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Basi cellulari della medicina

Gli argomenti trattati sono:
Struttura e architettura della cellula e dei compartimenti intracellulari
Compartimenti della cellula
Trasporto di ioni e molecole attraverso le membrane
Conversione di energia
Comunicazione intercellulare: trasduzione dei segnali
Il citoscheletro
Rigenerazione dei compartimenti cellulari
Processi di endocitosi e fagocitosi
Adesione... Vedi di più

Esame di Basi cellulari e genetiche della medicina docente Prof. S. Bozzaro

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- Filamenti intermedi: sono distribuiti in tutta la cellula, ma non hanno un centro organizzatore;

formano corde intrecciate tra loro, creando resistenza. Questi filamenti non sono presenti in tutte

le cellule (non sono essenziali per la cellula eucariotica). Sono essenziali solo per la stabilità

meccanica delle cellule. Se si crea un embrione di topo nel quale si inattivano i geni per i filamenti

intermedi, l’embrione è in grado di sopravvivere, ma l’embrione è molto debole: le cellule

muscolari, dove è essenziale la presenza dei filamenti intermedi per permettere la formazione di

desmosomi (i quali permettono alle cellule di non staccarsi quando sono sottoposte a tensione), si

staccano le une dalle altre. Quindi non sono letali se non ci sono, ma sono essenziali per la stabilità

meccanica

Se nella stessa cellula si marcano i tre tipi di fibre si può osservare la sovrapposizione dei tre elementi. Tutti

e tre sono formati da monomeri di base (nel caso dei microfilamenti sono tutti actina, nel caso dei

microtubuli sono tubulina α e β, nel caso dei filamenti intermedi ci sono vari monomeri e questo è il motivo

per cui i filamenti intermedi hanno spessore e diametro vario). Sono stati scoperti farmaci in grado di

stabilizzare i vari componenti, cioè congelano la forma dei filamenti nel momento in cui vengono usati

questi farmaci: la falloidina irrigidisce i filamenti (già formati) di actina, mentre il taxolo agisce sui

microtubuli e il withaferin sui filamenti intermedi; ci sono farmaci che invece destabilizzano: latrunculina,

citocalasina e swinolide per l’actina, colchicina, colcemide, vinblastina, vincistina, nocodazolo per i

microtubuli (usati per i tumori, ma essi non agiscono solo sulle cellule tumorali ma anche sulle cellule

normali). Se ci fossero dei difetti nell’actina gli effetti sarebbero letali (non se c’è un difetto in una proteina

che interagisce con l’actina).

Il citoscheletro di ACTINA

L’actina si trova in:

- Pseudopodi, le regioni delle cellule con maggior motilità: marcando l’actina nelle cellule in

chiemiotassi si vede che l’actina polimerizza proprio in queste regioni.

- Lamellipodi: l’actina è evidenziata nei cheratinociti, che hanno la caratteristica di assumere una

determinata forma per poi portare tutta la membrana verso la regione-bersaglio. Ogni volta in cui

c’è una proiezione di membrana, al di sotto di essa c’è l’actina: l’actina permette alla membrana di

proiettarsi verso l’esterno

- Filopodi: sono più piccoli rispetto agli pseudopodi.

- Regioni da stress: quando una cellula aderisce a un substrato e poi si muove, questo movimento è

dovuto all’actina (essa permette lo scivolamento della cellula lungo un substrato); ci sono però

regioni dove la cellula deve aderire al substrato: nella zona interna l’actina forma delle fibre che

permettono l’adesività al substrato solo in alcuni punti del substrato. Nella regione a contatto con

la membrana l’actina è molto mobile, invece nella parte più interna è più stabile e permette

l’adesività al substrato, tramite le fibre da stress

- Tasche endocitiche e fagocitiche: sono più grandi degli endosomi; negli endosomi piccoli non è

coinvolta l’actina; qui invece, struttura tipica della fagocitosi, l’anello che si forma è costituito da

actina (l’anello scompare quando la particella non è stata internalizzata). I fagosomi sono legati alla

polimerizzazione di actina; una volta che il fagosoma è all’interno l’anello di actina scompare e in

questo modo il fagosoma può fondere con i lisosomi

Ci sono strutture diverse formate dall’actina; quindi: com’è controllata la polimerizzazione di actina per

dare origine alle diverse architetture dei processi di membrana? Quali meccanismi regolano la formazione

di una determinata struttura (un filopodio, uno pseudopodio) in un punto piuttosto che in un altro della

membrana? Per la seconda domanda ci dobbiamo rifare alla trasduzione del segnale. 46

Per rispondere alla prima domanda bisogna capire come sono fatti i monomeri di actina. Sono proteine di

forma globulare, che hanno una caratteristica in comune: possono legare ADP o ATP in una tasca, quindi

possiamo riconoscere due domini separati. L’actina è quindi in grado di legare ATP. Ci sono inoltre degli ioni

Ca che possono legarsi all’actina. Quando l’actina porta legata ATP ha una maggiore propensione a

polimerizzare, mentre se ha legato ADP ha minore propensione alla polimerizzazione. Nella cellula si

possono allora avere monomeri con ATP legato che possono formare polimeri, ma questo non è un

processo molto spontaneo. La polimerizzazione è quando un monomero interagisce con un monomero

simile che contiene ATP; non c’è formazione di catene laterali, ma un’unica crescita. La formazione di questi

filamenti è possibile perché ognuno di questo monomeri quando interagisce con il successivo è spostato di

un angolo di circa 70°. La forma dei singoli monomeri all’interno del filamento cambia. A prima vista i

filamenti sembrano formati da dimeri, ma in realtà è un unico filamento; ci appaiono doppi perché sono

spostati l’uno rispetto all’altro, ma non sono due eliche. I monomeri crescono in lunghezza e poiché quella

che tende a polimerizzare è l’actina che porta legato l’ATP, si può affermare che se si è formato un

filamento esso continua a formarsi dove è presente l’ATP, mentre nella parte opposta l’ATP tende a

idrolizzarsi ad ADP e fosfato.

Quindi nel polo positivo ci saranno monomeri leganti ATP e man mano che il filamento invecchia si avranno

sempre più monomeri che portano legato ADP. Il fatto di avere ADP legato comporta che le interazioni che

ci sono tra i monomeri che portano legato ADP siano più deboli; il risultato è che nella regione dove i

monomeri hanno ATP legato il filamento è più stabile, mentre nella regione dove i monomeri hanno ADP

legato il filamento è meno stabile (questo non vuol dire che dissocia), quindi, se interviene qualche altro

fenomeno, è questa regione che depolimerizza. Questo permette di dire che la depolimerizzazione avviene

per lo più in corrispondenza del polo negativo. Il filamento tende quindi a crescere da un lato e a

decrescere dal lato opposto.

Monomeri di actina tendono facilmente a formare dei dimeri, ma non formano facilmente dei trimeri; ma

se si è formato un trimero e c’è presenza di actina con ATP legato allora la polimerizzazione procede

velocemente. Ci sono monomeri di actina (chiamati G, dove G=globulare, mentre actina F vuol dire

filamento) che formano dimeri quasi spontaneamente; questo perché ci sono proteine associate all’actina

le quali regolano la polimerizzazione.

C’è una fase inizio (fase di nucleazione dell’actina) che è lenta; una volta che il trimero si è formato la

crescita del polimero avviene quasi in maniera spontanea. La nucleazione dell’actina è dovuta alle proteine

associate: formina e Arp2/3, i due principali nucleatori noti dell’actina. La formina permette facilmente la

formazione di filamenti di actina (la formina si trova nella parte più esterna dei filopodi) e fa sì che il

filamento possa allungarsi, ma solo nella direzione iniziale. Arp2/3 invece permette la formazione di reticoli

di articoli: se c’è un filamento già iniziato Arp2/3 si lega lateralmente al filamento che a sua volta permette

la formazione di un filamento con un angolo ben definito di 70° rispetto al filamento che si era formato

prima.

La formina è caratterizzata da diversi subdomini, tra cui il dominio GBD, il quale interagisce con una

proteina G monomerica (Cdc42); altri domini tipici della formina sono FH3, FH1, dominio di dimerizzazione

(DD) il quale permette a due monomeri di formina di formare un dimero, dominio di autoregolazione (DA).

La formina è una famiglia di proteine: il numero di domini tipici della formina varia, ma tutte hanno un sito

GBD, almeno un FH e un DD. Quando il dominio GBD lega una G monomerica, la formina modifica la propria

conformazione tridimensionale: da inattiva diventa attiva. Le proteine G monomeriche legate nel dominio

GBD sono della famiglia Rho, così la forma cambia e due monomeri sono in grado di formare un dimero. Il

dimero di formina forma una struttura a ciambella che è in grado di legare un monomero di actina

all’interno, così che monomeri di actina riescano a interagire con altri monomeri, favorendo così la

nucleazione e la crescita di filamenti iniziati. La funzione della formina è quindi quella di dare origine a 47

trimeri, oppure, quando il filamento è iniziato, di stimolare l’ulteriore crescita dei filamenti grazie

all’interazione di singoli monomeri di actina che vengono facilmente legati a monomeri preesistenti

(caratteristica del dimero).

