Biochimica clinica - Appunti

Biochimica clinica

La biochimica clinica studia la variazione dei diversi parametri biochimici dell’organismo (sangue principalmente) in seguito a malattie o assunzione di farmaci. Sono oggetto degli esami di laboratorio i liquidi o tessuti biologici che costituiscono i sistemi (organi, tessuti & co.) dai quali ricavare informazioni. Da questi campioni si procede al dosaggio di analiti per chiarire il quadro diagnostico. L’esame di laboratorio deve risultare utile per:

• Scopi diagnostici
• Scopi prognostici (valutare l’evoluzione della malattia)
• Valutare patologie ancora allo stato pre-clinico (screening test)
• Follow-up di un trattamento farmacologico (risposta alla terapia)

Esame di screening

Esistono diversi tipi di esame di screening:

• Di popolazione
• Di gruppi selezionati: da eseguire in soggetti in cui è particolarmente frequente la comparsa di una malattia (es. PKU ed ipotiroidismo post-natali; dosaggio colesterolo per rischio cardiovascolare in soggetti obesi-diabetici-ipotiroidei)

Ovviamente, il risultato di un test non è mai un reperto assolutamente affidabile: la validità di un test può essere alterata dalla variabilità (la variabilità, in altre parole, è il maggior fattore di alterazione del risultato di un test). La variabilità totale può essere scomposta in una componente analitica (la cui responsabilità è dell’operatore che compie l’analisi e al tipo di metodo utilizzato) e in una componente biologica (la cui responsabilità è del propositus). A loro volta, queste due categorie possono essere ulteriormente sottoclassificate in:

• Analitica: Pre-Analitica – Analitica – Post-Analitica
• Biologica: Intraindividuale – Interindividuale

Variabilità analitica

1. Pre-Analitica

Riguarda la raccolta e la conservazione del campione biologico. Es. Le condizioni che devono essere rispettate prima di un prelievo venoso:

• Interferenza da farmaci: ci sono farmaci che possono interferire con il risultato di un prelievo (interferenza biofarmacologica, chimica, fisica)
• Digiuno: in un prelievo, il paziente deve essere a digiuno da almeno 6-8 ore (per non alterare potassiemia, lipemia, glicemia), ma da non più di 16 ore (per non alterare la concentrazione di acidi grassi, corpi chetonici, insulina)
• Attività fisica: compiere attività fisica fino a 10 ore prima dell’esame altera i livelli dei marker muscolari (LDH, transaminasi) e di alcuni metabolici (acido lattico, ammoniaca)
• Postura: esiste una differenza tra i risultati di un prelievo compiuto in pazienti degenti e in pazienti ambulatoriali; questa è dovuta alla diversa distribuzione dei fluidi corporei (e di conseguenza, a una diversa concentrazione dei metabolici presenti). Nei pazienti ambulatoriali, infatti, a causa della forza peso c’è una maggiore quantità di acqua (circa il 10%) che lascia il circolo ematico per fluire negli interstizi.
• Dieta: prima di alcuni esami può essere necessaria una dieta particolare
• Stress & emozione: un prelievo può anche essere alterato da cause non strettamente relative al paziente: ad es. un laccio emostatico stretto troppo, oppure una siringa con un ago troppo sottile possono causare emolisi (rottura dei globuli rossi) con alterazione di parametri come K+, LDH, Hb. Si può diagnosticare una probabile emolisi semplicemente guardando il colore del sangue nella provetta: un sangue eccessivamente rosso scuro è sintomo di emolisi (infatti l’Hb che si libera contiene Fe²⁺, il quale dà un colorito scuro al sangue).

2. Analitica

Dovuta ad errori relativi al metodo utilizzato. Il metodo è il maggior fattore di discordanza tra il valore reale e la sua stima. Il metodo è imprescindibile dalle misure:

Misure di posizione

• Media: definita come la sommatoria delle misurazioni ottenute diviso il numero di ripetizioni effettuate. È influenzata da valori esterni (∑misure/n. misure)
• Mediana: definita come il valore centrale di una distribuzione. Non è influenzata da valori esterni
• Moda: definita come il valore più frequente in una distribuzione numerica. È possibile la presenza di più mode.

