Biochimica e biologia molecolare - respirazione mitocondriale

RESPIRAZIONE CELLULARE

Introduzione

Con il termine respirazione solitamente si intende il processo fisiologico macroscopico che

consiste nella assunzione di O e nel rilascio di CO da parte di organismi multicellulari. In

2 2

biochimica si usa il termine respirazione in senso microscopico per riferirsi ai processi molecolari

che implicano consumo di O e formazione di CO da parte della cellula. La respirazione cellulare

2 2

può essere schematizzata come in figura ed avviene in tre stadi principali.

amminoacidi

glucosio 6 H O

acidi grassi 2

NAD+

2

2 ADP

glicolisi catena

2 ATP 2 NADH respiratoria

2 acido piruvico 2 FAD 4 ATP

NAD+

2 2 FADH 4 ADP

decarbossilazione 2 fosforilazione

ossidativa 2 CO 2 NADH ossidativa

2 +

10 NAD 30 ATP

2 acetil CoA 10 NADH 30 ADP

NAD+

6

2 ADP 2 FAD

ciclo di Krebs 2 FADH

6 NADH

2 ATP 2

2 FADH

2 10 NADH

4 CO 6 O

2 2

1) Nel primo stadio le molecole organiche combustibili (glucosio, acidi grassi, alcuni amminoacidi)

vengono trasformate in acetil coenzima A (acetil CoA). In pratica queste molecole vengono

ossidate e spezzate in frammenti di due atomi di carbonio, cioè molecole di acido acetico che

troviamo legate come tioesteri nell'acetil CoA. La degradazione del glucosio in acetil CoA

è

avviene attraverso la glicolisi e la decarbossilazione ossidativa. La glicolisi una catena di

è

reazioni che avvengono nel citoplasma dove il glucosio degradato ed ossidato ad acido

piruvico. L'acido piruvico, poi, entra nei mitocondri dove subisce una decarbossilazione

ossidativa ad acetil-CoA.

2) Nel secondo stadio l'acetil-CoA viene ossidato a CO attraverso il ciclo di Krebs, una serie di

2

reazioni che avvengono nei mitocondri e che liberano equivalenti riducenti sotto forma di ioni

idruro legati ai coenzimi ridotti NADH e FADH .

2

3) Nel terzo stadio vengono ossidati tutti i coenzimi ridotti formati nei primi due stadi: 10 NADH e

NAD+

2 FADH . Questi vengono ossidati a e FAD che possono così

continuare a sostenere le

2

reazioni di ossidazione del glucosio fino a CO nei primi due stadi. NADH e FADH cedono i

2 2

loro elettroni, attraverso una catena di molecole trasportatrici di elettroni, la catena

respiratoria, all'ossigeno molecolare O che viene ridotto ad H O. Durante questo processo di

2 2

trasporto di elettroni una parte dell'energia liberata viene recuperata come energia chimica

sotto forma di ATP in un processo chiamato fosforilazione ossidativa. E' proprio la

produzione di ATP lo scopo fondamentale della respirazione cellulare.

è

La reazione globale una ossidazione completa del glucosio ad opera di O che forma CO , H O

2 2 2

ed energia come una normale combustione. Solo una parte dell'energia liberata viene trasformata

in energia chimica sotto forma di ATP. In totale si ottengono 38 ATP per ogni molecola di glucosio.

C H O + 6 O + 38 ADP 6 CO + 6 H O + 38 ATP

6 12 6 2 2 2

Si ottengono quindi 38 x 7.3 = 277 Kcal/mole. Questo rappresenta un’efficienza del 40%, infatti la

∆G° −686

è è

variazione di energia libera per questa reazione = Kcal/mole e il 40% di 686 277. Si

è è

calcolato però che nella cellula l'efficienza reale circa del 70%, tenendo conto che le

concentrazioni vere sono molto inferiori alle concentrazioni standard 1 M.

– – 1

Prof. Mauro Tonellato ITIS Natta Padova respirazione cellulare

Primo stadio della respirazione cellulare

Glicolisi

Il temine glicolisi (si pronuncia glicò lisi) deriva da due parole greche che significano zucchero e

è è

scissione. La glicolisi una via metabolica pressoché universale dato che presente non solo

negli animali e nelle piante, ma anche nella maggior parte dei microrganismi. La sua universalità e

è

il fatto di essere anaerobica fanno pensare che sia una via metabolica che si sviluppata agli inizi

della vita sulla Terra in organismi procarioti anaerobi che vivevano quando l'atmosfera era

è

ancora povera di O . La glicolisi rimasta poi inalterata durante tutta la storia evolutiva grazie alla

2

sua semplicità ed efficienza.

