Biochimica e biologia molecolare - respirazione mitocondriale

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HO+ ..O COOH O COOH COOHCH2C CCH COOH CH COOH2 2Acetil-CoA e ac.ossalacetico Enolo dell'acetil-CoA Citril-CoA– – 14Prof. Mauro Tonellato ITIS Natta Padova respirazione cellulareOCoA S C H-AA COOHCH3 2+CH2 C COOHHOAA C COOHHO COOHCH2CoA-SHH OCOOHCH 22Citril-CoA acido citrico1) L'acetil-CoA viene convertito per tautomeria nell'enolo attraverso una catalisi acido baseèconcertata. La funzione del legame tioestere col coenzima A quella di permettere laenolizzazione del gruppo acetilico. Se l'acido acetico avesse il carbossile libero non potrebbe+ 20tautomerizzare per la presenza dell'H sul carbossile che risulta 10 volte più acido di quello inalfa. O OCH C CH C2 2O S CoA O Hα αH HH acido pK = 25 pK = 4,7H H molto più acidoa a2) L'enolo dell'acetil-CoA porta un attacco nucleofilo al carbonile dell'acido ossalacetico con unacatalisi acido base concertata. Il prodotto della reazione, il citril-CoA, resta

legato all'enzima.è

3) Il citril-CoA viene idrolizzato ad acido citrico e CoA-SH. Questa idrolisi fortemente esotermica,∆G°'= -7,5 Kcal/mole, e fornisce la spinta termodinamica a tutta la reazione.

Tappa n° 3: isocitrato deidrogenasi

L'enzima isocitrato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa dell'acido isocitrico adαacido -chetoglutarico e produce la prima molecola di CO del ciclo e la prima molecola di NADH.

La reazione procede in due stadi. Nel primo il NAD ossida l'acido isocitrico ad acido ossalo-βsuccinico che resta legato all'enzima. Nel secondo stadio l'acido ossalosuccinico, un -chetoacido,2+viene decarbossilato in presenza di Mn come cofattore.

-chetoglutarico acido

-chetoglutarico–

– 15Prof. Mauro Tonellato ITIS Natta Padova respirazione cellulare

Terzo stadio della respirazione cellulare

Fosforilazione ossidativa

Nel terzo stadio della respirazione cellulare si ha l'ossidazione, ad opera dell'ossigeno molecolareO , dei coenzimi ridotti NADH e FADH prodotti nella glicolisi, nella decarbossilazione ossidativa e2 2nel ciclo di Krebs. Le reazioni sono le seguenti: ∆→+ +2 NADH + O + 2 H 2 NAD + 2 H O G°' = -105,2 Kcal/mole22 ∆→2 FADH + O 2 FAD + 2 H O G°' = - 79,3 Kcal/mole2 2 2 ∆ è(∆G°' indica la variazione di energia libera in condizioni di attività unitaria a pH 7, mentre G°∆riferito a pH 0). Queste reazioni sono fortemente esotermiche. L'energia libera G°' non vieneèdispersa come calore, ma utilizzata in una reazione parallela di fosforilazione che produce ATPda ADP e fosfato inorganico. ∆→+ADP + P + H ATP + H O

G°' = +7,3 Kcal/molei 2è La reazione complessiva quindi chiamata fosforilazione ossidativa. Gli elettroni che vengono ceduti dal NADH e dal FADH giungono all'ossigeno attraverso una serie2di molecole trasportatrici di elettroni chiamate nel loro insieme catena respiratoria. Sia lacatena respiratoria che la fosforilazione sono localizzate nella membrana interna dei mitocondri. La decarbossilazione ossidativa, il ciclo di Krebs e la via di ossidazione degli acidi grassi, cheproducono la maggior parte del NADH e del FADH , sono localizzate nella matrice mitocondriale a2ridosso delle strutture respiratorie. L'ossidazione di una molecola di NADH produce tre molecole di ATP, mentre quella di unamolecola di FADH produce solo due molecole di ATP.2 Il trasferimento degli elettroni ceduti dal NADH e dal FADH all'ossigeno molecolare lungo la2+catena respiratoria provoca uno spostamento di ioni H dalla matrice verso lo spaziointermembrana. Si genera in questo modo ungradiente di pH tra i due lati della membrana interna dei mitocondri. Le molecole di ATP vengono prodotte quando gli ioni H+ tornano nella matrice attraverso un complesso enzimatico. Per concludere, l'ossidazione e la fosforilazione sono processi accoppiati per mezzo di un gradiente di ioni H+ creato a cavallo della membrana interna mitocondriale.

+H+   e-   NAD+   H+   O   O   ADP   +   P   ATP
NADH   +   H+   2   2   iMatrice
Membrana interna   Spazio intermembrana

Struttura schematizzata di un mitocondrio

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Catena respiratoria La fosforilazione ossidativa ricorda da vicino il funzionamento di una pila, infatti riesce a utilizzare l'energia liberata dalla ossidazione di NADH e FADH per la fosforilazione di ATP. 2 Per realizzare una pila si fanno avvenire le due semireazioni di ossidazione e di riduzione in due recipienti diversi uniti da un ponte salino e collegati da un filo elettrico attraverso il quale si trasferiscono gli elettroni dalla

semireazione dove avviene l'ossidazione all'altra. In questo modo l'energia libera della reazione viene trasformata in energia elettrica che può essere utilizzata per azionare un motore elettrico.

