Riassunto esame Biochimica: cicli metabolici, prof. Calonghi

Struttura del DNA

Negli anni '40-'50, erano note solamente i comportamenti della molecola di DNA formatesi in seguito a diffrazione dei raggi X. Rosalind Franklin nel 1952 ipotizzò che le macchie scure che al centro dell'immagine andavano a costituire una croce, identificavano una struttura elicoidale della molecola, mentre le macchie più intense ai lati, rappresentavano la presenza di basi ricorrenti nella molecola stessa.

Di conseguenza, si iniziava ad avere informazioni sulla struttura vera e propria del DNA: doveva essere a forma cilindrica, con struttura ripetitiva, ovvero con la presenza di due periodicità ben distinguibili (una ogni 0,34 nm e l'altra ogni 3,4 nm), era di forma elicoidale grazie alle macchie sul diffrattogramma e inoltre la Franklin capì che la densità atomica misurata era troppo grande per pensare fosse costituita da un unico filamento, dovevano essere, quindi, almeno due.

La molecola possiede una parte polare (costituita da desossiribosio e gruppi fosfato) e da una parte apolare (basi azotate). Le basi dovevano essere impaccate strettamente in modo che tutta l'acqua venisse esclusa da questa porzione della molecola. La periodicità più bassa (0,34 nm) venne intesa come la distanza tra le due basi successive, mentre quella più ampia (3,4 nm) venne interpretata come un giro d'elica (solco maggiore, importante sito di legame per molti farmaci che agiscono direttamente sul DNA).

Inoltre, la Franklin ipotizzò che i due filamenti corressero in direzioni opposte. Per determinare la natura di interazione che vedeva coinvolti i due filamenti, si espose una soluzione di DNA a 70-80 gradi circa e si verificò la perdita della sua viscosità: era già noto che a queste temperature, i legami covalenti non vengono scissi, quindi era già chiaro che i principali legami tra i due filamenti fossero a idrogeno.

La disposizione delle basi su un filamento è assolutamente casuale, ma Edwin Chargaff dimostrò che la concentrazione totale di purine e pirimidine era esattamente costante (timina=adenina; citosina=guanina) portando alla conclusione che ogni adenina su un filamento si appaiava con una timina sul filamento opposto e ogni citosina si appaia con una guanina.

Appaiamento delle basi

Ma come si combinano le varie basi? La spiegazione è che le basi azotate possono presentarsi in diverse forme (tautomeri) e che ci siano combinazioni di tautomeri di ciascuna base azotata, che permettano la formazione di due legami a idrogeno tra A e T e tre tra C e G; questa conoscenza forza la considerazione dell'andamento antiparallelo dei due filamenti.

L'appaiamento forzato purina-pirimidina consente al doppio filamento di avere una distanza sempre costante. Se si legassero due pirimidine la struttura sarebbe molto più stretta e se si legassero due purine, invece, si avrebbe una struttura molto più larga. Tutte queste conoscenze portarono alla conclusione della complementarietà dei due filamenti, in quanto gli appaiamenti delle basi sono fissi e conoscendo la struttura di uno dei due, si può risalire facilmente alla struttura dell'altro. In più, se i due filamenti vengono separati, ciascuno funge da stampo per un filamento nuovo, mantenendo invariata l'informazione genetica.

Interazioni e legami nel DNA

• Interazioni idrofobiche e forze di van der Waals (per escludere l'acqua dall'interno della doppia elica)
• Legami a H tra le basi
• Interazioni idrofiliche (lo scheletro covalente all'esterno della molecola è a contatto con l'acqua con la quale ha una grande affinità)
• Interazioni elettrostatiche (la potenziale instabilità risultate dalla repulsione tra i gruppi fosforici negativi è bilanciata da interazioni elettrostatiche tra tali gruppi e i cationi intracellulari come Mg⁺⁺ e Ca⁺⁺)

Antitumorali che modificano la struttura del DNA

La struttura del DNA è fondamentale per i vari processi di replicazione, trascrizione e riparazione. Infatti, la distorsione della struttura provocata da complessi di platino causa effetti tossici alla cellula. Si ottengono, quindi, degli antitumorali. Il cis-platino, ad esempio, si lega alle molecole di guanina formando addotti che causano un forte ripiegamento verso il solco maggiore che impediscono il regolare svolgimento di replicazione e trascrizione. Gli addotti, poi, richiamano le proteine riparatrici del DNA che producono rotture nella molecola, costringendo a indurre alla molecola lo stato di apoptosi.