Il dominio FH1 può legarsi a PIP2 e PIP3 (i quali si formano sulla membrana plasmatica a seguito della

reazione della PI3K, che a sua volta può essere regolata da segnale e che, agendo su PIP2, dà origine a

PIP3); quando nella membrana si forma PIPI3 o PIP2 in quei punti la formina viene associata alla membrana

negli stessi punti, perché contiene un sito di legame per l’SH1 per quel sito e in questo modo il filopodio

può avere origine in un punto piuttosto che in un atro. Se iperesprimiamo la formina in una cellula si

formano una miriade di filopodi. Se si attiva CDC42 c’è la facilitazione della formazione di filopodi tutto

intorno alla cellula, come avviene per la formina.

Il complesso Arp2/3 è formato da 7 proteine; Arp2/3 sono le proteine più importanti di questo complesso;

Arp è associata e riferita all’actina. La caratteristica di questo complesso è che sono molto simili all’actina,

quindi nel momento in cui un monomero di actina interagisce con questi due si forma come un trimero: la

somiglianza fa sì che l’Arp2/3 agisca come un dimero di actina, quindi è necessaria solo un’actina per

formare un trimero. Arp2/3 è regolato: se ha l’actina legata e cristallizzata si origina un filamento che

cresce lateralmente con un angolo di 70°. Il complesso facilita la formazione del filamento, ma l’interazione

tra Arp2/3 e il filamento iniziale è debole, quindi se non intervenissero altri fattori si staccherebbero. Ci

sono altre proteine che una volta che questi filamenti si formano li legano tra loro, così se anche Arp2/3 si

staccano i filamenti rimangono attaccati.

Arp2/3 dà origine a complessi di actina, ma normalmente è inattivo. La formina, una volta formata è attiva,

invece Arp2/3 ha bisogno di un fattore che lo attivi. Arp2/3 può interagire con proteine che prendono

nome di Wasp, Scar/WAVE e WASH, scoperta 3 anni fa.

- Wasp è stata scoperta studiando la sindrome di Wiskott Aldrich, patologia che riguarda la linea

ematopoietica; va a danneggiare anche la difesa immunitaria, infatti visto che regola Arp, la quale a

sua volta regola l’actina, necessaria per i processi di fagocitosi, è ovvio che ci siano difetti nella

coagulazione del sangue nei leucociti che non possono polimerizzare bene e arrivare nei siti

dell’infiammazione. N-Wasp è simile a Wasp ma è presente nel sistema nervoso

- Scar/WAVE, scoperta inizialmente nelle amebe (modello guida dello studio sulla chemiotassi). Sia

questa che Wasp hanno un sito sia per l’actina che per Arp2/3 e i due siti sono vicini l’uno all’altro;

accanto c’è un legame per la profilina, che è una delle proteine associate all’actina che facilita la

polimerizzazione dei filamenti. In Wasp c’è un dominio GBD. Wasp e Scar/Wave esistono allo stato

inattivo; quando esse vengono isolate dall’interazione di una G monomerica (Rac), CDC42 e da PI

passano a una conformazione aperta, così Wasp può legare Arp2/3 e Scar/WAVE perde le altre

proteine che sono legate e anch’essa è in grado di legare Arp2/3; legando Arp2/3, legano anche

l’actina, che è vicino ad Arp2/3, e in questo modo favoriscono la formazione del trimero e la

polimerizzazione dell’actina. Si ha di nuovo a che fare con segnali specifici a livello della membrana

- WASH: simile a WASP dal punto di vista strutturale

WASP e Scar/WAVE hanno dei domini che legano Arp2/3 all’actina l’uno accanto all’altro: questa è la

ragione per cui Arp2/3 può formare con l’actina un dimero. La profilina è una proteina associata all’actina

che lega l’actina all’ATP e quando ciò succede l’actina può polimerizzare facilmente (al contrario, quando si

lega all’ADP non polimerizza molto facilmente). Il fatto che in queste proteine la profilina si leghi in questo

dominio che è accanto al legame dell’actina, che a sua volta è accanto al dominio di legame Arp 2/3, fa sì

che monomeri di actina possano essere localizzati vicino al legame Arp2/3 facilitando la formazione del

dimero. 48

Wasp e Scar/WAVE esistono allo stato inattivo e vengono attivate da segnali delle proteine G monomeriche

della famiglia Rac e PIP2/3 (fosfatidil inositili che si formano a livello della membrana permettendo a

proteine di associarsi alla membrana stessa); quando in un punto della membrana avviene la

polimerizzazione dell’actina sappiamo che lì è avvenuta la polimerizzazione di WASP o Scar/WAVE. Serve

però una G monomerica, in generale Rho, nel caso specifico Rac e CDC42, che legandosi al dominio GDP

attiva Wasp permettendo la polimerizzazione della proteina. In questo caso la proteina cambia

conformazione, ma nel caso di Scar/WAVE ci sono proteine che impediscono l’attivazione; queste proteine

si staccano quando la G monomerica si lega a Scar/WAVE.

Di fatto c’è variabilità nelle funzioni: Rac regola la trasduzione del segnale ma anche la polimerizzazione

dell’actina; CDC42 regola la formina, ma può regolare anche WASP: non c’è una distinzione rigida tra la

funzione delle G monomeriche. Una cellula, a seconda di cosa la attiva, cambia la sua conformazione; a

prima vista a livello del citoscheletro si vedono delle differenze: CDC42 attiva la formina che a sua volta

provoca la formazione dei filopodi; Rac forma lamellipodi; Rho regolerebbe le fibre da stress, ma potrebbe

anche regolare qualcos’altro (es: i lamellipodi)

Una cellula infettata da un batterio presenta delle zone più scure, zone infettate dal batterio Listeria

monocytogenes. Questo è pericoloso nella gravidanza: nei primi mesi dello sviluppo, l’infezione della

Listeria, può indurre aborti spontanei o dei danni nel neonato. La listeria prolifera all’interno di cellule e si

muove per passare in altre cellule per continuare a proliferare. La listeria può muoversi e passare da una

cellula all’altra grazie a un movimento legato all’actina e alla ACTa che imita Wasp: Wasp regola Arp2/3; la

listera, producendo ACTa provoca la polimerizzazione dell’actina dietro di sé, facendo crescere il filamento

e muovendo il batterio.

Tutto questo non spiega la varietà di filamenti e la dinamicità dei filamenti di actina. La cellula è in grado di

formare pseudopodi, i quali si muovono facendo muovere la cellula stessa. Il citoscheletro di actina è

altamente dinamico; l’actina è la proteina più presente nella cellula e inoltre è quella più conservata (dagli

organismi più semplici a quelli più complessi). In quasi tutti gli organismi ci sono diversi geni che codificano

per l’actina. La concentrazione critica perché l’actina polimerizzi è inferiore a 10 micromolare; questo vuol

dire che se si ha una concentrazione di actina dell’ordine di 150 – 1000, situazione che si ha in quasi tutte le

cellule, ci si aspetterebbe che la maggior parte dell’actina sia polimerizzata. Se così fosse la cellula sarebbe

rigida, non ci sarebbe dinamicità, come quando si tratta la cellula con la falloidina: essa impedisce la

depolimerizzazione, quindi i filamenti rimangono polimerizzati e la cellula non cambia, è una cellula quasi

morta. Ma essendoci questa dinamicità, vuol dire che ci sono altri elementi che la spiegano: sono le

proteine associate e che legano l’actina. Esse sono quelle che regolano la dinamicità. Quando si parla del

citoscheletro di actina, non ci si riferisce ai filamenti di actina, ma ai filamenti di actina e alle proteine

associate all’actina stessa. Ci sono più di un centinaio di proteine associate al citoscheletro di actina e che

regolano la polimerizzazione e la depolimerizzazione dell’actina. Regolano la polimerizzazione perché

alcune di queste proteine legano monomeri. Se si hanno proteine associate all’actina che legano i

monomeri di actina, si riduce la concentrazione di monomeri liberi e quindi si riduce la possibilità che si

formino i polimeri, cioè i filamenti. Le proteine leganti l’actina che regolano la dinamica del citoscheletro di

actina sono:

- proteine leganti l’actina G (β-timosina, CAP, profilina);

- proteine inibitrici la crescita di filamenti: proteine CapG, Cap Z, severina/gelsolina, ADF/colfilina

- proteine che stabilizzano i filamenti e riducono la capacità dell’actina di polimerizzare (spectrina,

actinina, fimbrina, villina, filamina); l’actina tende a polimerizzare se ha legato ATP, mentre

depolarizza se ha legato ADP. Tanto più un filamento è invecchiato, tanto più i monomeri di actina

nel filamento contengono ADP, perché l’ATP viene idrolizzato. Quindi queste proteine facilitano lo

stato polimerizzato dei filamenti 49

- proteine ancoranti i filamenti alla membrana: ponticolina (lega l’actina nella sua regione citosolica),

vinculina, distrofina, talina (interagisce con le integrine, proteine di adesione, che a loro volta

hanno una regione transmembrana e una citosolica e in quest’ultima possono legare la talina, che a

sua volta lega l’actina), catenina

- proteine motrici: nel caso del citoscheletro di actina sono solo le miosine, proteine coinvolte nella

contrazione. Le miosine trasportano anche vescicole lungo i microfilamenti di actina; ci sono anche

proteine motrici dei microtubuli, le quali appartengono alla famiglia delle chinesine e delle dineine.

