Biochimica 1

Bioenergetica e termodinamica

Per il 2^o principio della termodinamica, qualsiasi processo naturale evolve verso un aumento del disordine. Tutte quelle reazioni che sono in grado di liberare energia, vengono definite esoergoniche (-ΔG) e sono reazioni spontanee in quanto seguono leggi termodinamiche (evolvono verso un aumento del disordine, meno energia meno ordine). Tali reazioni danno la → formazione di un prodotto con un livello energetico più basso rispetto ai reagenti, in quanto è stata liberata energia che verrà utilizzata per produrre lavoro, anche se da un punto di vista pratico non tutta l'energia può essere utilizzata per produrre lavoro in quanto una parte viene dissipata sotto forma di calore oppure perduta.

Per permettere la sintesi di materia più complessa, serve contrastare il 2^o principio della termodinamica fornendo alla reazione energia in grado di far diminuire il disordine producendo ordine (per mantenere ordine serve energia!). Negli organismi viventi l'ordine interno viene mantenuto prelevando energia libera dall'ambiente esterno, a sua volta gli organismi viventi rilasciano nell'ambiente un uguale quantità di energia sotto forma di calore e di entropia. Possiamo quindi dire che l'ordine prodotto viene compensato dal disordine che ne scaturisce (non nel sistema che reagisce ma nell'ambiente circostante). Tali reazioni vengono definite endoergoniche ed hanno bisogno appunto di energia per passare da un livello energetico basso ad uno più alto.

Per permettere la realizzazione di quanto detto, le nostre cellule accoppiano ad una reazione endoergonica (ΔG) una esoergonica che liberi un quantitativo di energia maggiore di quella che la reazione richiede in maniera tale che la somma della variazione di energia libera (ΔG) di entrambe le reazioni sia negativa (-ΔG), facendo divenire l'intero processo esoergonico (è ciò che avviene ad esempio nella reazione 1 della glicolisi). La fonte di energia libera usata dalle nostre cellule deriva prevalentemente dalla rottura di gruppi fosfato di molecole di ATP e GTP.

Le reazioni chimiche tendono ad avvenire spontaneamente fino a raggiungere uno stato di equilibrio, in cui i reagenti si trasformano in prodotti con la stessa velocità con cui i prodotti si trasformano in reagenti. Arrivati a questa condizione la ΔG=0 in quanto l'energia liberata dai reagenti per trasformarsi in prodotti viene utilizzata immediatamente dai prodotti per trasformarsi in reagenti, di conseguenza non si ha energia per produrre lavoro. Possiamo quindi definire la variazione di energia libera (ΔG) come un indice di quanto il sistema sia lontano dal punto di equilibrio (un oggetto posto a 10m avrà una certa Ep che sarà maggiore più si aumenta l'altezza, se l'oggetto è a contatto con il suolo l'Ep=0 in quanto tale energia viene annullata da quella gravitazionale).

Nella cellula la demolizione dell'ATP avviene in maniera spontanea in quanto tutti gli organismi viventi mantengono una concentrazione di ATP ben lontana dalla concentrazione all'equilibrio, ciò garantisce di prelevare energia dalla demolizione di tale molecola. Se si raggiunge l'equilibrio si avrebbe l'arresto dei processi di demolizione di ATP (tutte le reazioni chimiche procedono verso il raggiungimento dell'equilibrio = stabilità). I sistemi viventi non sono mai in equilibrio con l'ambiente che li circonda e i continui scambi spiegano come gli organismi possono creare ordine al loro interno senza andare contro il 2^o principio della termodinamica (le reazioni avvengono con l'obiettivo di raggiungere un equilibrio che non verrà mai raggiunto).

Le funzioni delle proteine

Le proteine sono molecole dinamiche le cui funzioni dipendono da interazioni con altre molecole. Una molecola unita reversibilmente ad un'altra proteina viene detta ligando. Un ligando si lega ad un sito sulla proteina detto sito di legame, complementare al ligando per: dimensione, forma, carica, e carattere idrofobico o idrofilico. Le proteine possono essere flessibili, infatti il legame tra una proteina e un ligando è spesso accompagnato da una modifica conformazionale della proteina, che rende il sito di legame più complementare al ligando, per trattenerlo più saldamente. Questo adattamento viene detto adattamento indotto.

