Biochimica clinica - nozioni generali

L'antidispensa: appunti del corso di medicina di laboratorio

Biochimica e patologia clinica

• Cap 1 – Introduzione alla biochimica clinica
• Cap 2: Curva di taratura
  • Tecniche immunoanalitiche, immunoenzimatiche, ottiche
  • Elettroforetiche, cromatografiche
• Cap 3 – Enzimologia clinica ed enzimi del siero
• Cap 4 – Proteine del plasma
• Cap 5 – Valutazione assetto lipidico
• Cap 6 – Omeostasi glucidica
• Cap 7 – Valutazione dell’uricemia
• Cap 8 – Valutazione funzionalità renale:
  • Esame urine
  • Equilibrio acido-base
  • Emogasanalisi
  • Azotemia, uremia, creatinemia, creatininemia
  • Equilibrio idro-elettrolitico
• Cap 9 – Valutazione ipertensione arteriosa
• Cap 10 – Esami di laboratorio nelle malattie allergiche
• Cap 11 – La costellazione antigenica dei tumori, i markers tumorali
  • Antigeni oncofetali tumorali
  • Antigeni associati a tumori e markers di turn-over
  • Ormoni e recettori
  • Proteine
  • Enzimi
  • Marcatori immunitari
  • Marcatori immunoematologici
  • Acidi nucleici
  • Metabolici urinari
  • Risposte immunitarie
• Cap 12 – Esame emocromocitometrico
• Cap 12.1 – Anemie
• Cap 13 – Emostasi ed emocoagulazione
  • Sistema e fattori della coagulazione
  • Sistema fibrinolitico
  • Esami di laboratorio nello studio dell’emostasi (I e II livello)
  • Screening della fase fibrinolitica
• Cap 14 – Valutazione funzionalità ormonale
• Cap 15 – Valutazione funzionalità epatica

Redatta sulla base di quella che circola dai fotocopiatori.

Introduzione alla biochimica clinica – Cap 1

La biochimica clinica è una scienza applicata che studia l’effetto delle patologie sui processi biochimici dell’organismo, prendendo in esame qualsiasi tessuto o fluido biologico e misurandone sostanze o proprietà indicative. Il fine della biochimica clinica è quello di prevenire, diagnosticare ed, eventualmente, curare uno stato di malattia.

Questa scienza offre diversi contributi importanti:

• Offre spiegazioni su base puramente biochimica (enzimatica, proteica, dislipidemica ecc.).
• Offre una classificazione nosografica ezio-patologica che affianca quella clinica.
• Offre reperti statisticamente significativi.
• Controlla i fattori di rischio ambientali e di lavoro.

Caratteristiche generali delle misurazioni

Attendibilità

L’attendibilità o bontà di una misurazione è il grado di concordanza tra il valore “vero” oggetto della misura e la stima che l’analisi biochimica determina. Questo può essere influenzato dal metodo, che rappresenta l’insieme dei metodi di misura, dell’esperienza del personale, delle influenze ambientali ecc.

Precisione

La precisione è il grado di concordanza tra misure replicate effettuate sullo stesso campione; questo è un valore non esprimibile in termini numerici, ma lo è il suo reciproco, definito imprecisione; quest’ultima è una misura del grado di discordanza tra più misure replicate, ed è espressa dal valore della deviazione standard (DS), espressa nella stessa unità di misura in cui è espresso il valore della singola misura.

L’imprecisione può essere calcolata, inoltre, come DS relativa, anche definita coefficiente di variazione, calcolata come segue:

CV = (DS/media) x 100

Che cos’è la deviazione standard DS?

La media è un indicatore di tendenza centrale. Dà, infatti, una misura del valore del centro dei dati. È molto importante avere anche una misura di quanto i dati siano distanti dalla media. Si utilizza la varianza indicata con σ². La sua radice quadrata è la deviazione standard o scarto quadratico medio. Questo nome indica l'operazione per calcolarla: lo scarto dalla media è la distanza tra il dato e la media; lo scarto quadratico è il quadrato dello scarto; dei numeri così ottenuti si considera la media (si sommano e il totale si divide per il numero dei dati); la radice quadrata di questo numero dà una misura in media di quanto i dati si discostino dalla media.