Tutte insieme vengono considerate come una super famiglia perché hanno caratteristiche comuni:

riescono a muoversi perché sono dotate tutte e tre di particolari domini motori

Quando queste proteina sono state scoperte, sono state individuate isolando il citoscheletro di actina e si è

visto che insieme all’actina c’era qualcos’altro; isolando le proteine era possibile studiare le loro attività

isolando l’extra. L’attività in vitro di certe proteine si può studiare, ma alcune di esse non corrispondono al

100% all’attività che le proteine svolgono nelle cellule. In vivo infatti, non esistono solo la proteina e l’actina

isolate, come si ha in vitro. Tutto ciò che si trova sui libri riguardo queste proteine si riferisce per lo più alla

situazione in vitro; nelle situazioni in vivo ci possono essere delle contraddizioni: la profilina venne inserita

nelle proteine della prima famiglia perché in vitro legava i monomeri di actina impedendo così la

formazione di filamenti; quando si è approfondita di più la questione si è visto che la profilina lega i

monomeri, soprattutto quelli leganti ATP, quindi riduce i monomeri, facilita la depolimerizzazione (quindi è

giusto inserirla nella prima famiglia), ma ha anche un’altra caratteristica, infatti essa facilita il distacco di

ADP e il legame ai monomeri di actina/ATP. La profilina quindi facilita la formazione di filamenti grazie al

fatto che una volta legati i monomeri con l’ATP legato e con l’ADP staccato, il complesso profilina-actina-

ATP legato tende a facilitare la polimerizzazione dell’actina molto più del semplice monomero di actina con

ADP legato, il che è in contraddizione con quanto visto prima. Questo discorso è valido anche per altre

proteine.

Un’altra proteina che riduce la polimerizzazione dell’actina è la Cap, nome modificato in capping. Essa lega i

monomeri ma non può facilitare il legame di ATP. Essa si lega a monomeri di actina ma può legarsi anche a

monomeri di actina che fanno parte di filamenti. Se la capping si lega a un filamento che sta crescendo (si

lega cioè ai monomeri del filamento), impedisce al filamento di continuare la sua crescita. La funzione di

questa proteina è quindi quella di ridurre la polimerizzazione ma anche di ridurre la lunghezza del

filamento. Questa si trova nei sarcomeri e determina la lunghezza dei filamenti di actina all’interno del

sarcomero. La presenza della capping o della profilina all’interno della stessa cellula regola la

polimerizzazione dell’actina: una perché riduce le dimensioni dei filamenti, l’altra perché facilità la

formazione dei filamenti e perché riduce la concentrazione dei monomeri liberi.

Un’altra proteina inibitrice è la cofilina, che si lega ai filamenti di actina. Quando si lega il filamento di actina

il filamento ha un diametro maggiore; si lega all’actina-ADP, quindi nelle regioni più invecchiate di un

filamento, dove si ha actina con legato ADP che non si stacca. Quando la cofilina si lega aumentano

l’instabilità dei filamenti e quindi essi possono depolimerizzare più facilmente; la cofilina quindi facilita la

depolimerizzazione dei filamenti e quando è presente ad alte concentrazioni favorisce la

depolimerizzazione all’estremità meno, ma facilita la polimerizzazione all’estremità più, perché aumenta la

concentrazione di monomeri. Se la cofilina facilita la depolimerizzazione all’estremità meno, i monomeri

che si sono liberati da questa estremità possono facilmente legarsi all’estremità più, fenomeno visibile nei

lamellipodi, dove il lamellipodio tende a crescere verso l’esterno, mentre nella parte più interna l’actina

depolimerizza.

Altra proteina inibitrice è la gelsolina (il termine deriva dal fatto che quando si cercava di descrivere dal

punto di vista chimico-fisico lo stato del citoscheletro, si diceva che poteva essere in uno stato gelificato –

più verso il solido – o solificato – più simile al liquido –. Quando la proteina fu scoperta si vide che essa 50

facilitava il passaggio dallo stato gel allo stato solido). Essa si lega ai filamenti nelle regioni dove c’è ADP

legato, ma avviene un fenomeno particolare: quando la concentrazione di Ca nella cellula è alta, la gelsolina

agisce come un enzima che taglia il filamento e nello stesso tempo incappuccia il filamento stesso; così

facendo impedisce al filamento di crescere ulteriormente. La gelsolina può trasformare il citoscheletro in

una forma più solificata perché riduceva le dimensioni dei filamenti e non permetteva loro di crescere.

Questo esperimento è di pochi anni fa; non si riesce ad avere mutanti KO per l’actina, ma si possono avere

mutanti KO per le singole proteine che legano l’actina: se si elimina il gene della cofilina nell’embrione di

topo, esso non muore e questo significa che la cofilina non è vitale. I topo KO per la gelsolina sono però

difettosi nella motilità delle piastrine e le ferite da taglio non si rimarginano.

Ci sono proteine che stabilizzano i filamenti e hanno delle funzioni particolari. Ci sono filamenti paralleli che

vengono legati l’uno all’altro grazie alla fimbrina e alla filamina: esse agiscono da ponte tra filamenti di

actina. I filamenti di actina non sono in grado di interagire tra di loro; quando si parla di reticoli di filamenti

di actina o dei sarcomeri, la possibilità che si formino questi filamenti paralleli è dovuta all’α-actinina,

proteina che forma un dimero e tramite uno dei domini più esterni lega un filamento di actina. Nelle cellule

muscolari i filamenti di actina sono legati tra di loro nel disco Z attraverso l’α-actinina. La stessa cosa fa la

fimbrina nei microvilli (simili a filopodi un po’ più spessi); la differenza tra la fimbrina e l’α-actinina è che la

fimbrina è più piccola e fa da ponte allo spazio dietro, spazio che rimane tra i filamenti, più piccolo dove i

filamenti sono più compattati; nell’α-actinina tra i filamenti c’è più spazio ed essi possono interagire con le

miosine; le molecole di miosina hanno una regione in alto che interagisce con l’actina e delle code in basso

che interagiscono con altre miosine. La filamina invece stabilizza i filamenti in modo diverso; è un dimero,

ma in una delle altre due regioni i dimeri di filamina interagiscono tra di loro, mentre nella regione opposta

essi interagiscono con i filamenti di actina. Arp2/3 permette la formazione di catene laterali di filamenti con

un angolo ben definito di 70°, ma questa formazione è instabile, infatti Arp2/3 tende a staccarsi; i filamenti

vengono tenuti insieme dalla filamina e il risultato è la formazione di reticoli diversi tra loro.

Un esempio di proteine che interagiscono con la membrana e che a loro volta legano l’actina è la distrofina.

Questa è una proteina molto importante: mutazioni che la riguardano danno origine a due forme di

distrofia muscolare. Quando si vede il termine KO ci si riferisce a un gene che o per mutazione spontanea o

perché è stato modificato in laboratorio non produce più la proteina. Se la distrofina non c’è nelle cellule, si

ha la distrofia muscolare di Duchenne. Si ha la contrazione muscolare perché i sarcomeri, legati alla

membrana plasmatica della membrana cellulare tramite la distrofina, si contraggono portando dietro la

membrana stessa. Nella distrofia di Duchenne i sarcomeri possono contrarsi, ma la distrofina non c’è,

quindi vengono a mancare i legami con la membrana, quindi la contrazione non viene trasmessa alla

membrana, con il risultato che non c’è contrazione muscolare. Le persone affette da distrofia muscolare

non riescono a muoversi; si manifesta già nei primi mesi di vita (è genetico). Nella distrofia muscolare di

Becker la distrofina è presenta, ma a livelli molto bassi, quindi non è completa e non funziona bene.

Le proteine motrici che interagiscono con l’actina sono le miosine, I e II. La miosina presente nei sarcomeri

è la miosina II. Tutte le 11 miosine hanno un motore che permette loro di muoversi e grazie a questo

movimento c’è la contrazione muscolare e il trasporto di vescicole sui filamenti di actina (miosina I). Le

chinesine e le dineine sono simili alle miosine come struttura e comportamento, ma riguardano i

microtubuli.

Il citoscheletro di MICROTUBULI

I microtubuli sono posizionati lungo tutta la cellula e sono collegati tutti a un centrosoma/organizzatore dei

microtubuli. È localizzato vicino alla membrana ed è aderente alla membrana del nucleo. Essi sono

importanti per la formazione del fuso mitotico (è formato da microtubuli), per il trasporto di vescicole, per

fenomeni di crescita (nella parte più esterna del cono di crescita dei neuroni c’è il citoscheletro di actina,

immediatamente sotto ci sono i microtubuli, i quali possono interagire in parte con il citoscheletro di actina

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e trasportare vescicole verso l’actina; le vescicole possono portare neurotrasmettitori o proteine che

servono per la crescita dei neuroni).

I microtubuli sono formati dalla proteina tubulina, di forma tubulare che ricorda quella dell’actina (anche se

la tubulina è più grande), la quale non lega ATP ma GTP ed è in grado di idrolizzarlo in GDP e Pi che rimane

legato alla tubulina; la tubulina ha un sito di legame che può legare sia GTP che GDP. La polimerizzazione

della tubulina è favorita dal magnesio. A differenza dell’actina, la tubulina è presente nelle cellule in tre

isoforme diverse, codificate da geni diversi:

- α e β due componenti fondamentali dei microtubuli; una volta sintetizzati, una subunità α forma

con una subunità β un dimero; i monomeri vengono subito trasformati in eterodimeri (un

monomero di α e uno di β); la tubulina α con il GTP legato interagisce con una β tubulina e questo

eterodimero è caratterizzato dal fatto che il GTP legato all’α tubulina è stabile, mentre il GTP legato

alla β tubulina può essere idrolizzato a GDP. Come nell’actina i monomeri che portavano legato ATP

tendevano a polimerizzare, in questo caso gli eterodimeri che portano GTP legato alla β tubulina

hanno maggiore tendenza a polimerizzare. Quando gli eterodimeri polimerizzano la

polimerizzazione avviene sempre perché la tubulina α dell’eterodimero interagisce con la β

dell’altro eterodimero; quindi il filamento cresce mantenendo la composizione eterodimerica.