Gli enzimi rappresentano un caso speciale di funzione proteica. Essi infatti catalizzano una reazione, trasformano chimicamente un'altra molecola. La molecola su cui agiscono gli enzimi sono dette substrati e il sito che lega il ligando è detto sito attivo.

La mioglobina e l'emoglobina forniscono molte informazioni sul modo in cui le proteine lavorano. La mioglobina riesce a trasportare l'ossigeno ai nostri tessuti, specialmente al tessuto muscolare, infatti non tutte le proteine riescono a trasportare l'ossigeno per lunghe distanze. Ciò viene reso possibile poiché il gruppo eme della mioglobina è costituito da una struttura organica complessa ad anello, in cui troviamo la protoporfirina, a cui è legato un singolo atomo di ferro allo stato ossidativo Fe²⁺ in modo da legare l'ossigeno reversibilmente. Allo stato Fe³⁺, non si legherebbe l'ossigeno. La funzione della mioglobina dipende dalla capacità delle proteine non solo di legare l'ossigeno, ma anche di rilasciarlo quando è necessario.

Il legame reversibile di un ligando ed una proteina può essere descritto dalla reazione all'equilibrio: P + L ↔ PL. La reazione è caratterizzata da una costante di equilibrio K_a = k_a · [P][L] / K_d. Dove k_a e K_d sono costanti di velocità. Il k iniziale indica la costante di associazione da non confondere con quello finale che indica la costante di dissociazione. La costante di associazione è equivalente al rapporto tra la velocità della reazione verso destra (reazione di associazione) e della reazione verso sinistra (reazione di dissociazione), che formano il complesso PL.

Il valore di K_a può essere determinato dal grafico di 0 in funzione della concentrazione del ligando andando a descrivere una funzione iperbolica. La frazione dei siti di legame per il ligando occupato tende ad arrivare asintoticamente a saturazione quando [L] aumenterà fino ad un certo punto massimo però.

L'emoglobina trasporta l'ossigeno nel sangue ed è una proteina tetramerica contenente 4 gruppi prostetici eme, uno per ciascuna subunità. L'emoglobina A contiene due tipi di globine: 2 catene α e due catene β. La struttura di queste due subunità è simile a quella della mioglobina. La struttura quaternaria dell'emoglobina è caratterizzata da interazioni molto forti tra le quattro subunità. L'interfaccia α₁β₁ (come la sua controparte α₂β₂) comprende circa 30 residui ed è sufficientemente forte da resistere a blandi trattamenti denaturanti.

L'analisi ai raggi X ha messo in evidenza due differenti conformazioni dell'emoglobina: lo stato R e lo stato T. L'ossigeno si lega ad entrambi gli stati dell'emoglobina, ma ha un'affinità maggiore per lo stato R. Il legame dell'ossigeno stabilizza lo stato R ed in assenza di ossigeno lo stato T è più stabile ed è quindi la conformazione prevalente della deossiemoglobina. Le lettere T ed R stanno ad indicare lo stato Teso e Rilasciato, in quanto lo stato teso viene stabilizzato da un gran numero di interazioni ioniche, molte delle quali si verificano nelle conformazioni α₁β₁ e α₂β₂.

L'emoglobina lega in modo efficace l'ossigeno nei polmoni. Questo non sarebbe possibile da un'altra qualsiasi proteina con un'elevata affinità poiché si saturerà facilmente nei polmoni ma non libererà molto ossigeno nei tessuti. Se invece la proteina presenta una bassa affinità per l'ossigeno, potrà rilasciarlo nei tessuti ma non sarà in grado di saturarsi nei polmoni. L'emoglobina risolve ciò mediante la sua transizione da uno stato a bassa affinità ad uno ad alta affinità.

Infatti il meccanismo sarà questo: inizialmente si legherà debolmente perché si lega ad una subunità nello stato T. Ciò determinerà una modifica conformazionale, infatti T si "convertirà" in R rendendo più facile il legame di una seconda molecola di ossigeno, presentando così una massima affinità per il suo ligando.

