Basi cellulari e genetiche della medicina - Appunti

Green fluorescent protein (GFP)

La proteina è fluorescente perché ha un elemento cromoforo che eccitato dalla luce tramite legami transitori tra porzioni di amminoacidi emette luce con caratteristiche diverse. Cambiando gli amminoacidi (sequenze) si ottiene un cambiamento di luce prodotta dalla porzione cromofora: RFP, VFP, CFP ecc.

Nell'aequorea, animale fluorescente dove è stata scoperta la GFP, la proteina viene illuminata ed eccitata da un'altra proteina chiamata aequorina che irradia di luce UV la porzione cromofora della GFP permettendogli di emettere luce verde al buio. AEQUORINA → Irradia di luce Blu, GFP → GFP si eccita → Luce Verde.

La GFP consente di studiare proteine per luminescenza solo in condizioni di eccitazione della porzione cromofora grazie a luce del microscopio (tipicamente blu-UV).

Microscopio confocale

Il microscopio confocale è diverso dal tradizionale. Mentre con il tradizionale i dettagli non sono evidenti, il confocale riesce a convogliare tutta la luce su un unico punto oggetto di interesse tramite specchi e lenti particolari, permettendo di vedere il tessuto in sezioni e evidenziare i dettagli (ad esempio dettagli dei mitocondri).

• È stato usato per studiare il vacuolo contrattile di alcuni eucarioti inferiori che regola l'osmolarità come un piccolo rene.
• La misura delle dimensioni di una proteina è il dalton (peso di un atomo di idrogeno). Per convenzione, 1 amminoacido sono circa 100 dalton.
• La misura delle dimensioni del DNA o RNA è in bp (base pair), paio inteso di purina-pirimidina.

Nucleolo

Ve ne possono essere più di 1 (solitamente 2-3). Sono la sede di sintesi degli RNA ribosomiali e assemblamento dei ribosomi. Le regioni del DNA che contengono geni per gli rRNA si adagiano nel nucleolo e lì vengono trascritti gli rRNA.

Nel nucleolo: trascritto rRNA → viene complessato con proteine ribosomiali (beta importina) → nascita di subunità ribosomiali.

Una proteina di trasporto della membrana nucleare è la beta importina che importa proteine ribosomiali per trasporto attivo (> 50 kDa).

Ribosomi

La dimensione dei ribosomi non è espressa in dalton (sono troppo grandi!) ma in svedberg → coefficiente di sedimentazione se centrifugato in materiale di densità definita (esempio corpo e mare salato).

• Eucariotici: 80sv (60 maggiore con RNA 5sv, 5,8sv, 28sv e 40 minore con RNA 18sv)
• Procariotici: 70sv (50 maggiore, 30 minore)

Gli rRNA hanno solitamente funzione strutturale (complessano le proteine ribosomiali) ma possono avere anche funzione enzimatica → ribozimi, enzimi a RNA.

Reticolo Endoplasmatico

È tutto connesso insieme → è vero che è adeso alla membrana nucleare ma spesso non ha una localizzazione precisa nella cellula → può variare ampiamente da cellula a cellula e da sezione a sezione.

• Le dimensioni variano! → se la sintesi proteica e la proliferazione sono molto attive il RE aumenta ampiamente di dimensioni → fino a diventare organello più grande. È deputato alla sintesi di proteine di membrana o destinate alla secrezione e di lipidi.
• Si divide in:
  • Ruvido: costellato di ribosomi e deputato alla sintesi proteica di membrana o secrezione → proteine che sono destinate alla membrana plasmatica o che finiscono nel lume del RER.
  • Liscio: deputato alla sintesi di lipidi.

Non vi è una netta distinzione spaziale tra RER e REL! Sono intercalati, è puramente funzionale la distinzione! Entrambi si occupano di creare nuove membrane.

Golgi

Maturazione di proteine e lipidi. Non ha ovviamente una localizzazione precisa. È composto da membrane impilate una sull'altra.

L'andamento è (3 compartimenti funzionali): ricordare che la divisione è funzionale.

RE → Cis Golgi → Golgi mediano → Trans Golgi → Membrana, secrezione o lisosomi. Movimento → Anterogrado.