All’interno di ogni singolo protofilamento si avrà sempre α-β-α-β che si susseguono lungo tutto il

filamento. C’è differenza tra quelli dell’actina e questi:

o actina: erano singoli filamenti, si possono avere fasci, ma questi sono dovuti a proteine

associate all’actina, senza i quali non potrebbero interagire

o tubulina: man mano che si formano i protofilamenti, lateralmente possono associarsi

facilmente ad altri protofilamenti. Sono associazioni abbastanza stabili da far sì che si venga

a formare un vero e proprio tubulo con caratteristiche definite:

▪ diametro (medio) circa 20 nm, cavo all’interno

▪ numero: varia leggermente

c’è un polo positivo dove avviene la polimerizzazione e una estremità negativa dove non avviene,

come nell’actina

- γ: ruolo importante nel centro organizzatore dei microtubuli

Man mano che il filamento si forma può avvenire che d’un tratto si dissolva dando origine a delle forme ad

anello. In una fase iniziale si forma una struttura aperta, ma man mano che i filamenti sono in grado di

interagire tra di loro danno origine a un microtubulo vero e proprio.

Le strutture ad anello sono dovute al fatto che il microtubulo che sta crescendo d’un tratto polimerizza,

cosa che non avviene con l’actina (che continua a polimerizzare nel polo positivo a meno che non

intervengano proteine che interrompano la polimerizzazione). I microtubuli crescono perché nella regione

positiva c’è il legame di eterodimeri, ma d’un tratto c’è un fenomeno di depolimerizzazione: il microtubulo,

a partire proprio dalla regione positiva inizia a depolimerizzare, fino a una quasi depolimerizzazione

completa per poi crescere di nuovo in unico ciclo continuo. Questo fenomeno è chiamato instabilità

dinamica dei microtubuli. Quando gli eterodimeri portano legato GTP tendono a polimerizzare; se in uno o

più eterodimeri c’è un’idrolisi di GTP (qualunque sia la causa) e quindi alcuni eterodimeri non hanno più

GTP legato ma GDP, questo fatto scatena la depolimerizzazione, con la conseguenza che la regione in alto si

apre con la formazione di anelli. Il processo potrebbe anche portare alla sparizione di un intero

microtubulo, cosa che non si verifica perché essi si accorciano e tornano immediatamente a crescere.

Tutti i microtubuli di una cellula sembrano essere legati a un centro organizzatore dei microtubuli, come se

partissero tutti da esso. Questo centro organizzatore rimane come una struttura stabile e questa è una

delle ragioni per cui gli eterodimeri non depolimerizzano completamente, in quanto a livello di esso non

avviene depolimerizzazione. Nel centro organizzatore ci sono i centrioli, che dal punto di vista strutturale 52

sono microtubuli, strutture molto ben determinate. I centrioli mantengono sempre la loro struttura; si

duplicano e quando lo fanno migrano in due poli del fuso mitotico per poi dare origine a nuove due paia di

centrioli delle due cellule figlie. Anche le cellule che non hanno i centrioli hanno una specie di nuvola che è

il centro organizzatore dei microtubuli; in questa nuvola che può contenere i centrioli ci sono una serie di

strutture che prendono il nome di γ-turc (γ-tubuli ring complexes). La tubulina γ si trova solo nel centro

organizzatore dei microtubuli; essa forma degli anelli, i quali non sono mai isolati anzi sono legati a

complessi di proteine, le quali costituiscono un nucleo da cui ha origine il filamento, situazione simile alla

formazione dei trimeri di actina per la formazione dei microfilamenti di actina (nel caso dell’actina il punto

cruciale della formazione del trimero è dovuto ad Arp2,3 della formina che permette la formazione del

trimero); qui invece c’è la tubulina γ che forma il nucleo da cui ha origine il filamento (grazie all’interazione

con altre proteine che mantengono questa struttura sempre intatta). Una volta formata la struttura gli

eterodimeri di α e β tubulina possono legarsi alla γ e possono dare origine al filamento, quindi anche se il

filamento si dovesse dissociare questa struttura rimarrebbe intatta. I filamenti dei microtubuli si dipartono

tutti da singoli complessi γ-turc. Questa è una struttura relativamente stabile, sempre aderente alla

membrana del nucleo, in posizione centrale da cui si dipartono i microtubuli. Anche i filamenti che non

hanno un collegamento fisico con il centro organizzatore si sono formati nel centro organizzatore dei

microtubuli. Le concertazioni di γ-tubulina e pericentrina (una proteina che va in contro a fenomeni di

fosforilazione e defosforilazione, cioè è sotto il controllo di alcune chinasi, ed è di fatto una delle proteine

principali che regola i γ-turc) nel centrosoma sono soggette a fluttuazioni legate al ciclo cellulare. In

prossimità della mitosi e nella profase il loro reclutamento aumenta di diverse volte. Il numero di

microtubuli che si dipartono dal centrosoma aumenta di 5-10 volte. Il centro organizzatore dei microtubuli,

che ci siano o meno i centrioli, si duplica ed è a seguito della duplicazione che si formano poi i due poli del

fuso mitotico: serve quindi un aumento dei γ-turc che avviene nella fase finale dell’interfase del ciclo

cellulare all’inizio della profase. L’aumento dei γ-turc è legato alla pericentrina, la quale ne facilita la

formazione. Nella fase iniziale della mitosi aumenta la concentrazione di γ tubulina e pericentrina e in

questo modo aumenta il numero di γ-turc che ci sono; aumenta a sua volta il numero di microtubuli. La

stabilità e l’instabilità dei microtubuli è regolata tramite una serie di proteine che si legano ai microtubuli e

che nell’insieme prendono il nome di MAP. I microtubuli hanno una loro autonomia nella polimerizzazione,

la quale però dipende da proteine associate ad essi, le quali possono stabilizzare i microtubuli (proteine

stabilizzanti, MAP1-4, tau) o destabilizzarli (proteine destabilizzanti, 0P18/statmina, spastina, katanin); ci

sono anche proteine + tips (clip-170, APC, Lis1, EB1) e proteine motrici (chinesina, dineina). Queste ultime

proteine servono per il trasporto di vescicole lungo i microtubuli stessi e sono la chinesina e la dineina. Ci

sono quindi quattro famiglie diverse di proteine che di fatto regolano la polimerizzazione dei microtubuli e

che sono regolate per fosforilazione. Come in altri fenomeni anche qui le chinasi sono fondamentai: ci sono

una serie di chinasi che provocano la polimerizzazione di queste proteine regolando l’attività di proteine

associate ai microtubuli e quindi regolano di fatto la polimerizzazione dei microtubuli stessi. Ci sono chinasi

associate ai microtubuli e chinasi (PKC, PKA, Cdk1, Cdk2) che regolano il ciclo cellulare, meno specifiche.

Proteine stabilizzanti

Queste proteine (chiamate generalmente MAP) funzionano secondo diversi meccanismi

- il microtubulo lateralmente potrebbe essere aggredito da proteine che lo idrolizzano; nel momento

in cui le MAP si legano lateralmente ai microtubuli esse proteggono i microtubuli da proteine

destabilizzanti. Se le MAP non sono fosforilate sono in grado di legarsi ai microtubuli riducendo il

rischio che essi depolimerizzino; in questo modo facilitano l’allungamento dei microtubuli stessi; se

vengono fosforilate c’è un effetto destabilizzante sui microtubuli: è più facile che i microtubuli

depolimerizzino perché possono essere attaccati da proteine destabilizzanti.

- possono legare insieme microtubuli, perché formano (come la fibrina nell’actina) dei ponti tra

microtubuli; questo compito è svolto soprattutto dalla MAP1, 2 e tau nelle cellule nervose (MAP 3 e

53

4 sono ubiquitarie, funzionano anche fuori dal sistema nervoso). Le MAP possono formare anche

legami tra microtubuli: a livello di assoni i microtubuli sono legati tra loro tramite le MAP. I

microtubuli sono in parallelo, distanziati l’uno dall’altro perché le MAP fanno da ponte tra i

microtubuli. In un’altra regione possono essere più vicini: MAP e Tau (più piccola delle MAP)

formano fasci più piccoli. Entrambe si trovano negli assoni e svolgono una funzione importante:

regolano la formazione dei neuroni stessi. I fibroblasti non hanno MAP1,2 o tau, ma posseggono

MAP3,4 le quali non tendono a formare filamenti: i filamenti formati da microtubuli sono distribuiti

lungo la cellula ma di fatto non ci sono fasci. In certi fibroblasti viene espressa la tau: se si

iperesprime la tau la struttura cambia: è come se questa iperespressione avesse portato ad una

sorta di fascicolazione dei microtubuli che in assenza di tau erano distribuiti nella cellula. Tau forma

fasci relativamente stretti e uniti tra i vari microtubuli. Questo ha un ruolo molto importante in una

serie di malattie neurologiche, come l’Alzheimer e il Parkinson: difetti della proteina tau danno

origine a queste malattie

Proteine destabilizzanti

Esse depolimerizzano i filamenti, tagliandoli e frammentandoli: agiscono alternamente a livello dei

microtubuli tagliando come delle forbici i filamenti. Le proteine principali sono

- Katanin: deriva dal giapponese (katana, spada).