Misure di dispersione

Indicano il grado di discordanza dei diversi valori dal valore medio.

• Intervallo di variazione: definito come la differenza tra il valore massimo e minimo osservati.
• Deviazione media: definita come la sommatoria degli scarti dalla media diviso il numero delle misurazioni effettuate (∑(X - µ) / n).
• Deviazione standard: definita come la radice della sommatoria dei quadrati degli scarti dalla media diviso il numero di misurazioni meno 1 (√∑(X-µ)² /n-1). Utilizzata solo nelle distribuzioni gaussiane.

Se uno stesso campione è analizzato diverse volte si otterranno sempre valori discordanti. Questo dipende da due fattori: precisione ed accuratezza.

Precisione

Il grado di concordanza tra le diverse misure di uno stesso campione. Se una misura è precisa, allora i risultati ottenuti possono essere disposti secondo una variabilità continua (curva gaussiana). In questo grafico, che conta un numero di ripetizioni di circa 120, il 68% dei valori sarà compreso tra il valore medio più o meno una deviazione standard; mentre il 95% delle misurazioni sarà compreso tra il valore medio più o meno due deviazioni standard. Siccome la precisione è un concetto puramente teorico, si preferisce riferirsi all’imprecisione per quantificare, sebbene in maniera indiretta, il valore della precisione. Viene espressa in termini di coefficiente di variazione, ovvero esprime di quanto i valori ottenuti discordano dalla media (C.V. = D.S / µ %). È dovuta all’errore casuale (ovvero incontrollabile) e, per questo, i risultati ottenuti avranno grado di errore diversi (alcuni sovrastimano il risultato, altri lo sottostimano).

Accuratezza

Definisce il grado di concordanza tra un valore ottenuto ed il valore vero del campione. Anche l’accuratezza è un concetto teorico: per quantificarlo ci si riferisce all’inaccuratezza, definita come la discordanza tra il valore reale (o meglio, il valore più probabile del campione; ottenuto tramite misurazione con metodica gold standard) e la media dei valori ottenuti tramite misurazioni con il metodo in esame. L’inaccuratezza è dovuta all’errore sistemico (sempre presente nelle misurazioni, e sempre con la stessa influenza) dovuto ad es. ad errata taratura degli strumenti. Con questo tipo di errore, tutte le misurazioni presentano lo stesso grado di errore (tutti sovrastimano o sottostimano il campione). Il controllo di precisione ed in accuratezza degli strumenti va eseguito a diverse concentrazioni di analista.

Altri parametri che possono influenzare l’efficacia di una misurazione sono la sensibilità e la specificità analitica (N.B. sens. e spec. analitiche sono diverse da sens. e spec. diagnostiche). La sensibilità analitica è la capacità del metodo di rilevare anche bassissime concentrazioni di analita. È importante quando, ad esempio, l’analita da dosare è presente con concentrazioni dell’ordine dei nanogrammi (es. ormoni); oppure quando anche piccole variazioni della concentrazione sono clinicamente significative (es. nelle talassemie).

La specificità analitica è invece la capacità del metodo di rilevare soltanto l’analita di interesse, e non sostanze simili ma pur sempre diverse. La specificità analitica è inficiata dall’interferenza: fenomeno in cui sostanze simili all’analita di interesse modulano il risultato dell’esame. Si definisce matrice tutto ciò che è presente nel mezzo d’esame che non sia l’analita di interesse.

3. Post-Analitica

Riguarda invece smistamento e conservazione del campione. Insomma, la variabilità analitica è quel tipo di variabilità che può essere eliminata/controllata dall’operatore.

Variabilità biologica

È presente in una percentuale controllabile ed in una incontrollabile.

• Controllabile: situazioni di stress a breve o lungo termine possono alterare il metabolismo basale (es. traumi, interventi chirurgici, gravidanza, obesità).
• Incontrollabile: che a sua volta si divide in intraindividuale ed interindividuale.

Intraindividuale

I valori misurati in un individuo possono variare in base al momento della giornata in cui gli analiti sono misurati. Bastano ricordare che le secrezioni di alcuni ormoni seguono dei ritmi:

• Infradiano: la secrezione è ciclica e il ciclo è contenuto nelle 24 ore.
• Circadiano: la secrezione è ciclica e il ciclo dura circa 24 ore.
• Ultradiano: la secrezione è ciclica e il ciclo dura più di 24 ore.

