Biochimica e Introduzione alla biochimica

Biochemicala biochimica

La biochimica studia:

• I componenti chimici degli organismi viventi.
• I processi e le modalità attraverso i quali essi vengono sintetizzati e demoliti.

Si pensava che i processi di sintesi delle molecole biologiche potessero avvenire solo all’interno delle cellule viventi ma, nel 1828, per la prima volta si scoprì che una molecola biologica, l’urea, poteva essere sintetizzata anche da sistemi non viventi (in un tubo di vetro, “in vitro” in un laboratorio). Da un punto di vista biochimico, i componenti chimici degli organismi viventi possono essere distinti in:

• Macromolecole biologiche: Grandi molecole (es. acidi nucleici o proteine).
• Metaboliti: Composti a basso peso molecolare (es. glucosio o glicerolo) che subiscono continue trasformazioni nel corso dei processi biologici, per andare a comporre macromolecole o, quando esse vengono decomposte, ritornare semplici componenti.

L’insieme di tutti i processi biochimici che permettono ad un organismo di sintetizzare e demolire i propri componenti chimici prende il nome di metabolismo, che può a sua volta essere suddiviso in:

• Anabolismo = Processi biosintetici.
• Catabolismo = Processi degradativi.

Energia e lavoro biologico

Le cellule e gli organismi viventi devono compiere un lavoro per rimanere vivi e per riprodursi. Essi richiedono energia quindi un continuo apporto di energia per poter compiere questo lavoro che fondamentalmente consiste in:

• Lavoro meccanico durante la contrazione muscolare e per i movimenti cellulari.
• Trasporto attivo di molecole e ioni.
• Sintesi di biomolecole e macromolecole da precursori semplici.

Energia: è la grandezza fisica che misura la capacità di un corpo o di un sistema fisico di compiere lavoro, a prescindere dal fatto che tale lavoro sia o possa essere effettivamente svolto. Gli organismi viventi ottengono questa energia in due modi differenti:

• Organismi fotosintetici (o fototrofi) ottengono l’energia dalla luce solare.
• Organismi chemiotrofi ottengono l’energia attraverso l’ossidazione (cioè combustione) di sostanze nutrienti generate dai fototrofi (o da altri chemiotrofi di cui si nutrono).

Sistema e scambi energetici

Per sistema si intende una porzione definita (cioè ben delimitata, dotata di confini precisi) dell’universo le cui dimensioni possono variare da piccolissime (es. una cellula o una capsula Petri) a enormi (es. la Terra, il sistema solare ma anche l’universo intero). Un sistema è definito:

• Isolato, se non scambia né energia né materia con l’ambiente circostante.
• Aperto, se scambia energia e materia con l’ambiente circostante.

Tutti gli organismi viventi sono sistemi aperti perché scambiano sia energia che materia con l’ambiente circostante.

Ogni sistema contiene una certa quantità di energia detta energia interna (E), che comprende:

• Energia cinetica di traslazione di atomi e molecole.
• Energia di vibrazione e rotazione di atomi e molecole.
• Energia immagazzinata nei legami chimici tra gli atomi.
• Energia dei legami non covalenti tra le molecole.
• Energia immagazzinata nel nucleo atomico (ma questa non cambia con nessuna reazione chimica o biochimica).

L’energia interna di un sistema può essere calcolata in maniera precisa conoscendo almeno due delle tre variabili del sistema, temperatura (T), pressione (P), volume (V), e la quantità di tutte le sostanze presenti. Es. Un sistema costituito da una mole di O₂ gassoso in un litro (V) a 273 °K (T) avrà un valore preciso di Energia Interna che è possibile calcolare. L’energia viene misurata in joule (J). Per il calore è spesso ancora usata la caloria (cal). 4,1868 J = 1 cal

Primo principio della termodinamica

In un sistema aperto, l’energia interna può subire delle variazioni attraverso due meccanismi:

• Il sistema può cedere o acquisire calore.
• Il sistema può compiere un lavoro sull’ambiente (es. espandendosi) e viceversa (es. venendo compresso).