- Spastina deriva da una malattia: è una proteina difettosa nella paraplegia spastica ereditaria: i

segnali non vengono trasmessi bene al muscolo (per il loro meccanismo d’azione vedi Sharp & Ross,

J Cell Sci)

- statmina

La loro funzione è quella di tagliare i microtubuli; se non ci fossero, le proteine stabilizzanti la cellula

finirebbe per perdere i microtubuli. La crescita dei microtubuli avviene dal centro organizzatore; ma nel

caso delle cellule nervose il centro organizzatore dei microtubuli è nella parte centrale della cellula, ma i

prolungamenti possono essere molto lontani da questo centro. Se la polimerizzazione dei microtubuli fosse

sempre legata a microtubuli che partono dal centro organizzatore e proseguono lungo un assone i processi

di formazione e rigenerazione sarebbero lenti. In realtà nel centro organizzatore dei microtubuli vengono

sintetizzati nei microtubuli e man mano che vengono sintetizzate katanin e spastina tagliano, una parte di

MAP rimangono legate formando così frammenti di microtubuli i quali vengono spostati dal centro verso

parti più lontane; siccome il movimento dovuto alle proteine motrici è abbastanza rapido, la sintesi del

centro organizzatore può portare nel tempo a una polimerizzazione di microtubuli alle estremità attraverso

un processo molto più veloce di come potrebbe essere se fosse legato solo a polimerizzazione dal centro

dei microtubuli alla periferia. I microtubuli vengono quindi sintetizzati in frammenti per poi essere

trasportati. La funzione di queste proteine quindi non è solo di destabilizzazione, in quanto favoriscono

anche (indirettamente) la loro polimerizzazione.

La statmina si lega agli eterodimeri riducendo la contrazione di eterodimeri disponibili per la

polimerizzazione, provocando così la diluzione di polimerizzazione e provocando la depolimerizzazione

degli stessi. La statmina ha quindi qualcosa di simile a katanin e spastina ma con un meccanismo diverso:

impedisce la polimerizzazione di nuovi eterodimeri a livello della estremità più, in quanto ne riduce la

quantità. Essa è molto abbondante nel nucleo e questo impedisce che nel nucleo si formino microtubuli:

quando il nucleo è intatto non si vedono microtubuli all’interno del nucleo, ma quando la cellula entra in

mitosi sappiamo che i microtubuli si formano; questo avviene perché la statmina è abbondante nel nucleo

e va in contro a fosforilazione con conseguente disattivazione della stessa e facilitazione della formazione

del fuso mitotico, in quanto i monomeri provenienti dal citosol possono essere usati per il fuso mitotico.

Regola anch’essa la plasticità sinapitica (le sinapsi vano in contro a modifiche continue e anche a interazioni

dimostra

con cellule muscolari che non sono mai stabili) (vedi lavoro: uchida et all neurobiol learn med 54

che). La statmina può regolare la memoria a lungo temine perché aumenta l’elasticità delle sinapsi. La

statmina iperespressa, destabilizzando i microtubuli, facilita la motilità e la migrazione di cellule

cancerogene (metastasi); se iperespressa è quindi oncogena.

Proteine +TIPs

Le proteine +TIPs (plus end Tracking Proteins); si trovano all’estremità + dei microtubuli. Permettono ai

microtubuli di crescere e interagire con altro, come filamenti di actina (presenti nella regione più esterna)

con i quali devono interagire per le vescicole, le quali si muovono sui microtubuli ma poi devono per forza

passare all’actina per poter uscire all’esterno della cellula; per questo ci deve essere un collegamento anche

fisico tra i microfilamenti e i microtubuli, collegamento dato anche dalla TIPs. Modificano la dinamica dei

microtubuli e regolano proteine motrici: è grazie ai microtubuli che le proteine motrici possono muoversi

lungo il citoscheletro. Si trovano nelle zone più esterne dei microtubuli, sotto forma di puntini. Man mano

che i microtubuli crescono le TIPs si spostano.

Proteine motrici

Le proteine motrici dei microtubuli sono le chinesine e le dineine; esse sono proteine che hanno una

somiglianza con le miosine. Le chinesine sono i “bipedi più piccoli al mondo”. Le proteine motrici quindi

sono actina

- miosine II: regolano la contrazione delle cellule

- miosine non convenzionali: sono coinvolte nel trasporto di vescicole di proteine. La caratteristica di

tutte le miosine è che trasportano proteine e vescicole solo per distanze brevi. Tutte le miosine si

muovono dall’estremità meno all’estremità più; questa regola non è fissa al 100% (per esempio la

VI cambia direzione)actina

- chinesine e dineine citoplasmatiche: trasportano vescicole, complessi multiproteici lungo i

microtubuli e sono indispensabili nel trasporto in lunghe distanze. Il trasporto lungo l’assone

avviene tramite chinesine e dineina; solo nella parte terminale dell’assone, quando i microtubuli si

intercalano con il citoscheletro di actina il carico viene dato alle miosine che poi trasportano verso

la membrana plasmatica. Le N-chinesine trasportato dall’estremità – all’estremità +, le C-chinesine

microtubuli

e le dineine in senso opposto

- le dineine assonemiche si trovano in strutture ben definite tipo ciglia e flagelli e regolano lo

slittamento di microtubuli nei flagelli (processi di migrazione) microtubuli

Queste proteine hanno delle caratteristiche in comune: hanno una regione globulare, ma questa regione

può essere presente in numero maggiore di uno: la dineina ha 6 regioni globulari (ma solo una è attiva).

Ognuna di queste regioni è in grado di legare ATP, quindi hanno attività ATPasica: idrolizzano ATP in ADP e

fosfato. Sempre nella regione globulare hanno un sito di legame al citoscheletro che nel caso della miosina

sarà il citoscheletro formato dai microfilamenti di actina, nel caso delle chinesine e delle dineine sarà il

citoscheletro formato dai microtubuli. Hanno queste proprietà in comune nella regione globulare. La

regione lineare può essere molto lunga o molto corta; questa regione può in certi casi dare origine a dei

dimeri (come nella miosina II: ha due regioni globulari e una lunga coda che tende ad avvolgersi su sé

stessa).

Le teste della miosina e della chinesina presentano somiglianze: la dimensione può variare, ma in entrambe

c’è il sito che lega l’ATP, c’è il sito di legame al citoscheletro e in entrambe l’attività ATPasica è all’interno.

La regione al di sopra della testa è una regione flessibile che si continua con la parte lineare; può essere

chiamata il “collo” della chinesina o della miosina. È una regione flessibile che in base al fatto che la testa

porti legato ATP o ADP modifica la propria conformazione: infatti interagisce con la testa o con il

microtubulo. Si può avere una situazione in cui la testa è legata all’actina quando non c’è legato ATP;

quando l’ATP si lega il cambiamento conformazionale dovuto al legame dell’ATP provoca il distacco quindi

55

la testa si stacca dall’actina; l’ADP poi si stacca, la miosina si attacca all’actina in un punto diverso. Se la

coda è libera è la miosina stessa che si muove. Nel caso della miosina II che interagisce con l’actina si nota

che da un lato c’è il filamento di actina a cui è legata la testa: si hanno i filamenti centrali formati dalle code

della miosina e dai filamenti fuoriescono le teste (libere). La miosina ha due teste; considerando la singola

testa abbiamo che essa interagisce con il filamento, si lega ad ATP e avviene il distacco; l’ATP viene

idrolizzato in ADP e fosfato e si modifica la conformazione della testa; nel momento in cui sia l’ADP che il

fosfato sono legati questa struttura interagisce con un altro monomero dell’actina; avviene poi il distacco

del fosfato dalla molecola e la testa torna nella sua conformazione originale, spostando però il filamento

verso sx. Tutti questi passaggi sono abbastanza regolari; l’unica cosa che complica il quadro è che non c’è

sincronizzazione per tutte le cellule della miosina, quindi la contrazione avviene, ma non è una contrazione

rapida: essa permette al muscolo una certa libertà. Questo ciclo si verifica per entrambe le teste

La dimensione della regione intermedia è molto importante: la miosina I ha un collo piccolo, la miosina II

non ha un collo molto grande (500 nm/s), la miosina V ha un collo molto più ampio rispetto alla testa ed è

quindi in grado di muoversi con un passo maggiore (2000 nm/s). La velocità delle miosine è molto elevata.