Confronto: Reticolo Endoplasmatico e Golgi

• Reticolo Endoplasmatico:
  • Sintesi di proteine.
  • Ripiegamento di proteine (foldasi).
  • Aggiunta di ponti disolfuro (dominio IGG ad esempio) → no nel citosol perché troppo riducente.
  • Glicosilazione di tipo N → mediante aggiunta di asparagina.
  • Aggiunta di ancore lipidiche.
  • Sintesi di precursori come cerammide.
  • Sintesi colesterolo.
• Golgi:
  • Glicosilazione di tipo O (mediante gruppi OH- di proteine serina treonina tirosina e lipidi).
  • Sfingomielina dal precursore cerammide (sintetizzato da REL).
  • Solfatazione di proteine.
  • Acetilazione di protezione (ch3coo-).
  • Taglio di pro-proteine da precursori non funzionali → molti enzimi (esempio enzimi lisosomiali) sono secreti come precursori inattivi e tagliati a livello del Golgi per essere attivati.
  • Reticolo Endoplasmatico + Golgi → Compito principale → Creare nuove membrane.

Mitocondri

Doppia membrana particolare (bilayer).

• Esterna → costellata di pori più piccoli della membrana nucleare (diffusione di proteine < 5 kDa). La proteina che costituisce il poro è la porina. → 50% lipidi 50% proteine (normale!).
• Interna → produce invaginazioni (creste) è composta dal 70% di una porzione proteica e 30% porzione lipidica. Contiene cardiolipina → presente nei batteri → teoria endosimbiontica è sede degli enzimi della fosforillazione ossidativa (70% proteica!).

Nel lume mitocondriale (interno):

• Ci sono gli enzimi del ciclo di Krebs.
• Vi è la beta ossidazione degli acidi grassi.
• Vi è la sintesi di alcuni amminoacidi.
• Vi è la sintesi di fosfatidilserina (interno membrana fosfolipide carico negativamente).
• Produzione di cardiolipina.
• Vi è la produzione di gruppi eme (gruppo eme = ferro + porfirina).

Possiedono DNA circolare privo di istoni e introni (come i batteri teoria endosimbiontica) che codifica per circa 13 proteine (le altre sono codificate dal genoma nucleare). Sono autonomi quindi → solo in parte. Contengono ribosomi 70sv pari a quelli batterici (anche se hanno 2 microunità e non 3 per cui vi sono dubbi). Sono circondati e ancorati dal citoscheletro con cui interagiscono (provato sperimentalmente depolimerizzando tubulina). La loro locazione varia!

Lisosomi

• Dimensione casuale.
• Dislocazione casuale.
• Enzimi particolari e trasporto attivo all'interno di ioni H+ (ph 5).
• Idrolasi attive (proteasi, glicosidasi, fosfatasi, fosfolipasi, nucleasi....).
• Possono fagocitare agenti esterni penetrati tramite endocitosi (fagosomi) o pinocitosi (macropinosomi) fondendosi con queste vescicole e digerendole.
• Possono degradare organelli stessi della cellula → ad esempio mitocondri o organelli morti → autofagia (in caso di digiuno ad esempio).

Hanno funzione difensiva e di nutrizione.

La cellula

La compartimentazione è necessaria alla vita. La sua assenza comporta la morte biologica. Gli enzimi non sono localizzati a caso ma ben delimitati (Golgi enzimi specifici, RER enzimi specifici...).

I processi anabolici e catabolici sono ordinati e precisi (non casuali o sparsi) → rottura → disordine!

Divisione

• Procarioti → batteri
• Protozoi → eucarioti unicellulari
• Metazoi (esempio uomo) → eucarioti pluricellulari

Procarioti

• Tipica dimensione 2 mM
• Sempre unicellulari (anche se formano colonie restano autonomi)
• Hanno flagelli (flagellina)
• Hanno vita autonoma
• Non hanno compartimentazione
• Hanno parete cellulare di glicolipidi (peptidoglicani)
• Non hanno nucleo, al massimo una regione contenente DNA (nucleoide)
• Hanno ribosomi liberi che si attaccano per la sintesi di proteine di secrezione o di membrana alla membrana cellulare
• Non hanno citoscheletro (ma hanno proteine simili a tubulina e actina)
• Non hanno istoni (ma hanno comunque proteine che compattano DNA)
• Non producono mai glicoproteine! Non hanno attività di glicosilazione (ma producono glicolipidi e LPS)
• Possono fissare l'azoto (unica risorsa per i mammiferi)
• Non sono mai pluricellulari
• Hanno un differenziamento estremamente limitato
• Hanno un ampio range di vita e habitat

Eucarioti

• Dimensioni di 2-100 mM (mediamente 10 mM umane)
• Sono compartimentate
• Hanno citoscheletro
• Hanno range di vita limitato
• Si differenziano

Riepilogo dimensioni

• Batteri: 2 mM
• Virus (si credeva) 0.2 mM ma poi scoperti: mimivirus, mamavirus, pandoravirus
• Cellule eucariote: 2-100 mM
• Membrana cellulare: 5-7 nM
• Interspazio tra teste fosfolipidiche: 2 nM

Virus

Si credeva più piccoli dei batteri. Esistono:

• Virus a DNA
• Virus a RNA
• Retrovirus (usano intermedio a DNA che viene trascritto)

Esistono anche mimivirus e mamavirus (pandoravirus → simile a batterio, non ha il capside virale) che si sono scoperti tardi in quanto sfuggivano ai tradizionali sistemi di filtrazione (troppo grandi, sembravano batteri). Hanno dimensioni simili ai batteri (2 mM). Inoltre:

• Sono più complessi
• Hanno grosse quantità di DNA
• Possiedono proteine di trascrizione (hanno ancora bisogno per vivere di una protezione cellulare però)
• Solitamente sono parassiti di amebe

Cicli dei virus

• Lisogeno (latente): fase in cui proliferano e replicano il proprio materiale genetico all'interno della cellula.
• Litico → si manifestano lisando la cellula e creando prodotti alterati.
• I virus oncogeni non lisano la cellula ma producono modificazioni del DNA che inducono proliferazione (tumore).

La cellula eucariotica

La cellula possiede una membrana (non rigida). Vi sono alcune proiezioni di membrana dovute a una polimerizzazione momentanea di una proteina del citoscheletro, solitamente actina:

• Filopodi: piccole estroflessioni filamentari.
• Pseudopodi: estroflessioni supportate dal citoscheletro (atte ad esempio al movimento).

Le membrane

Hanno una struttura comune:

• Spessore circa 5 nM (interspazio tra teste fosfolipidiche 2 nM).
• Determina e delimita spazi intermembrana (necessari per la vita) con determinati ambienti e condizioni adatte a singoli enzimi e situazioni.
• Esempio: ambiente interno dei lisosomi a ph 5, ambiente interno mitocondri basico (trasporto elettroni), mitocondri ricchi di calcio, RER ricco di calcio, citosol riducente (cede elettroni).
• Esempio: nel citosol è presente il glutatione GSH che lega H+ e O2 neutralizzandoli e mantenendo ambiente riducente per evitare la formazione di ponti disolfuro tra cisteine gruppo.

Caratteristiche di membrana

• Stabile in ambiente acquoso (cellule senza umidità superficiale muoiono, esempio epidermide cornea).
• Permeabilità ridotta e selettiva a acqua (passa poco), ioni, enzimi, proteine, ecc.
• Comunicazione tra comparti intercellulari e con l'esterno.
• Autorigenerazione (le membrane prendono sempre origine da altre membrane! Come le cellule traggono sempre origine da altre cellule).
• Non si possono creare ex novo cellule senza mitocondri ecc., si è riusciti in parte con i perossisomi dello lievito, quindi no membrane ex novo (senza REL anche avendo geni non produrremmo membrane)!

Membrane biologiche

Hanno una base di fosfolipidi che garantisce stabilità in acqua e rigidità. Le membrane interne solitamente sono un po' meno spesse a causa di una presenza diversa di colesterolo e sfingolipidi.

Contengono proteine (periferiche o integrali) che regolano permeabilità e comunicazione selettiva. La membrana può muoversi lateralmente (ci sono solo deboli interazioni idrofobiche tra code idrofobe). Movimento baussiano: le proteine solitamente possono muoversi lateralmente e "rimescolarsi".

L'unica è la membrana nucleare che ha un citoscheletro (cortex cellulare/lamina nucleare) che ancora le proteine e quando marcate non si rismistano, non si possono muovere (marcate con laser nero rimangono nere).

Fosfolipidi

Glicerolo + 2 acidi grassi + fosfato legato a un R polare (acido fosfoditilcolinico)

• Fosfaditil-etanoalamina
• Serina
• Colina
• Inositolo fosfato

Regione idrofobica (acidi grassi), idrofilica fosfato legato a molecola polare. Se le catene sono sature hanno forma dritta → più rigida. Se le catene sono insature hanno un'angolatura che determina in parte la fluidità di membrana → più movimento fluido.

Struttura dei fosfolipidi in acqua

• Micelle: singolo strato fosfolipidico senza acqua all'interno ma solo all'esterno. Se si supera la concentrazione critica micellare → liposoma.
• Liposoma: doppio strato interno -esterno con acqua sia dentro sia fuori → molto stabile in ambiente acquoso.
• Se ci sono anche proteine → membrana cellulare.

Movimento dei fosfolipidi

I fosfolipidi si muovono in modo direttamente proporzionale alla temperatura:

• + temperatura + libertà di movimento
• - temperatura - libertà di movimento (la febbre può rompere la membrana per eccessivo movimento)

Colesterolo

Ha una struttura più rigida (sterolo 4 anelli condensati) e una piccola parte polare (gruppo OH) pertanto è più rigido dei fosfolipidi. Si interpone tra le parti idrofobiche dei fosfolipidi e modifica la forma delle catene in particolare:

• Le rende più fisse con l'aumentare della temperatura
• Le rende più mobili al diminuire della temperatura
• Un colesterolo troppo esiguo causa tumori, molto alto determina eccessiva rigidità.

