Biochimica 1

O C S

La reazione complessiva catalizzata dal complesso della piruvato deidrogenasi è una

decarbossilazione ossidativa, un processo di ossidazione irreversibile in cui il gruppo carbossilico

-

(-COOH) viene rimosso dal piruvato sotto forma di una molecola di CO , e i due atomi di carbonio

che restano diventano il gruppo acetilico (-COCH ) legato al coenzima A.

3 - -

Il NADH formato in questa reazione porta uno ione idruro con i suoi due e (H ) alla catena

respiratoria che li trasporta poi all'O 2. -

Il trasferimento degli e all'O produce 2,5 molecole di ATP per coppie di e .

La deidrogenazione e la decarbossilazione combinata del piruvato ad acetil – CoA coinvolgono

l'azione sequenziale di tre enzimi diversi e di cinque coenzimi: la tiamina pirofosfato (TPP), il

flavin adenin dinucleotide (FAD), il coenzima A (CoA), il nicotinammide adenin dinucleotide

(NAD) e il lipoato (acido lipoico).

Il CoA ha un gruppo reattivo (-SH) essenziale per la funzione di trasportatore di gruppi acilici in un

certo numero di reazioni metavoliche. I gruppi acilici formano legami tioesteri, quando si legano

covalentemente al gruppo tiolico del CoA.

Data la loro elevata energia libera di idrolisi, i tioesteri hanno un elevato potenziale di trasferimento

del gruppo acilico ad una grande varietà di molecole accettrici.

Il lipoato ha due gruppi tiolici che possono essere ossidati in modo reversibile e formare un ponte di

-

solfuro (-S-S-). Questo coenzima può servire sia come trasportatore di e sia come trasportatore di

acili.

Il complesso della piruvato deidrogenasi è costituto da molte copie di tre enzimi: la piruvato

deidrogenasi (E ), la diidrolipoil transacetilasi (E ) e la diidrolipoil deidrogenasi (E ).

1 2 3

Questo complesso catalizza le cinque reazioni in modo sequenziale.

La prima tappa è essenzialmente identica alla reazione catalizzata dalla piruvato

– carbossilasi; l'atomo C – 1 del piruvato viene rilasciato sotto forma di CO e l'atomo C – 2,

2

che nel piruvato ha lo stato di ossidazione di un aldeide, viene legato alla TPP come gruppo

idrossietilico. Questa tappa è la più lenta.

Nella seconda, il gruppo idrossietilico viene ossidato a livello di acido carbossilico (acetato).

– -

I due e rimossi nella reazione vanno a riprodurre il ponte – S – S – del gruppo lipoilico

sull'E formando due gruppi tiolici (-SH).

2

Il residuo acetilico in questa reazione di ossidoriduzione viene prima esterificato su uno dei

due gruppi -SH del gruppo lipoilico e poi transesterificato al CoA, formando

l'acetil -CoA (tappa 3)

Quindi l'energia dell'ossidazione guida la formazione di un tioestere ad alta energia

dell'acetato.

La restante parte della reazione catalizzata dal complesso PDH (da E tappe 4 e 5) è una

3

serie di trasferimenti elettronici necessari a rigenerare la forma ossidata a disolfuro del

gruppo lipoilico dell'E e a preparare il complesso per un altro ciclo di ossidazione.

2

- +

Gli e rimossi dal gruppo diossietilico derivato dal piruvato, passano al NAD , transitando prima

attraverso il FAD.

Tutti gli enzimi e coenzimi sono raggruppati insieme, consentendo agli intermedi di reagire

facilmente e senza dover diffondere fuori dalla superficie di questo complesso enzimatico.

Per iniziare un giro del ciclo, l'acetil CoA dona il suo gruppo acetilico all'ossalacetato, un composto

a quattro atomi di carbonio, formando il citrato a sei atomi di carbonio.

Il citrato viene poi trasformato in isocitrato, anch'esso a sei atomi di carbonio, che viene

deidrogenato con perdita di CO ,producendo il composto a cinque atomi di carbonio

2

α – chetogluterato.

Quest'ultimo prende un'altra molecola di CO per formare il succinato, un posto a quattro atomi di

2

carbonio.

Il succinato viene convertito enzimaticamente in tre tappe in ossalacetato, il quale è ora di nuovo

pronto a reagire con un'altra molecola di acetil – CoA per iniziare un secondo giro del ciclo.

In ogni giro del ciclo entra un gruppo acetilico sotto forma di acetil – CoA ed escono due molecole

di CO , inoltre non vi è un consumo netto di ossalacetato ed una molecola di esso è in teoria

2

sufficiente a ossidare un numero infinito di gruppi acetilici.

Quattro delle otto tappe di questo processo sono ossidazioni, in cui l'energia dell'ossidazione viene

conservata con un alto grado di efficienza mediante la formazione dei coenzimi ridotti NADH e

FADH .

2

È la via metabolica principale per la formazione di energia.

Negli eucarioti l'intera serie di reazioni avvengono nei mitocondri.

1) Formazione del citrato (IRREVERSIBILE)

La prima reazione del ciclo è la condensazione dell'acetil – CoA con l'ossalacetato per

formare citraro, reazione catalizzata dalla citrato sintasi.

L'atomo di cardonio metilico del gruppo acetilico si lega al gruppo carbonilico (C – 2)

dell'ossalacetato.

Il citril – CoA è un intermedio transitorio che si forma sul sito attivo dell'enzima e va

incontro ad una rapida idrolisi, producendo CoA libero e citrato.

L'idrolisi di questo intermedio tioestere ad elevata energia rende la reazione di scissione

fortemente esoergonica.