La miosina II, formata da due lunghe catene, ha una caratteristica particolare: oltre alle catene pesanti

(testa e coda) a livello del collo porta legate delle catene leggere; esse vanno in contro a fenomeni di

fosforilazione. La fosfolipasi C attiva tramite la formazione di inositolo3fosfato i canali del Ca a livello del

reticolo endoplasmatico (sarcoplasmatico se nelle cellule muscolari); l’aumento del Ca ha tra gli effetti

l’attivazione della chinasi MLCK. Quando aumenta il Ca e queste chinasi vengono fosforilate ci sono due

importanti conseguenze:

- nelle cellule dove non c’è il sarcomero, ogni miosina è isolata dalle altre e la regione della coda non

è allungata. Quando le catene leggere vanno in contro a fosforilazione, la regione della coda si

allunga, la testa diventa accessibile all’actina e le code possono interagire con altre code di altre

miosine per formare qualcosa che assomiglia alla struttura visibile nel sarcomero: aggregati di

miosine dove le regioni della coda sono aggregati tra loro e le teste fuoriescono. L’attivazione della

chinasi dovuta al Ca ha quindi provocato la formazione delle miofibrille

- funzione molto importante nell’attività ATPasica della testa

Alterazioni delle proteine che controllano il citoscheletro

Con la tecnologia è possibile interrompere la sequenza di un gene nel genoma in modo che una parte non

sia trascritta e la proteina non venga sintetizzata, così da vedere l’effetto che ha normalmente

nell’organismo una proteina. La miosina fu la prima ad essere sottoposta a questa tecnica e ci si aspettava

di avere grandi risultati, invece alle cellule in cui l’esperimento è stato fatto non cambiò molto. Nel

momento in cui ci si è accorti che non c’erano risultati si è pensato che ci potessero essere più geni che

codificavano per la miosina. Si è così scoperta la miosina 1. Dopo di che sono continuati gli studi e si sono

trovate 18 classi di miosine nei mammiferi quando i geni sono presenti in maniera ridondante,

l’inattivazione di uno di loro non ha effetto evidente sulle cellule. Gli effetti di disattivazione funzionano

quando c’è un solo gene. la miosina due è codificata da un solo gene, ma può essere in parte sostituita da

altre miosine. La miosina è presente anche in cellule non muscolari. Nel nostro organismo ci sono cellule

muscolari striate, lisce e una serie che non è né striata né liscia. In tutte queste c’è la miosina, in quelle

striate la miosina forma i sarcomeri. La fosforilazione permette l’attivazione delle zone pesanti, dove è

possibile il legame dell’ATP con l‘actina perché possa svolgere attività ATPasica. Nel caso della miosina due,

la particolare struttura del sarcomero è caratterizzata dal fatto che esso contiene elementi tipici delle

cellule, ma queste sono organizzate in modo da formare una struttura ben definita: la banda A è la banda

scura (appare nera) ed è la zona dove è concentrata la miosina, la quale forma le fibrille. Se si fosforilano le

catene leggere della miosina in cellule non muscolari allora le miosine danno origine a miofibrille, dove le

regioni allungate sono nella parte interna e le teste si dispongono sui due lati. Nel sarcomero ci sono 56

miofibrille dove le catene leggere sono nella parte centrale e le teste sono ai due lati, dove possono

interagire con i filamenti di actina. La caratteristica del sarcomero è che i filamenti di actina sono tutti legati

ad altre proteine che le tengono fisse, come le α actinine, le quali permettono di distanziare il filamento di

actina in modo tale da localizzare all’interno le miosine. Un capo dei filamenti di actina è legato, mentre

l’altro è libero e interagisce con le teste della miosina. Ci sono anche proteine accessorie, come una

proteina che è rappresentata come un elastico in quanto ha la caratteristica di agire come una molla: se

avviene un fenomeno di contrazione e distensione questa proteina cambia le proprie dimensioni ma

quando poi la struttura torna allo stato basale la stessa proteina favorisce la decontrazione delle cellule.

Il meccanismo di contrazione e distensione necessita di Ca. Quando arriva un segnale elettrico tramite le

sinapsi (che alla loro fine sono collegate alle cellule muscolari tramite il bottone sinaptico) avviene la

liberazione di neurotrasmettitori (Ach) e di Na, il quale dà origine al potenziale di membrana che a sua volta

provoca l’apertura dei canali del Na nella cellula muscolare. Questa variazione di potenziale agisce sui canali

del Ca: il Ca penetra nella cellula muscolare e apre i canali del Ca a livello del reticolo sarcoplasmatico.

Aumento del Ca libero nella cellula aumento dell’AMP ciclico (che è Ca e calmodulina dipendente). Ha

anche un altro effetto, il quale dipende dalle proteine associate all’actina, la troponina e la tropomiosina;

queste interagiscono con il citoscheletro di actina. In particolare la troponina interagisce con actina e

miosina: quando essa è presente in questi filamenti impedisce all’actina di interagire con la miosina.

Quando però aumenta la concentrazione di Ca nella cellula il Ca si lega sia alla troponina che alla

tropomiosina; il Ca provoca un cambiamento conformazionale alla troponina, la quale si sposta (pur

rimanendo legato) permettendo alla testa della miosina di legarsi all’actina. Inizia quindi il ciclo dei ponti

trasversi che permette lo scorrimento di actina sulla miosina fenomeno di contrazione. Le teste,

interagendo con l’actina e l’ATP si muovono verso l’interno (verso la linea M) e in questo modo il

miofilamento si contrae. Con la diminuzione della contrazione di Ca si ha il fenomeno di rilassamento.

Questi processi valgono anche per le altre miosine, per le dineine e per le chinesine: alla base c’è sempre il

ciclo di ATP, che è quello che regola l’interazione con il filamento, il movimento delle teste in punti diversi

del filamento e la contrazione. Se la parte lineare della miosina (o della chinesina o dineina) interagisce con

un complesso proteico o delle vescicole, queste vengono trasportate.

Anche nelle chinesine ci sono delle famiglie. La prima chinesina (chinesina 1) ha molte somiglianze con la

miosina: ha due teste, il corpo allungato che forma un’elica con il corpo di un’altra chinesina (si tratta di

nuovo di un dimero), la parte citoplasmatica che le permette di interagire con proteine accessorie. La testa

le permette il legame dell’ATP e il sito di legame. Ci sono famiglie diverse: la KIF 2 è diversa rispetto alla

KIF1. Nella KIF 2 sono nella regione C-terminale (C-KIF), mentre nella KIF1 la testa era all’N-terminale (N-

KIF). Le M-KIF indicano che c’è una regione N-terminale, una regione intermedia che forma la testa e la

solita coda. Ci sono poi delle chinesine la cui funzione è ancora ignota, le quali sembrano avere solo la testa.

Hanno tutte in comune le teste.

Le dineine si formano lungo i filamenti formati dai microtubuli e li movimento sembra quello di un bipede,

in grado di fare 800 nm/s consumando 100 molecole di ATP. La dineina differiscono dalle chinesine perché

hanno una testa nella regione centrale e in realtà hanno sette teste di cui solo una è funzionale. Presentano

poi una regione allungata verso il C-terminale. Se la coda è legata stabilmente la testa si modifica e

interagisce con i microtubuli, poi si distacca e ri-interagisce, costruendo così il movimento. La dineina può

legarsi in due punti solo negli assonemi, cioè solo nelle strutture che si hanno per esempio nel flagello degli

spermatozoi o dei batteri: la dineina fa da ponte essendo da una parte legata e dall’altra libera e potendo

così spostarsi. Normalmente servono per il trasporto di vescicole. Nel caso degli assonemi invece essi sono

legati tramite dineine; se fossero libere ci sarebbe scorrimento, nel caso degli spermatozoi invece non c’è

scorrimento, ma portano a fenomeni propulsori: nel momento in cui uno dei due filamenti si piega rispetto

all’altro si ha il fenomeno tipico dei flagelli. Dovuto alla sincronizzazione di questi movimenti. 57

Ci sono alcune malattie connesse al citoscheletro. Nel caso dell’actina, se ci sono dei difetti a livello di

proteine associate all’actine, spesso sono effetti trirrofici che possono anche essere di natura mentale; si

possono avere anche problemi legati alla ridotta migrazione cellulare, a livello di infiammazione, incapacità

di fagocitare ed esocitare.

Nel caso di malattie connesse ai microtubuli, considerando che sono legati al SN anche le malattie avranno

a che fare con il SN. Alcune di queste sono legate alle MAP, regolate dalla fosforilazione: quando sono

fosforilate si staccano dai microtubuli, così si può legare la proteina TAU e questo processo protegge i

microtubuli, infatti senza queste proteine altre proteine (come katanin) potrebbero distruggerli. Nelle

tauopatie c’è un eccessivo accumulo della proteina TAU, dovuto a una causa genetica o per una forma di

difesa. Quando la cellula produce molta proteina TAU, la cellula si difende dall’eccesiva concentrazione di

TAU fosforilandola, che porta al distacco di TAU, con due effetti:

- i microtubuli che si trovano sugli assoni vengono aggrediti e vengono distrutti

- la proteina stessa fosforilata ha un effetto negativo in sé, infatti una volta fosforilata può formare

aggregati, i quali interferiscono con gli stessi microtubuli, anche se non si legano ad essi,

impendendo alle proteine motrici di muoversi

Conseguenza di questi due fenomeni è la degenerazione della cellula nervosa, poiché gli assoni non

riescono più a interagire con le cellule bersaglio. Il trasporto alterato lungo i microtubuli non dovuto a TAU

o MAP, ma dovuto a difetti genetici in chinesine o dineine, può dare origine a malattie sempre legate al SN.

Le mutazioni poli Q non hanno a che vedere direttamente con i microtubuli, ma indirettamente: queste

malattie cono paragonabili alle tauopatie. La Q è il simbolo della glutammina, come N è quello

dell’asparagina. Una proteina che abbia glutammina può andare in contro a un certo tipo di fenomeno: là

dove c’è una o più glutammina, queste subiscono un fenomeno di iperproduzione, cioè man mano che

vengono sintetizzate ne vengono inserite molte altre una dietro l’altra poli glutammine all’interno della

proteina che fino a un certo punto non sono dannose: ci sono proteine che ne hanno 60 in serie senza

avere effetti, ma quando si supera il numero di 60 iniziano le malattie da poli Q. La proteina huntingtina

(proteina solubile nel citosol la cui funzione non è conosciuta) per esempio è una proteina che se subisce

questa mutazione dà origine alla Corea di Huntington, malattia degenerativa dovuta al fatto che le proteine

poli Q aggregano e la loro aggregazione influisce sul movimento delle proteine motrici lungo i microtubuli,

rallentando il movimento delle proteine motrici lungo i microtubuli e provocando quindi la degenerazione

delle cellule nervose il trasporto delle vescicole è molto importante nel SN, non solo perché queste

contengono i neurotrasmettitori, ma anche perché i segnali dalla periferia devono essere trasportati

all’interno della cellula tramite endocitosi e le vescicole si spostano sempre sui microtubuli.