Nei mitocondri si realizza qualcosa di simile: NADH e O non reagiscono direttamente tra loro, ma le due semireazioni avvengono in posti diversi e gli elettroni vengono trasferiti dalla semireazione di ossidazione del NADH a quella di riduzione dell'O attraverso una serie di molecole trasportatrici di elettroni, la catena respiratoria, che si comporta come un filo elettrico. Il flusso di elettroni compie un lavoro chimico trasferendo ioni H da un lato all'altro della membrana interna dei mitocondri.

La catena respiratoria è costituita da quattro complessi proteici che contengono gruppi prostetici redox saldamente legati. Gli elettroni vengono trasferiti da un gruppo redox al successivo attraverso potenziali via via crescenti compresi tra -0,32V della coppia NAD

NADH e +0,82V della coppia O /H O. Solo i complessi 1, 3 e 4 sono in grado di generare il flusso di ioni H e per2 2questo sono chiamati pompe protoniche.

Gli elettroni vengono trasferiti dai complessi 1 e 2 al complesso 3 attraverso il coenzima Q e dal complesso 3 al complesso 4 attraverso una proteina posta sulla superficie della membrana, il citocromo c. Il seguente schema può chiarire il processo.

Complesso 1 Complesso 2 Complesso 3 Complesso 4
+ +2H 4H +2H
Spazio Cit c intermembrana Cit c Cit c
1Fe-S Q Cit b Cit a Cu
562 A Membrana Q interna FMN Fe-S Cit a Cu
Cit b BQ 3Fe-S Fe-S 566 FAD
Matrice 2e- 2e- 2e-
+4H +H+ + −12a.fumarico a.succinico
NADH + NAD O + 2H H O2 2

I potenziali redox E°' dei componenti della catena respiratoria sono i seguenti:

• NAD -0,32V
• FMN ?
• Complesso 1 Fe-S -0,30V
• FAD -0,04V
• Complesso 2 Fe-S -0,03V
• CoQ +0,04V
• Cit b +0,03V
• Complesso 3 Fe-S +0,28V
• Cit c +0,21V
• 1Cit c +0,23V
• Cit a +0,21V
• Cu +0,25V
• Complesso 4 Cu +0,34V
• B Cit a +0,38V
• 3O +0,82V
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Riportando in grafico questi valori si osserva che ci sono solo tre passaggi lungo la catena respiratoria che presentano sufficiente differenza di potenziale da permettere sia di trasferire elettroni sia di spostare ioni H contro gradiente di concentrazione per promuovere la sintesi di ATP. Questi salti di potenziale avvengono in corrispondenza dei tre complessi 1, 3 e 4 e sono evidenziati con delle frecce nella figura.

E°(V) O+0.8 2+0.6+0.4 a 3CuBFe-S Cuc a Ac+0.2 1Complesso 2 Q Complesso 4b0.0 Fe-SFAD Complesso 3-0.2 FMN Fe-SNAD Complesso 1-0.4 Flusso di elettroni

Complesso 1 è il complesso 1, la prima delle tre pompe protoniche, chiamato NADH - CoQ reduttasi perché catalizza il trasferimento di elettroni dal NADH al coenzima Q. Contiene due tipi di sistemi ossidoriduttivi: una molecola di FMN, flavin mononucleotide, e alcuni centri ferro-zolfo, cioè proteine che contengono atomi di ferro non-eme complessati con

Atomi di zolfo. Descriveremo in questo paragrafo anche il NADH e il Coenzima Q, i gruppi redox che interagiscono a monte e a valle col complesso 1.

NAD, nicotinammide adenin dinucleotide, è il NAD il coenzima di ossidoriduzione che, assieme al FAD, ha la funzione di raccogliere tutti gli equivalenti riducenti prodotti dalla ossidazione dei substrati organici. Il centro redox del NAD è la nicotinammide, o vitamina PP, che può accettare uno ione idruro in posizione 4. La reazione è la seguente: H- + NAD+ → NADH + H+

FMN, flavin mononucleotide, è l'FMN un gruppo prostetico simile al FAD, ma privo di AMP adenosin monofosfato. Il precursore del FMN e del FAD è la riboflavina o vitamina B2 che differisce dal FMN solo per la mancanza del gruppo fosfato legato al ribitolo. Come il coenzima Q, illustrato più avanti, l'FMN può scambiare sia uno che due elettroni per volta, questo è possibile perché

isonanza La respirazione cellulare è un processo che avviene all'interno delle cellule e consiste nella produzione di energia attraverso la conversione di sostanze organiche in anidride carbonica e acqua. Durante questo processo, si verificano diverse reazioni di ossidazione e riduzione che coinvolgono varie molecole. Una delle molecole coinvolte nella respirazione cellulare è il semichinone, che può esistere in una forma ossidata e in una forma ridotta. Inoltre, può anche assumere uno stato di ossidazione intermedio. Il semichinone è un radicale libero stabilizzato per risonanza. Nella catena respiratoria, il flavin mononucleotide (FMN) e la coenzima Q (CoQ) svolgono un ruolo importante come ponti tra il donatore a due elettroni, il NADH, e gli accettori a un solo elettrone, i citocromi del complesso 3. Questi accettori scambiano un solo elettrone per volta. La figura seguente mostra la struttura del semichinone e del radicale libero stabilizzato per risonanza: Come si può osservare, il semichinone presenta una forma semichinonica, mentre il radicale libero è stabilizzato per risonanza. Queste caratteristiche consentono al semichinone di svolgere il suo ruolo nella catena respiratoria.