Se il sistema compie un lavoro sull’ambiente esterno o cede calore all’ambiente esterno, il sistema cede energia, perciò l’energia interna diminuisce. Se il lavoro è compiuto sul sistema o il sistema assorbe calore, il sistema acquisisce energia, perciò l’energia interna aumenta. Una variazione di energia interna (∆E) di un sistema può avvenire solo ad opera di scambi di calore o di lavoro con l’ambiente circostante. Questo concetto fondamentale rappresenta il primo principio della termodinamica. L’energia interna di un sistema aperto può variare, ma l’energia non si crea né si distrugge semplicemente si trasforma e si trasferisce (principio di conservazione dell’energia).

Enzimi

Enzimi sono biocatalizzatori che non vengono consumati durante la reazione. La via di conversione dei reagenti in prodotti quasi invariabilmente comporta il superamento di una barriera energetica chiamata energia di attivazione. Affinché si formino dei nuovi legami chimici devono prima rompersi quelli preesistenti tra i reagenti: deve formarsi uno stato di transizione con un’energia libera più elevata rispetto sia ai prodotti che ai reagenti (c’è bisogno di una energia di attivazione ∆G_≠).

L’enzima abbassa l’energia di attivazione poiché il suo legame con lo stato di transizione è un processo esoergonico che libera energia (e quindi riduce l’energia di attivazione). Le reazioni catalizzate da enzimi procedono comunemente a una velocità tra 10⁶ e 10¹⁷ volte superiore rispetto alle reazioni non catalizzate. L’enzima non modifica l’energia complessivamente liberata nella reazione (il ∆G di una reazione catalizzata o non catalizzata non varia).

Ricapitolando

• La differenza di energia libera (∆G) tra i prodotti e i reagenti determina se una reazione avviene spontaneamente o no.
• L’energia richiesta per dare inizio alla conversione dei reagenti in prodotti (energia di attivazione ∆G_≠) determina la velocità della reazione.
• Se l’energia di attivazione è bassa, ci sono molte molecole con abbastanza energia per iniziare la reazione e in questo punto la reazione sarà molto veloce; se l’energia di attivazione è alta, ve ne saranno molte meno.
• Gli enzimi agiscono solo sulla seconda proprietà delle reazioni: aumentano la velocità della reazione ma non possono rendere spontanea una reazione termodinamicamente sfavorita (= con ∆G > 0).

Efficienti: aumentano la velocità delle reazioni (con gli enzimi può aumentare da 6 a 17 ordini di grandezza!!).

Specifici: catalisi di una ben determinata reazione su un substrato specifico.

Regolabili: "nulla" attività ➔ "max" attività tramite specifici effettori o variazioni chimico-fisiche. In questo modo la velocità alla quale si forma il prodotto risponde alle reali necessità della cellula.

Gli enzimi sono in genere proteine globulari idrosolubili che possono essere formate da una sola o più catene polipeptidiche. Possono essere:

• Proteine semplici
• Glicoproteine
• Lipoproteine
• Altri tipi di proteine coniugate

Alcuni enzimi sono molecole di RNA: ribozimi.

Alcuni enzimi necessitano di una porzione non proteica per poter esplicare la loro attività biologica (proteine coniugate) e si possono dividere in:

• Apoenzima: enzima privo della sua porzione non proteica.
• Oloenzima: complesso cataliticamente attivo tra apoenzima e porzione non proteica.

La porzione non proteica di un oloenzima può essere definita:

• Cofattore: se è costituita da un metallo (es. Fe²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺).
• Coenzima: se è costituita da una piccola molecola organica ➔ agiscono come trasportatori transitori di specifici gruppi funzionali.

I coenzimi di solito derivano da vitamine e il corpo non è in grado di sintetizzarli autonomamente.

Ci sono enzimi sintetizzati come precursori inattivi (spesso enzimi digestivi che, se sintetizzati attivi tenderebbero a digerire la cellula stessa che li produce: pepsinogeno), detti zimogeno, enzima sintetizzato in forma inattiva e più grande e successivamente trasportato nel distretto di azione, modificato chimicamente (viene eliminata una parte della molecola) e trasformato nella forma attiva.

Ci sono enzimi multimerici, formati da più unità ed enzimi monomerici, formati da un’unica unità. Un complesso multienzimatico è un’associazione organizzata di enzimi che cooperano in modo sequenziale in una serie di reazioni (interazione strutturale e funzionale: è più veloce e coordinato il processo metabolico). Un enzima polifunzionale è invece un enzima con più unità catalitiche sulla stessa catena proteica.