Altra proteina importante, anche se non fa parte del SN, è l’APC che è una proteina TIP (le TIPs sono

proteine che si trovano all’estremità dei microtubuli in crescita); mutazioni a livello dell’APC sono una delle

cause dei tumori del colon e del retto (che sono la terza causa di morte per gli uomini). APC è una proteina

che sopprime il tumore; se una persona sviluppa dei polipi a livello del colon (dovuti alla proliferazione delle

cellule della matrice della parete del colon) c’è il rischio che questi, da adenomi (tumori benigni), si

trasformino in adenocarcinomi (cancro), fatali, in quanto sviluppano metastasi. La caratteristica delle TIPs è

quella di facilitare la crescita dei microtubuli e questo è il ruolo svolto anche dall’APC: essa collega i

microtubuli al cortex di actina nella parte più esterna della cellula e interagisce con la β catenina, la quale è

una proteina che regola la proliferazione cellulare. È una proteina che interagisce con l’integrina e quando

si stacca dall’integrina e viene tagliata in due una parte migra nel citosol per regolare la proliferazione

cellulare. In condizioni normali l’APC regola la fosforilazione della catenina. Inoltre l’APC è coinvolta nella

formazione del fuso mitotico; più esattamente essa è coinvolta nella parte terminale della formazione del

fuso mitotico, cioè quando i cromosomi si spostano verso la periferia, movimento legato alle chinesine e

alle dineine. Quando l’APC è geneticamente modificata, il più delle volte dà origine a delle proteine 58

tronche: la parte N-terminale viene tolta, la parte C-terminale rimane. Questa proteina parziale agisce da

dominante negativo: se oltre alla proteina normale c’è anche la proteina tronca quest’ultima è in grado di

interagire al posto della proteina normale con un substrato e di fatto impedisce la funzione della proteina

normale e così facendo la migrazione cellulare viene a mancare (in modo indiretto, perché sono coinvolte

anche chinesina e dineina) e inoltre non avviene più la segregazione dei cromosomi in periferia e non si ha

più una distribuzione corretta (si può avere una cellula figlia con un cromosoma in più e una con un

cromosoma in meno aneuploidia, con la conseguente perdita di alcuni geni). La proliferazione delle

cellule e quindi l’APC agisce anche sull’apoptosi. Quindi mentre normalmente è un soppressore di tumori,

se mutata l’APC è un oncogene (responsabile della poliposi adenocarcinosa del colon)

Citoscheletro dei FILAMENTI INTERMEDI

I filamenti intermedi hanno una distribuzione diversa rispetto ai filamenti di actina e a quelli dei microtubuli

(anche se c’è una certa somiglianza con i microtubuli, ma i filamenti sono formati da diversi tipi di proteine,

mentre i microtubuli presentano la stessa proteina con delle isoforme). In certi casi controllano anche

l’organizzazione della cellula, ma la loro funzione principale è di resistenza: i desmosomi (giunzioni a livello

dell’epidermide) sono molto resistenti proprio grazie ai filamenti intermedi. I topi in cui si eliminano i

filamenti intermedi non hanno conseguenze fatali i filamenti intermedi non sono essenziali per la vita

cellulare. Tuttavia questi topi KO hanno problemi legati alla poca resistenza.

I filamenti intermedi sono tutti proteine lineari dalla forma allungata e due regioni globulari molto piccole

alle estremità NH2 e COOH. Due monomeri sono in grado di formare un dimero in cui le due proteine si

attorcigliano tra di loro; un dimero può originare un tetrametro ma antiparallelo, cioè un dimero mostra

l’estremo NH2 all’estremo COOH dell’altro dimero. I tetrameri a loro volta si allungano alla periferia dando

origine ai protofilamenti, i quali danno origine a filamenti associati in grado di aggregarsi tra loro (da qui in

poi non si sa precisamente come avvenga il processo) e alla fine si formano dei filamenti che hanno un

numero variabile di protofilamenti intrecciati tra loro, la loro lunghezza può essere variabile e tali filamenti,

che a loro volta si intrecciano tra loro, formano lunghe corde molto resistenti. La ragione principale per cui i

filamenti intermedi sono stati difficili da studiare è perché sono molto difficilmente solubili. La lunghezza

può essere di diversi nm. Una caratteristica di tutti i filamenti intermedi è che sono proteine altamente

fosforilabili: molte chinasi possono fosforilarli e negli ultimi anni ci si è accorti che la fosforilazione aumenta

la solubilità (quando i filamenti intermedi vengono fosforilati tendono a formare filamenti più piccoli e a

staccarsi gli uni dagli altri). Ci sono delle proteine che danno origine ai filamenti intermedi che possono

formare omo o etero filamenti, cioè proteine diverse possono intrecciarsi per dare origine a filamenti

diversi: ci sono famiglie diverse che danno origine a filamenti diverse a seconda della funzione.

Proteine associate

Esistono proteine associate a filamenti intermedi, la cui funzione è tutt’ora materia di studio; quelle per ora

conosciute sono:

- desmoplachina, placoglobina, placofilina sono le proteine che permettono la formazione dei

desmosomi perché interagiscono con i filamenti intermedi e con le proteine di membrana che

fanno parte dei desmosomi

- preptine invece permettono di legare e associare i filamenti intermedi ai microtubuli

Patologie dei filamenti intermedi

L’epidermolisi bollosa è la più nota; è legata ai filamenti intermedi ma anche all’adesione intercellulare. Se

a livello dell’epidemide ci sono dei difetti nei filamenti intermedi allora l’interazione sarà debole perché non

c’è resistenza alle forze di trazione; nei casi più gravi l’epidermide tende a staccarsi dal derma anche solo

per movimenti minimi (in certi casi anche solo un semplice tocco o il portare vestiti). 59

RIGENERAZIONE DEI COMPARTIMENTI CELLULARI

Tutte le funzioni all’interno della cellula dipendono dalla capacità della cellula di trasportare quanto gli

necessita nei singoli compartimenti. Molta attenzione è stata rivolata alle proteine, ma gli studi valgono in

parte anche per gli RNA e in parte anche per i lipidi. Dagli anni 70 in poi si è iniziato a studiare assiduamente

il trasporto di proteine e il loro smistamento. Poiché le proteine vengono sintetizzate nei ribosomi che si

trovano nel citosol, se si escludono le poche proteine che vengono sintetizzate nei mitocondri, tutte le

proteine devono poi essere smistate, quindi la cellula deve sapere come riuscire a identificare le proteine

specifiche che devono rimanere nel citosol e quelle che devono andare negli altri compartimenti. La vita

media delle proteine e egli RNA è molto bassa; quando si parla di smistamento nei compartimenti si parla di

un processo continuo: se si calcola che la vita media delle proteine (più stabili degli RNA) è di alcune ore, già

nelle 24 ore in cui le cellule vanno in contro al processo di duplicazione, in realtà molte proteine sono state

già eliminate e state già risintetizzate questo processo è qualcosa che si ripete regolarmente nel corso

della nostra vita quotidiana. Le proteine più stabili sono quelle della membrana nucleare, le quali vengono

sintetizzate all’inizio di ogni ciclo cellulare. Tutte le altre proteine della cellula non hanno questa stabilità.

Quando le proteine non funzionano come dovrebbero si va in contro a patologie. Se le proteine dei

perossisomi, quindi proteine che devono essere trasportate in questi compartimenti, e il loro smistamento

non avvengono come dovrebbe, compaiono malattie che riguardano la funzionalità dei perossisomi, ma che

coinvolgono l’intero organismo e che possono anche portare alla morte in pochi anni di vita se si trovano

nella loro forma più grave. Se enzimi dei lisosomi non vengono trasportati, la loro attività idrolitica non

funziona bene e quindi si ha accumulo di materiale che non riesce ad essere digerito. In certi casi è un unico

enzima che per problemi legati all’enzima non è stato sintetizzato, in altri casi sono intere famiglie. Stesso

discorso vale per proteine del nucleo e del RE.

I principi di base che regolano il trasporto nei vari compartimenti sono:

- la sintesi delle proteine avviene in larga parte a livello dei ribosomi che si trovano nel citosol; ci

sono dei ribosomi legati al RE, ma questi non sono diversi da quelli che si trovano libero nel citosol

- le proteine, ad eccezione di quelle che devono stare nel citosol, vengono smistate; lo smistamento

può essere

o co-traduzionale: durante la sintesi della proteina avviene anche lo smistamento (questo si

verifica ne RE, dove comincia la sintesi delle proteine nel citosol e poi il complesso

ribosoma-proteina che inizia ad essere sintetizzata viene trasportata a livello del RE e, a

livello della membrana del RE, continua la traduzione)

o post-traduzionale: la proteina è prima completamente sintetizzata e liberata dal ribosoma

e poi viene mandata nel compartimento di destinazione

Le proteine del citosol non hanno nessuna etichetta, al contrario di quelle che devono migrare in altri

compartimenti. Le proteine hanno un peptide segnale o una sequenza di riconoscimento: entrambe

servono ad etichettare le proteine, ma spesso il peptide segnale viene tagliato nel momento in cui la

proteina ha raggiunto il luogo di destinazione, mentre la sequenza di riconoscimento è parte integrante

della proteina. C’è poi bisogno di un meccanismo di trasporto, che può avvenire sui microtubuli o sui

filamenti di actina; oltre a questi due c’è bisogno di un “postino” che conosca i luoghi di destinazione, posto

sulle membrane dei compartimenti che riconosce il peptide o la sequenza segnale.