La variazione di energia libera standard della reazione catalizzata dalla citrato sintasi è

essenziale per il funzionamento del ciclo, in quanto la concentrazione dell'ossalacetato

normalmente è molto bassa.

Il CoA liberato in questa reazione viene riciclato e può partecipare alla decarbossilazione

ossidativa di un'altra molecola di piruvato da parte del complesso delle piruvato

deidrogenasi.

2) Formazione dell'isocitrato attraverso il cis – aconitato

L'enzima aconitasi (o aconitato idratasi) catalizza la trasformazione reversibile del citrato in

isocitrato, mediante la formazione intermedia dell'acido tricarbossilico cis – aconitato.

In questa reazione abbiamo prima una liberazione di una molecola d'acqua, che verrà poi

rintrodotta in seguito.

3) Ossidazione dell'isocitrato ad α – chetoglutarato e CO

2

È la prima reazione di deidrogenazione.

L'isocitrato deidrogenasi catalizza la decarbossilazione ossidativa dell'isocitrato per formare

α – chetoglutarato.

2+

Uno ione Mn presente nel sito attivo interagisce con il gruppo carbonilico dell'intermedio

ossalasuccinato che si forma transitoriamente e non lascia il suo sito di legame fino alla sua

conversione in α – chetoglutarato mediante decarbossilazione. + +

Vi sono due forme di isocitrato deidrogenasi: una richiede NAD e un'altra NADPH .

La reazione complessiva catalizzata da due enzimi è uguale.

4) Ossidazione dell' α – chetoglutarato a succinil – CoA e CO . (IRREVERSIBILE)

2

Reazione di decarbossilazione ossidativa, in cui l' α – chetoglutarato viene trasformato in

+

succinil – CoA e CO dal complesso dell' α – chetoglutarato deidrogenasi; il NAD è

2 -

l'accettore finale degli e e il CoA è il trasportatore del gruppo succinile.

L'energia libera dell'ossidazione dell' α – chetoglutarato è conservata mediante la

formazione del legame tioestere del succinil – CoA.

Questa reazione è praticamente identica alla reazione catalizzata dal complesso della

piruvato deidrogenasi; il complesso dell'α – chetoglutarato deidrogenasi è molto simile al

PDH sia come struttura che come funzione.

5) Conversione del succinil – CoA a succinato (ATP – GTP)

Il succinil CoA, come l'acetil CoA, ha un legame tioestere con un'energia libera di idrolisi

fortemente negativa (ΔG= -36 kj/mole).

L'energia rilasciata dalla rottura del legame tioestere viene usata per favorire la sintesi di un

legame fosfoanidride sotto froma di GTP o ATP con un ΔG netto di soli -2,9 kj/mole.

Il processo porta alla formazione di succinato.

L'energia che catalizza questa reazione reversibile viene detta succinil CoA sintetasi.

Il gruppo fosforico che ha un elevato potenziale di trasferimento di gruppo, viene trasferito

all'ADP (o al GDP) per formare ATP (o GTP).

6) Ossidazione del succinato o fumarato

Il succinato formato dal succinil – CoA viene ossidato a fumarato da parte della succinato

deidrogenasi.

Negli eucarioti la succinato deidrogenasi è legata saldamente alla membrana interna dei

mitocondri.

L'enzima contiene tre diversi centri ferro – zolfo e una molecola di FAD legata

covalentemente.

-

Gli e estratti dal succinato passano attraverso il FAD e i centri ferro – zolfo prima di entrare

-

nella catena di trasporto degli e della membrana mitocondriale interna.

-

Il flusso di e dal succinato attraverso questi trasportatori fino all'accettore finale, l'O è

2

-

accoppiato alla sintesi di circa 1,5 molecole di ATP per coppia di e (fosforilazione legata

alla respirazione).

7) Idratazione del fumarato a malato

L'idratazione reversibile del fumarato a L – malato è catalizzata dalla fumarasi (fumarato

idratasi).

In questa reazione lo stato di transizione è un carbonione.

L'enzima è altamente stereospecifico e catalizza l'idratazione del doppio legame trans del

fumarato, ma non agisce sul maleato, l'isomero cis del fumarato.

8) Ossidazione del malato a ossalacetato

L' L – malato deidrogenasi NAD dipendente catalizza l'ossidazione del L – malato a

ossalacetato.

Nelle condizioni termodinamiche standard questo equilibrio è molto spostato a sinistra.

Nelle cellule invece, l'ossalacetato viene rimosso continuamente dalla reazione altamente

esoergonica della citrato sintasi, contribuendo a mantenere estremamente bassa la

concentrazione di ossalacetato e contemporaneamente spingendo la reazione della malato

deidrogenasi verso la formazione dell'ossalacetato.

+

Acetil – CoA , 3 NAD , 1 FAD , 1 GDP , Pi , 2 H O

2

| +

2 CO , CoASH , 3 NADH , 1 FADH , 1 GDP , 2 H

2 2

NADH = 3 ATP 2 molecole CO (uscite)

2

3 GTP = 3 ATP 1 molecola GTP

FADH = 2 ATP 3 molecole NADH

2 1 molecola FADH

(1, 2 , 7) Queste tappe non producono energia

Nel ciclo è entrato un gruppo acetilico con due atomi di carbonio, combinandosi con l'ossalacetato.

I due atomi di carbonio sono poi usciti dal ciclo sotto forma di due molecole di CO 2

dall'ossidazione prima dell'isocitrato e poi dell' α – chetoglutarato.

L'energia rilasciata da queste ossidazioni è stata conservata mediante la riduzione di 3 molecole di

+

NAD e di una di FAD nella produzione di una molecola di GTP (ATP).

Alla fine del ciclo &egr