Biochimica clinica - biomarcatori cancro

PCR arricchita

L'uso di specifici enzimi di restrizione durante o dopo la reazione di amplificazione permette la verifica della natura del prodotto amplificato, così come la distinzione delle varianti dell'amplificazione (cioè mutazioni della regione amplificata). Sulla base di questo concetto, la semplice amplificazione (A) di uno stampo di DNA, seguito da digestione enzimatica, permette l'identificazione di una mutazione, come mostrato in figura, dove una mutazione sul codone 12 di KRAS viene identificato dopo digestione con BstNI. Viene illustrato un diagramma schematico della procedura a due stadi dell'amplificazione "arricchita" delle sequenze mutanti del codone 12 del gene di KRAS umano. Il primer K.V contiene una sostituzione nucleotidica sul codone 11, che crea un sito di restrizione per BstNI (CCTGG) sovrapponendosi ai primi due nucleotidi del codone 12 wild-type (sequenza tratteggiata). La digestione delle sequenze amplificate nel primo

stadio determina l'arricchimento delle sequenze non digerite (mutanti del codone 12)(sequenza piena), che vengono amplificate durante la seconda fase di amplificazione (B) utilizzando i primer K5' e K3", che contiene un sito dicontrollo riconosciuto da BstNI (sequenza a tratteggio crociato). L'analisi RFLP in seguito a restrizione rivela che le sequenze mutate sonorappresentate da bande di 143 e 14 nucleotidi, mentre i wild type hanno bande di 114, 29 e 14 nucleotidi. Dal momento che la maggior parte del DNAmantiene la sua dimensione completa, la seconda amplificazione arricchisce la popolazione di mutanti, permettendone l'identificazione in una cellulasu 10.000 testate. L'analisi RFLP viene effettuata in gel di agarosio in presenza di etidio bromuro.

La metodologia SSCP si basasulle differenze conformazio-nali generate dagli allelinormali e da quelli mutanti (sepresenti) in seguito a corsaelettroforetica in condizioninon-denaturanti di

1. Il DNA amplificato viene denaturato in vitro e separato in elettroforesi non-denaturante in gel di poliacrilammide.
2. Il pattern di migrazione generato dagli alleli mutanti nei confronti di quelli normali permette l'identificazione di sequenze con una singola sostituzione di base.
3. Il DNA amplificato con PCR viene sottoposto a elettroforesi in gradiente di denaturazione (DGGE).
4. Il principio della SSCP viene ulteriormente sviluppato nell'elettroforesi in gradiente di denaturazione (DGGE), che permette l'identificazione di mutazioni puntiformi in grandi frammenti di DNA.
5. Il DNA amplificato viene mischiato con stampi non-mutati, in modo da generare omoduplex ed eteroduplex, che vengono separati in gel che variano di composizione, passando progressivamente da una situazione denaturante a una non-denaturante.
6. Per permettere la corretta identificazione di piccoli cambiamenti all'interno di grandi frammenti di DNA, viene aggiunta ai primer una sequenza contenente 40 ripetizioni GC in modo che i prodotti di

reazione si uniscono tra di loro più efficacemente utilizzando il tag Chemical mismatch cleavage (CME). Al DNA omoduplice ed eteroduplice generato dalla reazione di amplificazione PCR (prodotto come descritto nella DGGE), vengono inserite delle incisioni sui siti mismatch utilizzando idrossilammina e tetrossido di osmio. Il DNA inciso viene tagliato con l'aiuto di piperidina, generando frammenti di diversa lunghezza a seconda se siamo in presenza di eteroduplex normale-normale o normale-mutante. L'analisi dei prodotti tagliati sul gel non-denaturante permette di identificare queste differenze. BIOMARCATORI PER LA DIAGNOSI PRECOCE E PER IL MONITORAGGIO DEL CANCRO La rilevazione di geni correlati ai tumori è stato uno dei principali obiettivi delle applicazioni della PCR. In generale, i geni che causano tumori possono essere divisi in quelli che recano grosse alterazioni (delezioni, riarrangiamenti, traslocazioni) e quelli con alterazioni più lievi, come piccole delezioni o mutazioni puntiformi.

biomarcatori che possono aiutare nella diagnosi precoce e nel monitoraggio del cancro dovrebbero essere:

1. prevalenti (presenti in una percentuale significativa dellapopolazione malata)
2. presenti nella fase iniziale del processo carcinogenico.

Il primo tipo di biomarcatori sfruttabili è dato da geni che vanno incontro a modulazione durante tutto l'arco della vita (mutazioni somatiche). A questa categoria appartengono i geni importanti nella regolazione delle fasi di crescita e differenziazione, e quelli che agiscono in risposta a stress e danno al DNA. La loro alterazione risulta in una deregolazione del controllo del ciclo cellulare ed in un aumento della velocità di crescita, con il coinvolgimento, in molti casi, degli oncogeni, che vengono attivati, e di geni soppressori dei tumori, che vengono repressi. Questi cambiamenti causano spesso un accumulo di anomalie genomiche di lieve o grande entità man mano che il tempo passa, tra cui traslocazioni cromosomiche.

e vari tipi di altre mutazioni. Un esempio di alterazione genomica utile come biomarcatore sono le traslocazioni caratteristiche della neoplasia delle cellule B e delle cellule T, che possono essere rilevate con alta sensibilità mediante l'utilizzo di primer che legano diversi cromosomi all'interno delle aree corrispondenti alle regioni di rottura. Non ci sarà quindi amplificazione se non è presente traslocazione. Questi primer sono molto specifici e possono pertanto essere utilizzabili nella diagnosi routinaria di varie neoplasie linfatiche. Una differente alterazione genomica associata ai geni soppressori di tumori in certi tipi di cancro è la delezione (cancro del colon), identificabile attraverso l'analisi su gel del frammento amplificato, che risulta più piccolo di quanto atteso. La seconda alterazione genomica che è possibile utilizzare come biomarcatore coinvolge i geni ereditati (ad es. mutazioni sulla linea germinativa), e quindi

Riguardanti una possibile predisposizione. Ultimamente sono stati descritti diversi geni di questo tipo, che comprendono geni con riparazione irregolare, che determina una più alta frequenza di errore (con il seguente accumulo dei medesimi con il passare degli anni) ed una integrità genomica sbilanciata. Una delle indicazioni che possono far pensare ad un errore di riparazione è il cambiamento di lunghezza delle sequenze dinucleotidiche e trinucleotidiche. La lunghezza di queste sequenze può alimentare l'utilità di queste mutazioni come biomarcatori per una eventuale predisposizione nei confronti dell'instabilità genomica.