Interindividuale

La concentrazione di alcuni metaboliti può variare da individuo a individuo in base all’etnia, sesso, età.

Il traguardo analitico, in conclusione, è quello di ottenere una variabilità analitica che sia la metà di quella biologica (proprio perché la variabilità biologica non può essere eliminata). In questo modo, la variabilità analitica influirà per meno del 12% al risultato finale dell’esame. C.V.a = ½ C.V.b C.V. tot = √C.V.a² + C.V.b²

Differenza critica

È la differenza minima, tra due valori, che può essere considerata clinicamente significativa. Diventa significativa quando: Diff. Critica > C.V. tot x 2,77 %. Praticamente, indica il grado di differenza che deve esserci tra i due valori (di solito valori pre e post terapia di un analita) per essere significativi (ovvero, per dimostrare che la terapia è efficace).

Intervallo di riferimento

Intervallo di valori calcolato su una popolazione di riferimento: gruppo formato da un numero abbastanza elevato di individui, in buono stato di salute, ed omogenei per età, sesso, etnia, stile di vita. Di solito si escludono soggetti che assumono droghe o farmaci o alcool, soggetti predisposti a malattie, donne gravide o atleti. Se i risultati ottenuti da questo tipo di popolazione si distribuiscono su una gaussiana, i valori compresi tra la media +/- 2 deviazioni standard sono detti valori di riferimento e permettono, per confronto con il valore del propositus, di discriminare tra salute e malattia. Esistono però analiti per cui non è possibile parlare di valori di riferimento (es. colesterolo e trigliceridi); oppure valori per i quali non si ottiene la distribuzione gaussiana.

Utilità diagnostica del test

Sensibilità diagnostica

Capacità del test di individuare soggetti davvero malati (veri positivi). Inficiano la sensibilità del test i falsi negativi (soggetti malati che non vengono individuati come tali). Sensibilità = VP / VP + FN %

Specificità diagnostica

Capacità del test di individuare soggetti davvero sani (veri negativi). Inficiano la specificità del test i falsi positivi (soggetti sani ma diagnosticati come malati). Specificità = VN / VN + FP %

Valore predittivo positivo

Percentuale di soggetti che, risultati positivi al test, abbiano davvero la malattia VPP = VP / VP + FP % è correlato alla specificità.

Valore predittivo negativo

Percentuale di soggetti che, risultati negativi al test, non abbiano la malattia VPN = VN / VN + FN è correlato alla sensibilità.

Incidenza e prevalenza

• Incidenza: nuovi casi di una malattia.
• Prevalenza: istantanea della malattia.

Nella distribuzione dei soggetti sani e di quelli malati, c’è una zona “ibrida”, ovvero una zona in cui il valore del test è in comune alle due curve. Questo inconveniente può essere risolto spostando il cut-off (confine tra sano e patologico) sia nel punto A (e in questo modo faccio diminuire la quota di FN, quindi aumenta la sensibilità) sia nel punto C (e in questo modo faccio diminuire la quota di FP quindi aumento la specificità). Di solito, la flow chart consigliata è: in prima battuta un esame con sensibilità aumentata, così evitiamo di avere FN. In seguito, si escludono i FP con un secondo test ad elevata specificità.

Infiammazione: mediatori & indici

Qualsiasi stimolo che produce un danno tissutale genera una risposta da parte del nostro sistema immunitario nel tentativo di rimuovere tale stimolo. Tale processo immunitario genera la cosiddetta infiammazione, che nella sua fase acuta, riguarda principalmente i vasi sanguigni ed è diretta contro gli Ag non-self.

Classificazione

In base a:

• Agente scatenante – tipo di componente reclutato (cellule – mediatori)
• Causa Tipo di Mediatori Cellule Modalità

Complemento

Una cascata di ser-proteasi di sintesi epatica, secrete come zimogeni (richiedono proteolisi per essere attivate).

Via classica

L’attivatore è l’immunocomplesso Ag-Ab. Questo attiva la C1 (composta da C1Q + R + S), che a sua volta attiva (scindendo) la C2 e la C4. Queste attivano la C3… e così via fino alla formazione del MAC che lisa il batterio. Comporta la produzione di anafilotossine (C3a e C5a).