Una proteina allosterica è appunto quella in cui il legame di un ligando a un sito modifica la proprietà di un altro sito della stessa molecola. Questo tipo di legame è rappresentato da una curva sigmoide e può essere analizzato con il grafico di Hill.

Capitolo 6: Gli enzimi

Tutti gli enzimi sono proteine. La loro attività catalitica dipende dall'integrità della loro conformazione protonica. Alcuni enzimi hanno bisogno per la loro attività di altri gruppi chimici, chiamati cofattori. Un cofattore può essere costituito da uno o più ioni inorganici come: Fe²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺ o Zn²⁺ oppure da molecole complesse organiche o metallorganiche chiamate coenzimi. I coenzimi agiscono come trasportatori transitori di specifici gruppi funzionali. Un coenzima o un ione metallico legato covalentemente alla proteina enzimatica è definito gruppo prostetico. Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi coenzimi o ioni metallici è detto oloenzima, mentre la parte proteica di un enzima viene chiamata apoenzima o apoproteina.

L'attività degli enzimi è un processo fondamentale per gli organismi viventi. Nelle condizioni biologiche le reazioni non catalizzate tendono ad essere troppo lente ed inoltre possono essere non spontanee o improbabili. Un enzima supera questi problemi generando un ambiente specifico in cui una data reazione è energicamente favorita. Una caratteristica delle reazioni catalizzate dagli enzimi è proprio quella di avvenire all'interno dei confini di una tasca dell'enzima chiamata sito attivo. La molecola che si lega al sito attivo e su cui l'enzima agisce è detta substrato.

La funzione di un catalizzatore è quella di aumentare la velocità di una reazione. I catalizzatori non modificano però gli equilibri delle reazioni. Il punto di partenza per la reazione in un senso o nel senso opposto è definito stato basale e corrisponde al contributo di energia libera fornito dal sistema. Se un equilibrio è favorevole non significa però che la velocità della conversione di S in P sia elevata. La velocità di una reazione dipende da un parametro completamente diverso. Perché possa avvenire la reazione le molecole devono superare questa barriera e quindi devono raggiungere un livello energetico più elevato di quella basale. Al punto più alto della curva la molecola ha la stessa probabilità di decadere verso S o verso P. Questo punto è detto stato di transizione.

La differenza tra i livelli di energia dello stato di base allo stato di transizione è detta energia di attivazione. La velocità di una reazione dipende da questa energia. Ogni reazione è costituita da un intermedio di reazione che definisce ogni specie chimica che si forma durante una reazione. Gli equilibri di una reazione sono strettamente correlati alla variazione di energia libera standard della reazione stessa.

Come è possibile spiegare questo enorme aumento della velocità indotto dagli enzimi? Da dove arriva l'energia necessaria ad abbassare così drasticamente l'energia di attivazione di una specifica reazione? Alla prima è il riarrangiamento di legami covalenti che si ha durante una reazione catalizzata, infatti i gruppi funzionali catalizzati possono formare un legame covalente transitorio con il substrato rendendolo più attivo e reattivo. Alla seconda domanda invece: molta dell'energia che serve per abbassare l'energia di attivazione deriva dalle interazioni deboli e non covalenti che si instaurano tra il substrato e l'enzima.

Il fattore che distingue gli enzimi da tutti gli altri catalizzatori è la formazione di uno specifico complesso. La formazione di ogni interazione debole del complesso ES è accompagnata da un piccolo rilascio di energia libera, da cui dipende il grado di stabilità dell'interazione. L'energia che si libera dalle interazioni ES viene detta energia di legame, proprio essa è la fonte principale di energia libera usata dall'enzima per abbassare l'energia di attivazione. Uno dei fattori che modificano la velocità di una reazione catalizzata da un enzima purificato è la concentrazione del substrato. Però lo studio degli effetti del S è complicato poiché varia durante il corso di una reazione. Per eliminare questo problema si può valutare la velocità iniziale (V₀).