Sintesi delle proprietà del DNA

Solitamente è a doppia elica perchè più stabile:

• Nei piccoli organismi (virus e procarioti) generalmente è circolare, in modo da essere maggiormente protetto da attacco di esonucleasi
• Nei procarioti invece è lineare, ma strettamente complessato con proteine che proteggono le estremità dall'azione delle esonucleasi e stabilizzandoli grazie all'interazione con le cariche positive
• Negli eucarioti esiste anche un DNA circolare nei mitocondri e nei cloroplasti che codificano per proteine specifiche dell'organello citoplasmatico

La lunghezza del DNA è variabile da specie a specie, ma di solito è, comunque, molto maggiore delle dimensioni della cellula. L'esempio più lampante è che in una singola cellula umana, i due metri di molecola di DNA sono compresi in un nucleo di 10 micrometri.

Compattamento del DNA

A questo proposito è necessaria un compattamento organizzato. Questo compattamento deve consentire alla molecola di occupare il minor spazio possibile, ma allo stesso tempo, di permettere l'accesso all'informazione contenuta nel DNA per consentire i processi di replicazione e trascrizione.

• Nei procarioti il tipo di superavvolgimento è quello plectonemico mentre negli eucarioti si parla di superavvolgimento a solenoide.

Superavvolgimento plectonemico (procarioti)

Il superavvolgimento identifica avvolgimento di qualcosa che è già avvolto. In E. Coli (cellula procariota) il DNA circolare superavvolto, provoca una tensione torsionale che causa la formazione di una struttura terziaria, occupando meno spazio. In generale, la molecola di DNA rilassata ha un numero ideale di paia di basi per ogni giro d'elica che è pari a 10,5. Nel caso di perturbazione della molecola (che si stringa o che si allenti) si creerà la tensione torsionale accennata in precedenza, causando un superavvolgimento positivo (minore di 10,5 pb) o negativo (maggiore di 10,5 pb).

Avendo le estremità fisse (perché molecola di DNA circolare), questa tensione torsionale si traduce in superavvolgimento. Esiste una branchia della scienza chiamata topologia che studia tutti i possibili superavvolgimenti della molecola del DNA.

Superavvolgimenti negativi

Ipotizziamo di aumentare a 13,5 pb per ogni giro d'elica "srotolando" la molecola di DNA. La perturbazione può determinare due tipi di reazione nella molecola:

• Superavvolgimento nel quale tutta la molecola risulta più lassa e quindi rilassata
• Parziale separazione dei due filamenti di DNA in cui la maggior parte della molecola mantiene il numero ideale di pb per ogni giro d'elica, limitando a una piccola regione la separazione dei due filamenti

Il secondo tipo di reazione è quello che più probabilmente possiamo riscontrare in vivo, in quanto utile per le varie attività cellulari. Tutte le molecole di DNA dei procarioti, infatti, sono parzialmente disavvolte (ovvero contengono delle supereliche negative) in quanto facilitano la separazione dei due filamenti (in caso di replicazione e trascrizione). Per modificare il grado di superavvolgimento, però, occorre rompere i filamenti e questa operazione viene effettuata da enzimi specifici: topoisomerasi (nel caso dei batteri è presente un solo tipo di topoisomerasi, chiamata DNA girasi che induce solo superavvolgimenti negativi).

Superavvolgimenti positivi

I superavvolgimenti positivi sono creati conseguentemente all'apertura dei due filamenti che, a valle della forcella di replicazione, aumentando la tensione torsionale creano supereliche positive. Questi, però, a differenza di quelli negativi, rendono più difficile la separazione dei due filamenti. Devono essere, quindi, prontamente eliminati ad opera delle DNA girasi che agiscono rompendo uno o entrambe i filamenti ristabilendo il numero ideali di pb per giro d'elica.