Via alternativa

Auto-attivazione della C3 in ambiente acquoso (ticking). Tale iC3 resta attiva solo se si può legare alla superficie batterica. Per il resto, il processo è lo stesso.

Anafilotossine

Sono prodotti che causano la dilatazione della muscolatura liscia (con eccezione di quella bronchiale, che invece si contrae). In caso di shock anafilattico (per eccessivo rilascio) si ha ipotensione e broncospasmo.

Citochine

Glicoproteine solubili prodotte dalle cellule dell’immunità. Fungono da messaggeri regolando la comunicazione tra le cellule. Si classificano in:

• Linfochine
• Interferoni
• Chemochine
• Fattori di necrosi tumorale
• Fattori di crescita

Acido arachidonico

Sintetizzato a partire da fosfatidilcolina ad opera della fosfolipasi A2. Successivamente, per azione delle ciclossigenasi e delle lipossigenasi viene convertito rispettivamente in prostaglandine e trombossani; e leucotrieni.

Chemotassi

Processo che comporta il richiamo delle cellule nel focolaio dell’infiammazione. Sono fattori chemotattici la C5a, LPS, la Formil-MET, il PAF.

Durante un processo infiammatorio, la concentrazione di alcune siero-proteine varia. Si definiscono positive quella prot la cui concentrazione aumenta, invece negative quella la cui concentrazione diminuisce.

Proteine

Le proteine negative sono invece: Albumina, Alfa Feto-proteine, Transferrina, Alfa2 Glicoproteina.

Test per diagnosi di infiammazione

• Misura della temperatura corporea: tale aumento è dovuto, in caso di infezione batterica, alla presenza in circolo di LPS; in generale però, una risposta infiammatoria comporta la sintesi di pirogeni endogeni (Il1 – Il6).
• Esame emocromocitometrico con formula leucocitaria:
• Infezione batterica: leucocitosi (+ di 15000) e neutrofili + dell’80% delle cellule circolanti.
• Infezione virale: globuli bianchi normali, ma quasi tutti linfociti.
• Infezione cronica: globuli bianchi normali.
• Infezione da allergeni o parassiti: globuli bianchi normali; aumento di basofili ed eosinofili.
• Dosaggio proteine sieriche
• VES (Velocità di eritreo-sedimentazione): i globuli rossi sono ricoperti da una certa carica – definita potenziale Z di membrana: quando il sangue viene messo in provetta, questo potenziale genera una repulsione tra cariche che si oppone alla coagulazione. Ci sono proteine acide che neutralizzano questo potenziale rendendo possibile la coagulazione. Queste proteine sono tutte proteine positive della fase acuta e quindi, durante un’infiammazione, la VES aumenta. La VES è quindi un’analisi molto sensibile per la fase acuta.
• Aumento: dopo 24 h
• Normalizzazione: dopo 6-8 gg
• Non è però molto specifica perché può variare anche in altre patologie (o situazioni parafisiologiche) come: gravidanza (aumento), ciclo (aumento per via della secrezione di estrogeni che stimolano il fegato), uso di contraccettivi, epoca neonatale (diminuzione perché il fegato dei neonati non funziona ancora bene), iperlipoproteinemia (aumenta perché le lipoproteine neutralizzano il potenziale Z).
• La VES può essere eseguita sia a mano che in modo automatico:
• Manuale (Westergren): sangue+citrato; si aspirano fino a 200mm di sangue in provetta e si legge dopo 1 ora la sedimentazione. Valori di riferimento: <20 mm donne; <15 mm uomini.
• Automatico: viene letta la densità ottica del campione circa 1000 vv in 20 secondi; si costruisce poi una curva e la si confronta con il grafico di riferimento.
• Dosaggio proteine sieriche:
• CRP (C Reactive Protein): è una proteina pentamerica composta da 5 monomeri identici. Ogni catena lega uno ione Ca²⁺. È una opsonina, ovvero favorisce la fagocitosi rivestendo la superficie del batterio. La sua produzione è stimolata da: endotossine batteriche (quindi aumenta nelle infiammazioni) e immunocomplessi (quindi aumenta anche in neoplasie, malattie autoimmuni).