È già stato detto che fonti di variazione sono presenti in ogni misurazione di un carattere biologico. Tale variabilità non è tuttavia del tutto imprevedibile: infatti, molti fenomeni naturali seguono un modello teorico definito "curva di distribuzione normale" o "gaussiana". Questo modello è particolarmente utile, in quanto possiamo impiegarlo conoscendo soltanto la media e la deviazione standard. Infatti, in una gaussiana il 95% dei dati cade nell'intervallo media ± 2 volte la deviazione standard. Più precisamente, si può dimostrare che l'intervallo (media ± deviazione standard) comprende il 68% circa dei dati; l'intervallo (media ± 2 deviazioni standard) ne comprende il 95% e l'intervallo (media ± 3 deviazioni standard) comprende pressoché tutti i dati (99.7%).

Ripetibilità

È la misura della deviazione dei risultati dal valore medio.

Riproducibilità

È la misura della deviazione dei dati dal valore medio nel corso di più settimane effettuata da tecnici che non conoscono l’identità del campione.

Accuratezza

È il grado di concordanza tra la migliore stima (grado medio trovato) ed il valore considerato vero (conosciuto) della grandezza.

Specificità: è la caratteristica del metodo di dosare solo ed interamente la sostanza studiata senza subire interferenza positive e negative da parte di altre sostanze presenti nel materiale; non ha valore numerico. Le tecniche radioimmunologiche hanno, ad esempio, alta specificità perché le reazioni Ag-Ab sono altamente specifiche. La specificità diagnostica è usata per indicare l’incidenza di risultati negativi che si ottengono applicando il test a soggetti non portatori di malattia. Se il test applicato a 100 persone sane offre 100 risultati negativi, la specificità sarà del 100%.

Specificità = VN / (VN + FP) x 100

Limite di Rivelabilità

È la più piccola sostanza che il metodo riesce a dosare.

Sensibilità

È l’attitudine del metodo a dosare piccole quantità del componente studiato; non ha valore numerico. Le tecniche ottiche hanno una sensibilità che va da 10^-4 a 10^-6, cioè dai mg ai g. Le tecniche radioimmunologiche hanno una sensibilità nell’ordine di 10^-10, cioè degli Å.

La sensibilità diagnostica indica l’incidenza di risposte positive che si ottengono applicando il test a pazienti affetti da una malattia. Se un test ha sensibilità del 100%, fornisce 100 risposte positive se effettuato su 100 persone malate.

Sensibilità diagnostica = VP / (VP + FN) x 100

Prevalenza

Rappresenta il numero di pazienti su 100.000 affetti da una malattia in un determinato momento.

Incidenza

È il numero di pazienti su 100.000 che in un anno contraggono la malattia.

Valore Predittivo

Il valore predittivo di un risultato positivo è la percentuale di veri positivi, rispetto ai positivi totali, che si ottengono quando il test è applicato ad una popolazione mista (malati + sani).

Valore predittivo = VP / (VP + FP) x 100

Analogamente il valore predittivo di un risultato negativo è la percentuale di veri negativi rispetto ai negativi totali (veri negativi + falsi negativi).

Un buon test deve essere molto sensibile e poco specifico. Si deve tenere presente, però, che sensibilità e specificità sono interdipendenti ed inversamente proporzionali.

Curva di taratura

È la premessa a qualsiasi metodica di laboratorio, perché ne permette l’interpretazione. È la rappresentazione grafica della densità ottica in funzione della concentrazione della sostanza in esame. Si costruisce effettuando una serie di misurazioni con concentrazioni note della sostanza e, conoscendo le corrispondenti densità ottiche, si ottiene, in un sistema di assi cartesiani, una retta, definita retta di interpolazione; questa è una risposta lineare. Qualora non fosse possibile ottenere una linearità della risposta, significa che la reazione chimica non segue la legge di Lambert-Beer; in questo caso occorre tracciare una curva di taratura, da preparare eseguendo un maggior numero di concentrazioni.

Una volta stabilite la retta o curva di interpolazione, è possibile misurare tutti i campioni con concentrazioni comprese tra i due limiti, mediante il metodo grafico, ovvero tracciando rette perpendicolari, e mediante il metodo algebrico.

Cc : Cst = DOc : Dost

Cc = (Cst x DOc) / DOst

Dove:

• Cc: Concentrazione del campione.
• Cst: Concentrazione standard.
• DOc: Densità del campione.
• DOst: Densità standard.

