e non consiste principalmente nel fatto che gli essenziali, al contrario dei non essenziali, non possono essere sintetizzati dalle nostre cellule, quindi devono essere introdotti con la dieta. Le proteine che contengono almeno un amminoacido essenziale sono dette proteine ad alto valore biologico, mentre quelle che non li contengono a basso valore biologico.

• Essenziali: Fenilalanina, Isoleucina, Istidina, Leucina, Lisina, Metionina, Treonina, Triptofano, Valina
• Non essenziali: Alanina, Arginina, Asparagina, Aspartato, Cisteina, Glicina, Glutammato, Glutammina, Prolina, Serina, Tirosina

Le catene laterali dei residui amminoacidi delle proteine possono essere modificate covalentemente: alcuni amminoacidi e i loro derivati fungono da ormoni e molecole regolatorie. Ad esempio, nel collagene è frequente incontrare la 4-idrossiprolina e la 5-idrossilisina, ottenute tramite l’idrossilazione rispettivamente della prolina e lisina. Nella miosina, proteina contrattile del muscolo, è presente la metillisina.

Alcuni amminoacidi possono essere modificati transitoriamente per regolare la funzione della proteina, ad esempio fosforilandoli, come la serina (fosfoserina), la treonina (fosfotreonina) e la tirosina (fosfotirosina). L’ornitina e la citrullina sono a tutti gli effetti degli amminoacidi, pur non facendo parte dei 20 amminoacidi costituenti le proteine; esse, infatti, sono degli intermedi nella biosintesi dell’arginina nel ciclo dell’urea.

Peptidi

Due amminoacidi possono legarsi covalentemente, tramite un legame chiamato legame peptidico, che avviene per condensazione (ovvero per perdita di una molecola d’acqua). Tale legame è covalente, essendo un legame molto forte. Le proteine possono essere denaturate, ovvero è possibile far perdere alla proteina la struttura tridimensionale e quindi la sua capacità biologica, ma senza rompere i legami peptidici. Alla fine della reazione di condensazione il peptide presenterà le estremità N-terminali e C-terminali libere: tali estremità hanno un ruolo biochimico fondamentale. Tre amminoacidi possono essere uniti tra loro per formare un tripeptide; quattro amminoacidi generano un tetrapeptide e così via. Quando il numero degli amminoacidi è relativamente piccolo la struttura viene detta oligopeptide; se gli amminoacidi sono tanti, il prodotto viene chiamato polipeptide.

È importante sottolineare che anche i peptidi più piccoli possono avere importanti effetti biologici, come ad esempio il dipeptide L-aspartil-L-fenilalanina metil estere, meglio conosciuto come aspartame. Il peso medio di un amminoacido è di 110 dalton.

Struttura delle proteine

Ciò che rende una proteina un enzima, un ormone o una proteina strutturale è l’architettura con la quale viene costruita: quindi dipende dalla sua struttura. La struttura delle proteine può essere descritta a vari livelli di complessità, seguendo una sorta di gerarchia. In genere vengono definiti quattro livelli:

1. Struttura primaria: costituita da sequenza amminoacidica legata da legami peptidici e/o ponti disolfuro. La struttura primaria è il primo fattore a determinare la funzione della futura proteina, funzione dettata dalla sequenza nucleotidica;
2. Struttura secondaria: i peptidi risultanti possono disporsi secondo delle strutture regolari e ripetute, definite α-elica e foglietto β, che dipendono dalla disposizione e dalle interazioni (generalmente legami H) tra gli amminoacidi adiacenti;
3. Struttura terziaria: è la forma tridimensionale della proteina, forma in cui la proteina è biologicamente attiva. Tale struttura non dipenderà dalla disposizione dei residui ma terrà conto delle interazioni tra i gruppi R a lungo raggio nella sequenza amminoacidica;
4. Struttura quaternaria: se una proteina è costituita da più subunità proteiche (proteine terziarie, ripiegate), la sua struttura è definita quaternaria. Non tutte le proteine presentano la struttura quaternaria, ma è più comune riscontrarla negli enzimi e nell’emoglobina.

Una proteina tipica ha solitamente una o più strutture tridimensionali stabili che riflettono la sua funzione. La struttura di una proteina è stabilizzata da diverse interazioni deboli, come le interazioni di van der Waals, legami idrogeno, effetti idrofobici e interazioni ioniche. In particolare, gli effetti idrofobici contribuiscono, oltre alla stabilità, alla posizione degli amminoacidi nelle proteine: le catene laterali idrofobiche degli amminoacidi tendono a raggrupparsi all’interno delle proteine, lontane dall’acqua, formando il nucleo idrofobico della proteina. Anche i legami covalenti di tipo non peptidico, come i ponti disolfuro, hanno un ruolo fondamentale nella stabilizzazione di alcune proteine.