A concentrazioni relativamente basse di substrato, V₀ aumenta praticamente in modo lineare con l'aumento di S. A concentrazioni elevate di substrato più elevato, V₀ aumenta in misura minore sempre in funzione dell'aumento di S. Alla fine si arriva ad un punto in cui gli aumenti di V₀ in funzione di S diventano di entità sempre minore. In questa reazione più piatta della curva la velocità della reazione si avvicina alla velocità massima (V_max). In questo punto la reazione ha raggiunto la velocità massima possibile semplicemente perché è presente tanto substrato da saturare tutto l'enzima presente in soluzione, perciò un'ulteriore aggiunta di substrato non servirebbe in quanto non verrebbe più attaccato da enzimi. Ciò avviene perché non sono più presenti enzimi liberi, ma solo forme enzimatiche legate al substrato.

Questa idea diventò una teoria generale ad opera in particolare di Michaelis-Menten, l'equazione della velocità di una reazione a singolo substrato catalizzato da un enzima:

v = (V_max[S]) / (K_m + [S])

L'equazione descrive il comportamento cinetico di molti enzimi, e tutti gli enzimi che presentano una relazione di tipo iperbolico tra velocità della reazione catalizzata e concentrazione del substrato. V_max rappresenta la velocità massima che la reazione è in grado di raggiungere, determinando → una situazione in cui tutti gli enzimi liberi si sono trasformati nel complesso ES, di conseguenza non si ha più enzima libero in soluzione. K_m è un insieme di costante e rappresenta affinità di un enzima nei confronti di un substrato, più aumenta la K_m più diminuisce l'affinità. K_cat, detta anche numero di turnover, equivale al numero di molecole di substrato che vengono convertite in prodotto nell'unità di tempo da una singola molecola enzimatica quando l'enzima è saturo con il substrato.

Gli enzimi possono anche essere soggetti ad inibizione reversibile o irreversibile. Gli inibitori sono sostanze che rallentano una catalisi dunque il legame ES. Esistono due tipi di inibizione enzimatica: l'inibizione reversibile e l'inibizione irreversibile.

L'inibizione reversibile: Un tipo comune di inibizione reversibile è chiamato inibizione competitiva. Un inibizione competitiva compete con il substrato per il sito attivo dell'enzima. Quando l'inibitore occupa il sito attivo, impedisce il legame del substrato con l'enzima. L'effetto è quello di diminuire la concentrazione di enzima libero disponibile ad agire. In presenza di un inibitore competitivo, la velocità max non si modifica, ma aumenta la K_m.

Due altri tipi di inibizione reversibile, l'inibizione non competitiva e l'inibizione mista. L'inibitore incompetitiva si lega ad un sito distinto del substrato e quindi permette al substrato di legarsi, contrariamente all'inibitore competitivo, in cui poteva legarsi o solo l'inibitore o il substrato. Si osservano solo per gli enzimi con due o più strati. L'inibitore misto si lega ad un sito diverso dal sito attivo ma può legarsi sia a E, sia a ES. Un inibitore misto in genere modifica i valori di K_m e di V_max.

Inibizione irreversibile. Gli inibitori irreversibili si legano covalentemente, eliminando così gruppi funzionali essenziali, o formano associazioni non covalenti particolarmente stabili annullando l'attività enzimatica. L'attività enzimatica dipende dal pH, infatti gli enzimi hanno un pH ottimale in cui la loro attività è massima a valori invece di pH più bassi o più elevati l'attività enzimatica tende a diminuire, queste variazioni di pH dipendono dalla natura dagli amminoacidi coinvolti.

La chimotripsina

La chimotripsina è una proteasi, cioè un enzima che catalizza la rottura idrolitica di legami peptidici. L'enzima non catalizza l'attacco diretto di una molecola di acqua sul legame peptidico, ma forma invece un intermedio covalente transitorio acil-enzima. La reazione procede attraverso due fasi principali. Nella fase di acilazione viene rotto il legame peptidico e si forma un legame estere tra l'atomo di carbonio carbonilico del peptide e l'enzima. Nella fase di deacilazione il legame estere viene idrolizzato e viene rigenerato l'enzima libero non acilitato. La chimotripsina catalizza anche l'idrolisi di piccoli esteri e ammidi. Queste reazioni sono molto più lente in quanto l'energia di legame che si rende disponibile con questi substrati più piccoli è inferiore e son quindi facili da studiare.

L'esochinasi

L'esoquinasi è un enzima che catalizza la reazione reversibile a due substrati. L'esoquinasi è...