è

La glicolisi costituita da una sequenza di 10 reazioni che avvengono nel citoplasma e

degradano il glucosio ad acido piruvico in assenza di ossigeno producendo 2 ATP e 2 NADH.

Nella glicolisi si possono individuare due fasi, ciascuna composta di 5 reazioni.

Nelle prime 5 reazioni il glucosio viene spezzato in due frammenti identici di 3 atomi di carbonio,

due molecole di gliceraldeide-3-fosfato. Per realizzare questo obiettivo si devono però

consumare 2 ATP.

Nelle 5 reazioni successive si realizza un guadagno energetico di 2 ATP e inoltre si recuperano i

2 ATP utilizzati nella prima fase. Questo si ottiene sfruttando dapprima l’energia liberata dalla

ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato, poi l’energia cumulata di due reazioni che avvengono

contemporaneamente sull’acido fosfoenolpiruvico: la tautomeria cheto-enolica e l’idrolisi di un

estere fosforico.

La prima fase della glicolisi

Nelle prime cinque reazioni della glicolisi la catena di 6 atomi di carbonio del glucosio deve essere

rotta in due frammenti in modo che poi, nella seconda fase, si possa ricavare energia dalla

ossidazione ad acido delle due aldeidi ottenute. E’ indispensabile che i due frammenti siano

identici e quindi siano di 3 atomi di carbonio ciascuno se vogliamo che sia unica la via metabolica

della seconda fase della glicolisi. Non può quindi essere il glucosio la molecola che viene spezzata

in due frammenti perché questi sarebbero di 2 e 4 atomi rispettivamente, dato che la reazione che

è è

rompe la catena una condensazione aldolica inversa. La strategia obbligata quindi

trasformare il glucosio in fruttosio che, avendo il carbonile sul C2, può essere spezzato in due

è

frammenti di 3 atomi di carbonio. Inoltre ogni frammento deve essere fosforilato perché così

vincolato a restare all’interno della cellula fino alla fine della glicolisi. Le molecole fosforilate non

possono attraversare la membrana cellulare costituita da un doppio strato di fosfolipidi che la

rende negativa in superficie e apolare al suo interno. Questa doppia fosforilazione implica un

consumo di due molecole di ATP nella prima parte e obbliga, nella seconda parte, non solo a

ricavare due ATP nell’ossidazione di un’aldeide ad acido, ma anche a recuperare i due ATP spesi

nella prima parte, al fine di realizzare un vero guadagno energetico.

è

La prima fase della glicolisi costituita quindi dalle seguenti 5 reazioni che, partendo da glucosio,

formano nell’ordine:

1) Glucosio-6-fosfato

2) Fruttosio-6-fosfato

3) Fruttosio-1,6-difosfato

4) Gliceraldeide-3-fosfato + Diidrossiacetone-fosfato

5) Gliceraldeide-3-fosfato

Nelle prime 3 reazioni il glucosio viene fosforilato sul C6 per formare glucosio-6-fosfato (1), poi

questo viene isomerizzato a fruttosio-6-fosfato (2), infine quest’ultimo viene fosforilato sul C1

è

per ottenere fruttosio-1,6-difosfato (3). Questa molecola pronta per essere tagliata, nella

reazione n°4, in due frammenti di tre atomi di carbonio, ambedue fosforilati, di gliceraldeide-3-

fosfato e diidrossiacetone-fosfato (4). Queste due molecole sono isomeri di struttura che

è

vengono interconvertiti uno nell'altro nella reazione n°5. All'equilibrio presente il 4% di

gliceraldeide-3-fosfato e il 96% di diidrossiacetone-fosfato, ma quest’ultimo viene

progressivamente trasformato in gliceraldeide-3-fosfato (5) a mano a mano che questa viene

ossidata nella reazione successiva della glicolisi. In questo modo, per ogni molecola di glucosio

degradata, due molecole di gliceraldeide-3-fosfato entrano nella seconda fase della glicolisi.