Inibitori delle topoisomerasi

Esistono composti che hanno come bersaglio specifico la DNA girasi ma non le topoisomerasi degli eucarioti. Possono essere, quindi, usati come antibiotici. Ciprofloxacina (++infez urinarie, antrace) interferisce con la rottura e successiva sigillatura. Camptotecina, Etoposide inibiscono ++ topoisomerasi eucariotiche terapia antitumorale.

Superavvolgimento a solenoide (eucarioti)

Per permettere alla molecola di DNA (circa 2 metri) di riuscire a stare all'interno del nucleo (5 micrometri) è necessario compattare i cromosomi più di 100.000 volte. Nelle cellule eucariotiche, questo super impaccamento è dovuto all'associazione con le proteine istoniche. DNA + istoni= cromatina, che, al momento della divisione cellulare, si autoorganizza in cromosomi.

Il superavvolgimento a solenoide consiste in avvolgimenti levogiri attorno agli istoni resi più stabili del legame con le proteine. Infatti, lo scheletro covalente del DNA è ricco di cariche negative (dovuto ai gruppi fosfati) e si lega fortemente alle proteine istoniche ricchi di amminoacidi basici presenti (lisina, arginina). La struttura singola di aggregazione è definita nucleosoma ed è formata da 8 proteine istoniche sui quali si formano due avvolgimenti di DNA e una nona proteina istonica H1 che completa il nucleosoma dall'esterno. La successione di nucleosomi, e quindi la cromatina, ha il caratteristico aspetto a filo di perle.

La struttura della cromatina conferisce un compattamento estremo alla struttura del DNA, ma al tempo stesso rende più difficile l'accesso ai complessi enzimatici che devono realizzare la duplicazione del DNA o la trascrizione dell'RNA.

Per permettere i cicli del DNA, è necessario un processo definito "rimodellamento della cromatina" che consiste nell'acetilazione delle estremità N-terminali delle proteine istoniche (ovvero i residui di lisina che si estendono al di fuori del nucleosoma). L'acetilazione impegna cariche positive degli AA basici delle proteine, diminuendone la disponibilità per le cariche negative del DNA, diminuendo, quindi, la forza di legame tra DNA e istoni. La struttura risulta, pertanto, meno impaccata quindi è più disponibile l'accesso agli enzimi.

Replicazione del DNA nei procarioti (E.Coli)

Secondo il dogma centrale della biologia molecolare, il flusso di informazioni segue il seguente percorso: DNA (replicazione) DNA (trascrizione) RNA (traduzione) proteine. La replicazione ha luogo solo in caso di divisione cellulare, quel momento in cui avviene il passaggio del completo genoma dalla cellula madre alle due cellule figlie.

• La replicazione avviene in più passaggi:
• Separazione dei due filamenti
• Ciascuno funge da stampo
• Appaiato con il filamento stampo, viene sintetizzato un nuovo filamento complementare
• Durante la replicazione viene replicato l'intero genoma (cioè tutta la molecola di DNA)
• La replicazione è semiconservativa e procede in direzione 5' 3'
• Prende il via in un punto e procede in modo bidirezionale

Per sintetizzare un nuovo filamento partendo da un "filamento stampo", dovrebbero essere aggiunti DESOSSIRIBONUCLEOTIDITRIFOSFATI (dATP, dGTP, dCTP, dTTP). In E.Coli, ci sono 5 enzimi ad attività DNA-polimerasica, ma due tra questi svolgono un ruolo fondamentale: la DNA-polimerasi III, DNA polimerasi I.

Il problema è che questi enzimi sono in grado solo di allungare qualcosa di preformato e non di creare una sequenza ex novo a partire dal solo stampo. Per ovviare a questa difficoltà, esistono sequenze di ribonucleotiditrifosfati = primer, sintetizzati dalla RNA polimerasi (che invece riesce a farlo) e sono costituiti da 6/10 residui, ai quali, poi, la DNA-polimerasi riesce ad attaccarsi per creare il nuovo filamento.