Gli enzimi sono presenti all’interno della cellula, in spazi ben determinati; per esempio la sintesi e la degradazione dei polisaccaridi a fini energetici e la glicolisi (prima tappa energetica del catabolismo dei glicidi) avvengono nel citosol, mentre la decarbossilazione del piruvato, il ciclo di Krebs e la catena respiratoria avvengono all’interno del mitocondrio, dove avviene anche l’ossidazione degli acidi grassi. Molti enzimi sono localizzati in specifici organelli cellulari; questa compartimentazione è utile per tenere separati i substrati o i prodotti di reazioni tra loro in competizione.

Azione dell'enzima

Attività enzimatica: quantità di substrato convertito per minuto in determinate condizioni standard (T°, pH e forza ionica) ➔ mmoli/min.

Attività specifica: attività enzimatica espressa per mg di proteina ➔ si misura in mmoli/min (numero di moli convertite in 1 min). Non tiene in considerazione la quantità dell’enzima: l’attività enzimatica in una cellula può essere maggiore semplicemente per il fatto che in quella si trova una maggiore concentrazione di enzima, non semplicemente per il fatto che quell’enzima lavori velocemente. Bisogna poi normalizzare sulla quantità dell’enzima ➔ attività specifica.

Un enzima produce un ambiente ideale affinché una determinata reazione sia energeticamente favorita grazie alla presenza di una tasca chiamata sito attivo dell’enzima (sito di legame per il substrato), che contiene le catene laterali degli aminoacidi dell’enzima che partecipano al legame del substrato e alla sua catalisi. Il legame enzima-substrato è la chiave dell’azione catalitica.

Oltre a questa cavità specifica per il substrato ci possono essere altri siti in cui si adattano specificamente coenzimi o cofattori che partecipano alla reazione catalizzata.

Ci sono enzimi:

• Enzimi costitutivi: sono permanentemente presenti nelle cellule. Quando sono necessari alla cellula si ha l’attivazione enzimatica e l’attività dell’enzima aumenta.
• Enzimi induttivi: compaiono solo se necessari (es. presenza di un determinato substrato) e vengono prodotti mediante il processo di induzione enzimatica (innesco della sintesi di un enzima). È un meccanismo di adattamento un po’ più lento rispetto al precedente.

L’induzione enzimatica regola la quantità di un enzima presente nella cellula modificandone la velocità di sintesi che può essere aumentata (induzione enzimatica) o ridotta (repressione enzimatica). Riguarda normalmente enzimi necessari solo in un determinato stadio dello sviluppo o in particolari condizioni fisiologiche; è una modalità di regolazione che avviene lentamente, a differenza dei processi di attivazione/inibizione che sono molto veloci.

La direzione di una reazione è determinata dal fatto che l’energia tende sempre a diminuire. Le reazioni termodinamicamente favorite (spontanee) sono quelle in cui alla fine si ha una diminuzione dell’energia (∆G < 0).

L’energia (G) delle molecole che vanno incontro alla reazione (Reagenti “R”) deve essere maggiore di quella delle molecole che si producono nella reazione (Prodotti “P”).

• ∆G = G(P) - G(R) = (variazione di energia)
• ∆G < 0 la reazione decorre da sinistra a destra
• ∆G = 0 la reazione è all’equilibrio (la quantità di R ➔ P è = P ➔ R nella stessa unità di tempo). Reazione reversibile all’equilibrio.
• ∆G > 0 la reazione decorre da destra a sinistra

Quando il ∆G è negativo la reazione è esoergonica (termodinamicamente spontanea o favorita).

Quando il ∆G è positivo la reazione è endoergonica (termodinamicamente NON spontanea, necessita di apporto energetico per avvenire da sx a dx ➔ accoppiamento con reazioni che liberano energia).

Il valore di ∆G non fornisce indicazioni sulla velocità della reazione. Un valore di ∆G anche molto negativo ci indica che la reazione da un punto di vista termodinamico può avvenire spontaneamente, ma poi la velocità della reazione può essere bassissima e quindi da un punto di vista biologico è praticamente come se non avesse luogo.