– – 2

Prof. Mauro Tonellato ITIS Natta Padova respirazione cellulare

La prima fase della glicolisi

O

H C

H OH

H O H D-glucosio

H OH

H OH

CH OH

2 ATP chinasi

(1) ADP

H O

C

H OH

H O H D-glucosio-6-fosfato

H OH O

H OH

CH O P O

2 O isomerasi

(2) CH OH

2

C O

H O H

H OH D-fruttosio-6-fosfato

O

H OH

CH O P O

2 O

ATP chinasi

(3) O diidrossiacetone-fosfato

ADP P

CH O O

2

C O O

O CH OH

CH O P O 2

2

O

C O aldolasi isomerasi

H O H (4) (5)

H OH H O

O

H OH C O

CH O P O H OH

2 alla seconda fase

O CH O P O

2 O

D-fruttosio-1,6-difosfato D-gliceraldeide-3-fosfato

– – 3

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La seconda fase della glicolisi

è

La seconda fase della glicolisi costituita dalle 5 reazioni finali, dalla 6 alla 10, che, partendo da

gliceraldeide-3-fosfato, formano nell’ordine:

6) Acido 1,3-difosfoglicerico

7) Acido 3-fosfoglicerico

8) Acido 2-fosfoglicerico

9) Acido 2-fosfoenolpiruvico

10) Acido piruvico

Nella seconda fase si realizza il guadagno energetico che rappresenta il vero scopo della

glicolisi. Si formano 4 ATP e, dato che ne erano stati consumati 2 nella prima fase, il guadagno

è

netto di 2 ATP per ogni molecola di glucosio degradata ad acido piruvico. Due ATP vengono

prodotti attraverso le reazioni 6 e 7 sfruttando il sovrappiù di energia che deriva della

ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato. Questa energia viene accumulata sotto forma di legame

anidridico con un fosfato inorganico sul C1 dell’acido 1,3-difosfoglicerico (6). Il trasferimento del

fosfato all’ADP porta alla sintesi di ATP e di acido 3-fosfo-glicerico (7).

O

H C D-gliceraldeide-3-fosfato

2 H OH

CH O P

2 + + 2 Pi

2 NAD

(6) La seconda fase della glicolisi

deidrogenasi

2 NADH

O O P

C acido D-1,3-difosfoglicerico

2 H OH

CH O P

2 2 ADP chinasi

(7) 2 ATP

O OH

C acido D-3-fosfoglicerico

2 H OH

CH O P

2 mutasi

(8) 2 H O O

O

O 2 ATP

OH 2 ADP

OH OH

2 C

C

C 2 2

2 C O P

H O P C O

CH OH CH

CH

enolasi chinasi

2 3

2 (10)

(9) acido 2-fosfoenolpiruvico

acido D-2-fosfoglicerico acido piruvico

Gli altri due ATP vengono prodotti attraverso le reazioni 8, 9 e 10. Si tratta di restituire i due

ATP consumati nella prima fase per fosforilare i carboni 1 e 6 della catena. Questo si realizza

spostando il fosfato dal C3 al C2, trasformando l’acido 3-fosfo-glicerico in acido 2-fosfoglicerico

(8). Questo può essere disidratato formando una specie instabile, l’acido 2-fosfoenolpiruvico (9)

– – 4

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che finalmente attraverso due reazioni combinate di tautomeria cheto-enolica e idrolisi dell’estere

fosforico produce ATP e acido piruvico (10).

è

Oltre al bilancio di ATP importante sottolineare il bilancio di NADH. L'ossidazione compiuta

+

nella tappa (6) comporta il consumo di 2 NAD che vengono ridotti a 2 NADH. Questo ha come

+ è

conseguenza che la glicolisi ha bisogno di un costante apporto di NAD che però presente in

minima quantità nella cellula. Per funzionare, quindi, la glicolisi ha bisogno che un’altra reazione

+

avvenga nello stesso momento per riossidare il NADH a NAD . Questo può avvenire in modi

diversi che rappresentano diversi destini metabolici dell’acido piruvico: i tre più importanti

sono: la respirazione cellulare, la fermentazione lattica e la fermentazione alcolica.

1) Respirazione cellulare. Negli organismi aerobi la glicolisi costituisce solo il primo passo della

respirazione cellulare cioè della ossidazione del glucosio a CO ad opera di O . L’acido

2 2

piruvico prodotto dalla glicolisi viene degradato nei mitocondri attraverso la decarbossilazione

è

ossidativa e il ciclo di Krebs. Perchè queste reazioni possano continuare, necessario che il

+

NADH prodotto venga riossidato a NAD e questo si realizza ad opera dell'ossigeno

molecolare O che si riduce ad H O nella catena respiratoria.

2 2

2) Fermentazione lattica. In condizioni anaerobiche, cioè in assenza di ossigeno, bisogna che

qualche altra molecola funga da ossidante. Lo stesso acido piruvico può essere ridotto ad

+

acido lattico per consentire l'ossidazione del NADH a NAD . Questa seconda via di reazione

dell'acido piruvico si realizza per esempio nel muscolo scheletrico che si contrae

violentemente, in questo caso si parla di fermentazione omolattica. Anche alcuni batteri

anaerobi trasformano il glucosio in acido piruvico e poi questo in acido lattico, questa viene

è

chiamata fermentazione lattica ed responsabile dell'inacidimento del latte nello yogurt.