Se la densità ottica del campione in esame cade al di fuori dei limiti, si possono operare concentrazioni o diluizioni; in tal caso, però, il risultato dovrà essere per quanto è stato concentrato, o moltiplicato per quanto è stato diviso. La curva di taratura definisce, pertanto, i limiti di utilizzazione, ovvero il range di valori a noi più utili; per esempio le proteine sieriche, in concentrazione media di 7 grammi/100 ml, avrà un range da 1 a 10 grammi/100 ml, corrispondente ai valori minimi e massimi compatibili con la vita. È chiaro, inoltre, che il range di concentrazione deve essere quanto più ristretto possibile per minimizzare al massimo il margine d’errore.

Tecniche immunoanalitiche

L’Immunometria comprende tutte le tecniche che utilizzano una reazione Ab-Ag per misurare la concentrazione di un dato analita. Tra di esse alcune utilizzano isotopi radioattivi, altre utilizzano reazioni colorimetriche o reazioni enzimatiche. I complessi Ab-Ag possono essere sia in fase liquida che su supporto; gli Ab, a loro volta, possono essere monoclonali o policlonali.

RIA – Dosaggio Radioimmunologico (Radio Immuno Assay)

È di largo impiego per il dosaggio di ormoni ed altre sostanze di interesse (ferritina, antigeni virali, CEA). La condizione essenziale è la disponibilità di un antigene identico a quello che si vuole misurare, marcato con un radioisotopo. Questa tecnica si basa sulla competizione tra un antigene freddo ed una quantità limitante del corrispondente antigene marcato, per il legame con un numero limitato di siti anticorpali presenti in una quantità costante d’antisiero. All’equilibrio, in presenza di un eccesso di antigene, ci saranno sia antigeni liberi che antigeni legati. La quantità di antigene marcato all’anticorpo diminuirà con l’aumento dell’antigene freddo nel campione.

Allestendo una curva di taratura, ponendo in ascissa quantità note e crescenti dell’antigene da dosare ed in ordinata il segnale radioattivo, dato il complesso Ab-Ag, sarà possibile risalire alle concentrazioni incognite dell’analita nei vari liquidi biologici. All’aumentare della concentrazione dell’analita diminuirà la radioattività del complesso, essendo la quantità dell’antigene da dosare crescente e la quantità di antigene marcato e di anticorpo uguale in tutte le prove.

Vantaggi:

• Uso di immunogeni puri.
• Sensibilità alta (pg).
• Specificità.
• Automatizzabile.

Svantaggi:

• Costi.
• Deperibilità dei radioattivi.
• Rischio.
• Personale specializzato.

Negli antigeni proteici il gruppo fenolico di un residuo di tirosina marcato con ¹²⁵I; gli apteni non proteici sono normalmente marcati con ³H.

IRMA – Dosaggio Immuno-Radiometrico (Immuno-Radiometric-Assay)

Prevede l’utilizzo di antisieri marcati che reagiranno con il campione fino a marcare tutto l’antigene. Il conteggio della radioattività determinerà la misura diretta dell’antigene presente. È, questa, la principale differenza con RIA, perché in questo caso la proporzionalità diretta tra radioattività e concentrazione di antigeni è diretta, mentre nel RIA è inversa ed è un procedimento che si basa sulla competizione. Si effettua il dosaggio diretto degli anticorpi marcati. Il vantaggio sta nelle facilità, nel minore rischio e nella maggiore specificità.

Immunoprecipitazione

Un anticorpo diretto contro un antigene proteico è usato per isolare l’antigene specifico da una miscela. L’anticorpo è legato ad una matrice insolubile. L’antigene purificato è distaccato dall’Ab mediante cambiamenti di pH ed analizzato con elettroforesi in gel di poliacrilamide.

ImmunoBlot (Western Blot)

Serve per calcolare la quantità relativa ed il peso molecolare di una proteina contenuta in una miscela di proteine. L’antigene è sottoposto a separazione elettroforetica dagli altri. Le proteine sono trasferite (blotting) dal gel su una membrana di nitrocellulosa. La posizione dell’antigene sulla membrana è visualizzata mediante legame di un anticorpo radiomarcato o coniugato con un enzima mediante una reazione con un substrato cromogeno specifico.