Ogni reazione catalizzata procede attraverso la formazione di un complesso attivato (enzima+substrato) la cui energia corrisponde all’energia di attivazione (differenza di energia tra lo stato basale e quello di transizione). C’è un primo salto energetico quando si forma il complesso attivato, un secondo salto energetico quando si forma il complesso enzima-prodotto e un terzo salto quando enzima e prodotto si staccano. Solo nel caso più semplice ci sono tre salti energetici, nella maggior parte delle reazioni si formano numerose specie chimiche transitorie chiamate intermedi di reazione. Il fattore critico (limitante) non è il numero di stati intermedi di transizione ma il passaggio con l’energia di attivazione più elevata. In presenza di un catalizzatore si ha una diminuzione dell’energia di attivazione.

La velocità di una reazione dipende dal numero di molecole che possiedono un livello energetico pari a quello dello stato di transizione. Se l’energia di attivazione viene abbassata, un numero maggiore di molecole raggiunge lo stato di transizione. La reazione sarà perciò più veloce.

Teoria della chiave e della serratura

(Emil Fisher, 1894)

Per permettere la formazione di tutti questi legami e forze di interazione, è necessario che la tasca dell’enzima si adatti molto bene al substrato. Esistono diverse teorie riguardanti la struttura della tasca; la prima fu quella formulata da Fisher:

• “Il substrato si combina con il sito attivo dell’enzima con lo stesso grado di specificità con cui una chiave entra nella serratura”;
• “Il riconoscimento (spesso tridimensionale) deve avvenire in modo da rispettare rigorosi criteri di complementarietà di struttura e di carica fra enzima e substrato” ➔ formazione di legami non covalenti tra enzima e substrato.

La teoria non spiega però perché poi l’enzima trasformi il substrato, che si adatta perfettamente alla sua tasca, in prodotto, che cambia almeno in parte la sua struttura e quindi sarà meno compatibile con la tasca.

Teoria dell’adattamento indotto

(“induced fit” - Koshland, 1958)

Variante della teoria precedente è quella dell’adattamento indotto, che sostiene che un enzima modifica in modo dinamico e reversibile la propria conformazione in seguito alla combinazione con il substrato ➔ il sito attivo assume una forma perfettamente complementare a quella del substrato solo dopo che il substrato si è legato. Questo adattamento si è reso necessario quando ci si è accorti che, studiando la tasca di un enzima libero, questa aveva conformazione differente rispetto a quando l’enzima era legato al substrato. Questa teoria ancora non spiega però la catalisi.

Oggi si ritiene che il numero delle interazioni tra il substrato e l’enzima sia massimo solo quando il substrato si trova nello stato di transizione, cioè che la tasca dell’enzima non sia perfettamente complementare né col substrato né col prodotto ma con gli stadi intermedi del substrato, cioè con gli stadi di transizione. La massima liberazione di energia di legame (che può essere usata per abbassare l’energia di attivazione) si ha nello stato di transizione. La massima interazione tra enzima e substrato si verifica nello stato di transizione che però è intrinsecamente instabile perché i vecchi legami si stanno rompendo e se ne stanno formando di nuovi, quindi si trasforma velocemente nel prodotto (visto che il ∆G complessivo è negativo) che si stacca dall’enzima.

N.B. Sia l’enzima che il substrato subiscono una distorsione conformazionale.

Fattori che influenzano la velocità delle reazioni enzimatiche

• pH
• T °
• Concentrazione dell’enzima
• Concentrazione del substrato

pH:

Il pH influenza:

• Struttura terziaria dell’enzima (pH estremi possono denaturare l’enzima).
• Ionizzazione del sito attivo (specifici gruppi del sito attivo devono essere ionizzati oppure non ionizzati affinché possano interagire con il substrato).
• Grado di dissociazione di eventuali gruppi acidi e basici sulle molecole di substrato.

Il pH ottimale: intervallo di valori di pH in cui la reazione viene catalizzata con la massima efficienza (varia a seconda dell’enzima). Es. pepsina: attiva in ambiente acido; tripsina: attiva a pH basico.

Temperatura:

Aumentando la temperatura aumenta la velocità di una reazione perché aumenta il numero di molecole che possiedono un’energia sufficiente a superare la barriera energetica.