3) Fermentazione alcolica. In condizioni anaerobiche l'acido piruvico, il prodotto finale della

glicolisi, può essere ridotto con una diversa via metabolica. Alcuni microrganismi anaerobi,

come il lievito di birra, decarbossilano l'acido piruvico ad acetaldeide, poi riducono questa ad

NAD+

etanolo. In questo modo ossidano il NADH a e possono continuare la glicolisi.

acido

glucosio

glucosio glucosio etanolo

H O

2 lattico +

+ + 2 NAD

2 NAD 2 NAD 2 NADH

2 NADH 2 NADH CO 2

acido acido acido acetaldeide

O 2

piruvico piruvico piruvico

respirazione fermentazione fermentazione

cellulare lattica alcolica

... è

Si parla di respirazione se la molecola che fa da ossidante ultimo una molecola inorganica

come O che si riduce ad H O nella respirazione cellulare. In altri tipi di respirazione troviamo altre

2 2 − 2−

molecole inorganiche che fanno da ossidante, per esempio NO che si riduce ad N , SO che si

3 2 4

2− +

riduce a S , CO che si riduce a CH , H che si riduce a H , ecc.

2 4 2 è

Si parla di fermentazione se la molecola che fa da ossidante ultimo una molecola organica

come l’acido piruvico che si riduce ad acido lattico nella fermentazione lattica o l’acetaldeide che si

riduce ad etanolo nella fermentazione alcolica.

– – 5

Prof. Mauro Tonellato ITIS Natta Padova respirazione cellulare

Approfondimento

Le dieci reazioni della glicolisi, costituiscono per il chimico un’occasione ideale per comprendere

che le reazioni enzimatiche non sono da accettare "a scatola chiusa", ma sono delle normali

reazioni di chimica organica che vengono realizzate in modo estremamente sofisticato all’interno

del sito attivo degli enzimi.

Spesso può essere interessante paragonare una reazione enzimatica con la corrispondente

reazione in soluzione come verrebbe realizzata in un laboratorio classico di chimica organica. è

Se la reazione avviene in soluzione, richiede condizioni più drastiche di pH e temperatura ed

è

affidata alla casualità degli urti tra le molecole. Una reazione enzimatica, invece, non lasciata al

caso, ma avviene all’interno di una perfetta macchina chimica, il sito attivo dell’enzima. Qui il

substrato viene legato in modo selettivo e i gruppi funzionali degli amminoacidi gli si avvicinano nel

modo esatto e lo fanno reagire. Esamineremo ora i meccanismi delle reazioni più interessanti.

Meccanismo della reazione 2

In questa reazione l'enzima isomerasi catalizza l'isomerizzazione del glucosio-6-fosfato in

fruttosio-6-fosfato. Il glucosio può essere isomerizzato anche in soluzione se trattato in ambiente

è

basico, questa reazione nota come isomerizzazione alcalina. Sia la reazione enzimatica che

quella in soluzione procedono attraverso lo stesso intermedio enediolo. Nel sito attivo dell'enzima

il glucosio-6-P si trova vicino ad un residuo di istidina e ad uno di lisina. Il meccanismo di forma-

è

zione dell'enediolo il seguente: sito attivo

dell'enzima

AA AA

N

N H

H O H

H

O

..

anello +

+ C

H

C

imidazolico

dell'istidina C OH

H OH H O

H

O OH

OH OH

OH CH O P

CH O P 2

2

glucosio-6-P enediolo

Nella isomerizzazione alcalina in soluzione il glucosio dà luogo a una miscela di equilibrio nella

quale sono presenti tre esosi: glucosio, fruttosio e mannosio. Qui invece, grazie all'enzima,

è

sono in equilibrio solo glucosio e fruttosio, senza formazione di mannosio. Il passaggio chiave

+

la formazione di glucosio dall'enediolo: l'enzima permette l'ingresso dell'H solo da sopra il piano

è

molecolare dove presente l'azoto protonato dell'anello imidazolico di una istidina. Quando invece

+

la reazione avviene in soluzione, l'H può entrare sia da sopra sia da sotto il piano molecolare

dell'enediolo portando indifferentemente a glucosio e a mannosio. In pratica osserviamo che

è

l'enzima in grado di condurre questa reazione in modo stereoselettivo producendo sul C2 solo

una configurazione R (glu