Immunofluorescenza (FIA)

La sensibilità di questa tecnica è nell’ordine di 10^-8. Con adatti procedimenti è possibile coniugare gli anticorpi di un siero con alcune sostanze fluorescenti, come l’isotiocianato di fluoresceina.

Diretta: Ab fluorescenti a contatto diretto con l’antigene e illuminazione del preparato con UV.

Indiretta: antigene con il siero immune o presunto tale. Dopo incubazione si aggiunge un siero contenente Ab anti-Ig e poi si procede all’illuminazione con UV.

Immunoluminescenza (LIA)

L’illuminazione è il fenomeno di emissione di luce da una molecola in seguito al passaggio da uno stato elettronico eccitato allo stato fondamentale. Questo procedimento è legato a reazioni esoergoniche, che cedono energia al sistema, come l’incubazione del composto adatto con H₂O₂. La sensibilità è paragonabile a quella del RIA, ma la specificità risulta inferiore.

Tecniche immunoenzimatiche

Queste tecniche sfruttano la possibilità di coniugare anticorpi con alcuni enzimi; il legame enzima-Ab è svelato aggiungendo il substrato ed i reattivi necessari per la reazione catalizzata; il prodotto terminale deve essere colorato e la sua concentrazione è direttamente proporzionale alla concentrazione dell’analita.

ELISA – Dosaggio Immuno Assorbente Legato all’Enzima (Enzima-linked Immuno-sorbent Assay)

Le reazioni sono eseguite in pozzetti, al cui interno vengono fatti aderire antigeni o anticorpi noto. Vanno inseriti, poi, gli analiti e dopo i lavaggi necessari, i complessi Ab-enzima. La positività della reazione dell’enzima al substrato si appalesa per la comparsa di un prodotto di reazione colorato, quantizzato mediante spettrofotometria. Il metodo così descritto è il più utilizzato, definito Sandwich. L’ELISA è molto specifico, ma la sensibilità è legata alla densità ottica, per cui non è molto alta, inferiore a quella del RIA, nell’ordine di 10^-6 (pg).

Tecniche ottiche

Tutte le tecniche d’analisi ottiche si basano sul fatto che tutte le sostanze sono composte da molecole che assorbono elettivamente alcune radiazioni di determinate lunghezze d’onda; questo assorbimento decresce gradualmente per quelle radiazioni di lunghezza d’onda più lunga o più corta di quelle maggiormente assorbite. Il fenomeno dell’assorbimento delle radiazioni luminose per una soluzione dipende, in definitiva, dalla concentrazione delle molecole che costituiscono i centri di assorbimento della sostanza disciolta. Quanto maggiore è il numero di queste molecole, maggiore sarà l’assorbimento delle radiazioni incidenti.

Legge di Lambert – Beer

Il fenomeno dell’assorbimento della luce da parte delle soluzioni è definito in termini quantitativi dalla legge di Lambert – Beer. Se una radiazione monocromatica passa attraverso una soluzione, l’assorbimento subito dalle radiazioni è direttamente proporzionale allo spessore ed alle concentrazioni della soluzione stessa. La legge di L.-B. stabilisce il legame esistente tra l’intensità della luce che esce dalla soluzione e l’intensità della luce che l’ha colpita (trasmittanza), e tra quest’ultima e la concentrazione della sostanza assorbente, presente in soluzione (soluto):

-klc= T = eI/I₀

Dove:

• I: intensità della luce trasmessa dalla soluzione.
• I₀: intensità della luce incidente.
• T: trasmittanza.
• l: spessore della soluzione attraversata dalla luce.
• c: concentrazione della sostanza assorbente in soluzione.
• k: coefficiente di estinzione molare (caratteristico per ogni sostanza ad una determinata lunghezza d’onda per un determinato solvente e per una determinata temperatura; in questo caso l’acqua).

Questa relazione è espressa graficamente come un’iperbole equilatera, ma possiamo linearizzarla con il logaritmo di T:

-logT = assorbanza (o densità ottica) = klc

Se l e c sono unitarie, la densità ottica è una misura diretta della concentrazione del soluto. Questa legge è valida per soluzioni a bassa concentrazione, mentre per concentrazioni superiori si osservano deviazioni dalla linearità. La legge di Lambert-Beer è essenziale nel calcolo quantitativo delle concentrazioni di sostanze in soluzione tramite spettrofotometria.