La cellula vegetale non è dotata di colesterolo (ma ha parete cellulare di cellulosa).

Lipidi e sfingolipidi

La base è il cerammide. Derivano da sfingosina (glicerolo con due OH e un NH3+)(glicerolo + serina). Presentano due gruppi OH- che possono essere sostituiti da fosfoetanolammina e fosfoditilcolina.

Glicolipidi

Se ho uno zucchero che sostituisca fosfato:

• Glicolipidi es. galattocerebroside (zucchero galattosio).
• Glicolipidi derivati da fosfolipidi = gliceroglicolipidi (da glicerolo) esempio galattocerebroside.
• Glicolipidi derivati da sfingolipidi = Sfingoglicolipidi (da sfingosina).

Glicolipidi sono sempre rivolti all'esterno e mai all'interno quindi:

• Interagiscono con l'acqua e legandone uno strato mantengono idratate le membrane (necessario).
• Assumono una forma distesa a contatto con l'acqua.
• Proteggono la membrana.
• Sono i primi ad avere contatto e a proteggere da agenti esterni (proteasi, batteri ...).
• Sono spesso antigeni.

Antigeni

Antigene = zucchero legato a glicolipide o proteina. Le differenze tra gruppi A, B, 0 sono esclusivamente l'ultimo zucchero di catena di un glicolipide (cambia solo l'ultimo) → origina risposta anticorpale.

Composizione delle membrane

Le membrane hanno differenze di composizione.

Esempio: nei mitocondri è assente la sfingomielina e ridottissimo il colesterolo, mentre è molto presente la cardiolipina. Questo perché si crede che i mitocondri abbiano origine batterica come endosimbionti, e si è evidenziato che nei procarioti è assente sfingomielina e colesterolo mentre è presente cardiolipina.

Composizione interna delle membrane

Le membrane hanno differenze di composizione addirittura nella stessa membrana.

• Esterno: fosfoditilcolina e sfingomielina.
• Interno: fosfoditilserina e fosfodietiletanolammina.

La fosfoditilserina è carica negativamente pertanto contribuisce a mantenere la differenza di potenziale interna a -70mv.

Rafts o zattere di membrana

I lipidi non hanno la medesima concentrazione ovunque.

Esempio: esperimento liposomi con fosfoditilcolina e sfingomielina e fosfoditilcolina sfingomielina colesterolo forma grumi.

• Sfingomielina + colesterolo = rafts zattere lipidiche → possono ospitare proteine per segnalazione → formano microdomini.

Vi sono due teorie, una concepisce l'esistenza di rafts, l'altra sostiene che in realtà non esistano.

Fosfatidilinositoli o fosfatidilinositidi

L'inositolo è vagamente simile a uno zucchero (come i galattocerebrosidi) → legato come molecola polare al fosfato. L'inositolo ha numerosi gruppi OH che possono essere fosforillati!

Se vi si legano altri fosfati, il fosfatidilinositolo assume numerini che indicano la posizione dei gruppi fosfato.

Esempio: fosfatidilinositolo 3-4-5 fosfato. Gli enzimi che fosforillano il fosfatidilinositolo si chiamano PIK fosfatidilinositolocinasi → aggiungono gruppi fosfato, assumono numerini in base a dove lo aggiungono: esempio PI3-4-5K.

Concentrazione nei vari compartimenti

In membrane diverse vi sono concentrazioni diverse di questo lipide:

• Membrana plasmatica: fosfatidilinositolo 4-5 fosfato.
• Golgi: fosfatidilinositolo 4 fosfato.
• Endosomi: fosfatidilinositolo 345 fosfato.
• Lisosomi: fosfatidilinositolo 3 fosfato.

Fosfatasi e fosfolipasi

Gli enzimi che defosforillano il fosfatidilinositolo fosfato si chiamano fosfatasi o fosfolipasi (se segano una parte del lipide).

Alcune proteine si legano momentaneamente a fosfatidilinositoli fosfati e consentono alcune funzioni.

Esempio: proteina che lega l'actina riconosce il fosfatidilinositolo 4,5 fosfato presente nella parte interna della membrana plasmatica, che pertanto è circondata da un endoscheletro di actina → quando si vuole effettuare endocitosi, una PI 3-4-5 K fosforilla il fosfatidilinositolo 4-5 fosfato trasformandolo in fosfatidilinositolo 3-4-5 fos