1. Struttura primaria

La struttura primaria di una proteina è dettata dal gene ed è costituita da una sequenza amminoacidica legata tramite legami peptidici. Pur essendo una struttura abbastanza semplice, è di fondamentale importanza. Innanzitutto, la struttura tridimensionale della proteina dipende dalla sua struttura primaria, determinandone anche il meccanismo d’azione e la funzione biologica: se si altera la struttura primaria, si altera anche la sua funzione. Non a caso, proteine che svolgono funzioni diverse hanno sequenze amminoacidiche diverse. In secondo luogo, migliaia di malattie genetiche dell’uomo sono dovute alla produzione di proteine difettose. Conoscere la struttura primaria, inoltre, è di fondamentale importanza per noi scienziati per capire come silenziare o attivare una proteina attraverso dei farmaci.

Legame peptidico

Il legame peptidico è il legame più stabile presente nella proteina, soprattutto a causa della presenza di una forma di risonanza. Sono legami privi di carica dato che le cariche sono state neutralizzate durante la reazione di condensazione. Inoltre, nel realizzare il legame peptidico esistono due possibilità: gli amminoacidi possono trovarsi in posizione cis o trans. Generalmente, tutti gli amminoacidi si trovano in conformazione trans, tranne la prolina, per questioni steriche.

Le peculiarità del legame peptidico, però, è il fatto di essere estremamente rigido e planare. La rigidità è dovuta alla lunghezza del legame peptidico, il quale ha una lunghezza di legame intermedia tra il doppio legame e il legame semplice (parziale carattere di doppio legame). Questa particolarità è giustificata dalla presenza, appunto, di una forma di risonanza o di una parziale condivisione di due coppie di elettroni tra l’ossigeno carbonilico e l’azoto ammidico. La rigidità del legame comporta anche un carattere planare, che limita la libertà di rotazione della catena polipeptidica. L’unico punto di rotazione è il carbonio α. Lo scheletro della catena polipeptidica può quindi essere considerato come una serie di piani rigidi in cui i piani consecutivi hanno in comune un punto di rotazione, in corrispondenza del Cα.

La conformazione del peptide e la limitata libertà di rotazione è definita da due angoli, detti angoli di torsione, chiamati φ (phi) e Ψ (psi): phi è l’angolo di torsione tra N-Cα mentre psi è l’angolo di torsione tra C-Cα. In linea di principio, psi e phi possono avere qualsiasi valore compreso tra -180° e +180°, ma molti valori non sono permessi a causa degli impedimenti sterici tra gli atomi dello scheletro carbonioso e le catene laterali degli amminoacidi. I valori permessi sono riportati nel grafico di Ramachandran: prevede le possibili conformazioni peptidiche in base ai valori degli angoli di torsione. Osservando il grafico, si nota che 3/4 delle possibili conformazioni non possono esistere a causa degli impedimenti sterici.

La rigidità del legame peptidico e il limitato possibile valore degli angoli di torsione restringe il numero di strutture possibili tali per cui la proteina possa assumere la struttura tridimensionale e quindi biologicamente attiva.

2. Struttura secondaria

L’espressione struttura secondaria si riferisce ad un segmento polipeptidico della proteina e descrive una struttura stabile in cui gli amminoacidi si dispongono in modo regolare. Una struttura secondaria si ha quando gli angolo di torsione φ e Ψ mantengono valori stabili. La struttura secondaria descrive l’organizzazione spaziale di un segmento polipeptidico senza coinvolgere gli effetti dei gruppi R.

Le possibili disposizioni sono varie, ma principalmente possono essere α-elica e β-foglietto. È possibile che due strutture secondarie siano collegate tra loro da anse e ripiegamenti. Sono molto più comuni i ripiegamenti, che presentano spesso residui di glicina e prolina; i primi in quanto hanno una struttura piccola e flessibile, i secondi perché i legami peptidici che coinvolgono l’azoto della prolina assumono facilmente la conformazione cis, particolarmente adatta ai ripiegamenti. La struttura secondaria viene determinata principalmente dai legami idrogeno tra l’NH e il COO^- del legame peptidico: l’NH si comporta da donatore di elettroni, mentre il COO^- si comporta da accettore.

L’α-elica è la struttura che garantisce il maggior numero di legami idrogeno e rende, quindi, il segmento polipeptidico più stabile e resistente. I legami idrogeno si formano tra l’atomo di idrogeno dell’NH di un legame peptidico e l’atomo di ossigeno del COO^- del quarto amminoacido successivo nell’estremità amminica. Ciascun legame idrogeno interagisce con 4 atomi adiacenti, conferendo stabilità all’elica. L’α-elica è avvolta in senso destrorso e ciascun giro dell’elica è lungo circa 3.6 amminoacidi.