Il nucleoside trifosfato che lega la base appropriata, subisce un attacco nucleofilo sull'atomo di P del gruppo fosfato alfa da parte dell'OH in 3' dell'ultimo nucleotide del primer. Si forma così un legame estereo e si rompe, invece, un legame anidrico liberando pirofosfato. Il processo richiede energia avvalendosi dell'energia di scissione di legame della prima idrolisi del legame anidrico e della seconda scissione del pirofosfato.

DNA-polimerasi III in E.Coli

• Necessita di un piccolo polinucleotide preformato: "primer", formato da RNA polimerasi
• Ha attività polimerizzante in direzione 5' 3'
• Elevata processività (fino a 5 milioni di nucleotidi aggiunti prima del distacco)
• Elevata velocità di polimerizzazione (1000 nu al secondo)
• Elevata fedeltà di replicazione (frequenza di errore 1 errore per ogni 10^4/5)
• Attività esonucleasica (proofreading) in direzione 3' 5' che fa aumentare la fedeltà di replicazione a 1 errore per ogni 10⁹ nu inseriti

La replicazione si suddivide in tre fasi: inizio, allungamento e termine. Per poter iniziare, è necessario che i due filamenti si separino, compensare i superavvolgimenti che questo causa, duplicare i filamenti e riappaiarli. Per fare questo è presente un grande complesso enzimatico definito replisoma.

È importante definire l'inizio della replicazione (OriC) e questo viene "riconosciuto" grazie alla presenza di determinate sequenze. Sulla molecola di DNA sono presenti, infatti, tre sequenze da 13 coppie di basi ciascuna ripetute (GAT CTN TTN TTTT), poste una di seguito all'altra che determinano la regione di apertura dei filamenti e altre quattro sequenze di 9 coppie di basi (TTA TCC ACA) che rappresentano i siti di riconoscimento a cui si lega la proteina DnaA che fa parte del replisoma.

• La DnaA si lega alle 4 sequenze da 9 pb
• Provoca la denaturazione della regione delle 3 sequenze da 13 pb (ricca di appaiamenti A=T) con conseguente separazione dei filamenti
• Le elicasi e le topoisomerasi intervengono per il proseguimento dell'apertura e per compensare l'aumento della tensione torsionale
• Inoltre le proteine SSB intervengono per mantenere separati i due filamenti stabilizzandoli in forma aperta

Fase di allungamento

Per la fase di allungamento, bisogna distinguere i due filamenti. Uno tra questi viene definito il filamento leader o veloce, in quanto polimerizzato in direzione 5' 3' sul filamento stampo (3' 5') e quindi non ha problemi di polimerizzazione. Interviene solo la primasi per creare i primer e la DNA-polimerasi III.

Per quanto riguarda l'altro filamento, quello che si crea sul filamento stampo che va in direzione 5' 3', sorge un problema: per poter essere polimerizzato come l'altro, la direzione dovrebbe essere 3' 5'. Ma la DNA-polimerasi III ha azione polimerizzante solo in direzione 5' 3'. Quindi per ovviare a questo problema, la polimerizzazione avviene con il metodo dei frammenti di Okazaki.

Man mano che la molecola di DNA madre viene aperta, la primasi crea tanti piccoli primer distanziati tra loro, in modo che la DNA-polimerasi III allunghi ogni primer in direzione 5' 3' dando luogo a tanti frammenti di DNA complementare definiti "di Okazaki".

DNA-polimerasi I in E.Coli

• Si lega all'estremità di un frammento di Okazaki e prosegue in direzione 5' 3', pertanto non ha bisogno di un primer perché allunga un filamento già formato
• Davanti a sé trova un tratto di RNA e, con un'attività esonucleasica in direzione 5' 3', lo idrolizza
• Contemporaneamente, con attività polimerizzante 5' 3', allunga i frammenti di Okazaki sostituendo i ribonucleotidi del primer con desossiribonucleotidi complementari al filamento stampo
• Non forma legami fosfodiestere e lascia libera l'estremità 5'-P

Interviene ora la DNA-ligasi per sigillare le interruzioni dando la continuità strutturale al nuovo filamento di DNA.