Biochimica clinica - biomarcatori cancro

Reazione polimerasica a catena nella diagnosi e nel monitoraggio del cancro

Mismatch amplification mutation assay (MAMA)

Uno dei requisiti cruciali di una corretta amplificazione è il legame completo tra l'estremità 3' del primer e la rispettiva sequenza del DNA stampo. Questo è il concetto che sta alla base della reazione MAMA, che utilizza primer modificati proprio nell'estremità 3' che possono legare o meno le sequenze stampo normali e mutate.

Come mostrato, un primer, contenente la sequenza di una forma mutante dell'estremità 3', non permette un'amplificazione efficiente dello stampo normale, ma permette quella della sequenza mutata, permettendo l'amplificazione selettiva.

RFLP e PCR arricchita

L'uso di specifici enzimi di restrizione durante o dopo la reazione di amplificazione permette la verifica della natura del prodotto amplificato, così come la distinzione delle varianti dell'amplificazione (cioè mutazioni della regione amplificata). Sulla base di questo concetto, la semplice amplificazione (A) di uno stampo di DNA, seguito da digestione enzimatica, permette l'identificazione di una mutazione, come mostrato in figura, dove una mutazione sul codone 12 di KRAS viene identificato dopo digestione con BstNI.

Viene illustrato un diagramma schematico della procedura a due stadi dell'amplificazione "arricchita" delle sequenze mutanti del codone 12 del gene di KRAS umano. Il primer K.V contiene una sostituzione nucleotidica sul codone 11, che crea un sito di restrizione per BstNI (CCTGG) sovrapponendosi ai primi due nucleotidi del codone 12 wild-type (sequenza tratteggiata).

La digestione delle sequenze amplificate nel primo stadio determina l'arricchimento delle sequenze non digerite (mutanti del codone 12) (sequenza piena), che vengono amplificate durante la seconda fase di amplificazione (B) utilizzando i primer K5' e K3", che contiene un sito di controllo riconosciuto da BstNI (sequenza a tratteggio crociato).

L'analisi RFLP in seguito a restrizione rivela che le sequenze mutate sono rappresentate da bande di 143 e 14 nucleotidi, mentre i wild type hanno bande di 114, 29 e 14 nucleotidi. Dal momento che la maggior parte del DNA mantiene la sua dimensione completa, la seconda amplificazione arricchisce la popolazione di mutanti, permettendone l'identificazione in una cellula su 10.000 testate. L'analisi RFLP viene effettuata in gel di agarosio in presenza di etidio bromuro.

SSCP

La metodologia SSCP si basa sulle differenze conformazionali generate dagli alleli normali e da quelli mutanti (se presenti).