Nel caso delle proteine che devono essere portate al nucleo, ai mitocondri o ai perossisomi il trasporto è

sempre post-traduzionale: la sintesi avviene nel citosol e poi una volta sintetizzate le proteine vengono poi

trasportate verso la destinazione. Nel caso dei mitocondri ci può essere una sorta di trasporto co-

traduzionale: ci sono alcune proteine in cui la sintesi inizia nel citosol e poi il ribosoma si sposa e si lega al

mitocondrio, ma è una forma di trasporto ancora poco nota. La maggior parte delle proteine che finiscono

nei mitocondri sono prima sintetizzate nel citosol e poi inviate, invece la maggior parte delle proteine che 60

finiscono nel RE è sintetizzata in modo co-traduzionale, ma anche qui ci sono delle proteine che vengono

sintetizzate in modo post-traduzionale. Tutto quello che finisce nei lisosomi, nella membrana plasmatica o

nel Golgi passa prima nel RE: solo dopo essere uscito dal RE viene poi smistato nel Golgi, nella membrana o

nei lisosomi. Nel caso dei perossisomi ci sono delle proteine che vengono sintetizzate in modo post-

traduzionale mentre alcune proteine della membrana dei perossisomi passano prima nel RE. Dal RE si

staccano vescicole che contengono proteine solubili ma che a livello della membrana contengono

frammenti di membrana (cioè proteine di membrana e lipidi) che fondendo con la membrana di

destinazione determinano l’accrescimento dei compartimenti stessi i compartimenti si accrescono

perché esiste già un compartimento preesistente. Se il compartimento non esistesse di fatto non si

potrebbe formare il tumore.

Caratteristiche dei peptidi segnale

Le proteine che sono destinate ai compartimenti hanno un peptide segnale o una sequenza di

riconoscimento.

Il peptide segnale si trova sempre all’N-terminale della proteina e nella maggior parte dei casi (ma c’è

qualche eccezione), il peptide segnale viene tagliato dopo che la proteina ha raggiunto il compartimento di

destinazione; quindi nella proteina matura potrebbe non essere presente; si trova però sempre nella

proteina immatura, cioè in fase di sintesi e questo significa che è presente anche a livello del DNA: se si sta

studiando una proteina nuova e non si conosce la sua destinazione ultima, si può andare a vedere se ha un

eventuale peptide segnale e se c’è si può essere sicuri all’80% della sua destinazione. Se invece la proteina è

già sintetizzata non si può conoscere la sua destinazione dalla sequenza.

La sequenza di riconoscimento è localizzata all’interno della proteina spesso verso al C-terminale (non in

sua corrispondenza, ma spostata verso di esso). La sequenza di riconoscimento è spesso formata da

sequenze ripetute e, proprio perché fa parte della proteina, non viene tagliata, quindi la possiede anche la

proteina matura.

Il fi greco indica amminoacidi idrofobici: tutti i peptidi segnale hanno, nella loro sequenza, amminoacidi

idrofobici; a volte questi possono essere l’uno accanto all’altro. Spesso si ha una prima regione carica

positivamente, poi una sequenza di amminoacidi idrofobici e poi la sequenza vera e propria della proteina.

Molti peptidi segnali vengono tagliati una volta che la proteina è entrata nel reticolo: c’è quindi una

sequenza amminoacidica riconosciuta da un enzima, la peptidasi del segnale. La caratteristica di avere una

sequenza del tutto idrofobica non implica che sia necessario uno specifico amminoacido, basta che siano

idrofobici.

Nel caso dei mitocondri la situazione è diversa: c’è una regione caratterizzata da amminoacidi carichi

positivamente seguita da una sequenza caratterizzata da amminoacidi anfipatici la disposizione degli

amminoacidi è tale che alcuni sono idrofobici e altri idrofilici. Se si hanno amminoacidi idrofobici e idrofilici

si può avere una struttura tridimensionale con caratteristiche anfipatiche: da un lato può interagire con

regioni idrofiliche, dall’altro con regioni idrofobiche. Questa è una caratteristica dei peptidi segnali delle

proteine mitocondriali. Il risultato è che si formano delle strutture ad elica che possono penetrare nel sito

di una proteina di membrana che prende il nome di TOM, la quale è il recettore che agisce da canale a

livello della membrana esterna dei mitocondri, dove le proteine che sono state sintetizzate nel citosol

possono andare nello spazio tra le due membrana. Un evento analogo si realizza anche nei perossisomi:

questa struttura dà origine ad una struttura ad elica in grado di interagire con il canale, permettendo alla

proteina di entrarvici. Il peptide segnale, soprattutto per la presenza di cariche positive iniziali, permette

alla proteina di entrare, poi, la regione anfipatica o del tutto idrofobica, deve entrare tutta nel canale.

Questa regione, nel caso di proteine che attraversano il doppio strato, può essere tagliata e rimanere a

livello della membrana. 61

Le sequenze segnale sono all’interno della proteina e non vengono rimosse. Vengono riconosciute da

recettori che poi servono per il trasporto. Nel caso delle proteine nucleari PPKKKR/KV è una tipica sequenza

segnale (NLS); nel caso dei perossisomi si ha la sequenza segnale composta dai 3 amminoacidi SKL e

contenuta in C-terminale di PTS1; si può avere anche un PTS2, che ha 9 amminoacidi in N-terminale ed è

riconosciuto da Pex7p; vengono riconosciuti da recettori diversi ma entrami guidano la proteina attraverso

la membrana del perossisoma. Tutte le proteine che finiscono nel Golgi, nei lisosomi o nella membrana

passano nel reticolo; questo significa che oltre al peptide segnale che indirizza queste proteine a livello del

RE, le proteine hanno delle sequenze di riconoscimento specifiche per i lisosomi, la membrana o il Golgi ecc

quindi oltre al peptide segnale ci sono delle sequenze tipiche del RE. Una delle sequenze più studiate è

KDEL che si trova nelle proteine proprie del RE (proteina residenti) e che ha la caratteristica di riportare la

proteina al RE se questa ne esce: è una sequenza che serve a sequestrare le proteine per il RE. Le proteine

del Golgi hanno una sequenza più lunga. Le proteine mitocondriali hanno un loro peptide segnale, ma

hanno anche dalle sequenze all’interno, poiché queste proteine devono attraversare due membrane, non

una e questo significa che le proteine che devono essere trasferite devono essere distinte tra quelle che

finiscono nel lume del mitocondrio, quelle che finiscono nella membrana esterna, interna, nello spazio

intermembrana ecc. Quindi le sequenze servono per riconoscere la regione all’interno del mitocondrio. Nel

caso dei lisosomi c’è un’eccezione: le proteine lisosomali sono le uniche proteine che hanno come etichetta

uno zucchero: molte idrolasi possiedono sequenze glicosidiche all’interno delle quali si viene a creare un

mannosio che porta legato un fosfato (mannosio 6 fosfato M6P) che viene riconosciuto da un recettore a

livello del trans Golgi che lo lega e il complesso viene trasferito nei lisosomi.

Trasporto delle proteine nel nucleo

La membrana del nucleo è costellata da pori e una caratteristica dei pori nucleari è di avere dimensioni

considerevoli. Nella loro regione più stretta misurano 40 nm (alcuni studi dicono che si possa arrivare anche

a 60 nm). Alcune proteine che hanno peso inferiore a 60 kilo dalton passano tranquillamente, quelle con

peso maggiore vengono trasportate con trasporto attivo. Se si considera una proteina intorno a 50 kDa essa

ha un diametro intorno a 5-6 nm, quindi passa tranquillamente in questo poro, mentre proteine di circa 10-

15-20 nm hanno difficoltà. Perché? Ci si è accorti che le proteine che costituiscono il poro nucleare, le

nucleoporine, hanno una composizione strana: da queste proteine si dipartono dei filamenti che sono

formate da alanina e glicina verso l’interno: nella parte interna del poro c’è quindi una rete formata da

queste catene laterali le quali sono anche glicosilate. Studi recenti hanno mostrato che queste sequenze

che si dipartono dalla membrana del poro e vanno verso l’interno costituiscono una rete tridimensionale:

nella regione del poro c’è una struttura tridimensionale di una sorta di gel. La caratteristica di tutti i gel è

che sembra essere una struttura impenetrabile, ma in realtà ha dei pori piccolissimi e nel caso dell’idrogel

questi pori sono intorno ai 5 nm è per questo che proteine al di sopra dei 5 nm non riescono a passare:

se nel poro ci sono le catene laterali che danno origine al gel, le proteine più grandi di 5 nm non passano, a

meno che non si leghino a dei recettori che sono in grado, in qualche modo non del tutto chiaro, di

solubilizzare parzialmente questa sorta di gel: è come se ci fosse un reticolo tridimensionale che però viene

solubilizzato da questi recettori in modo transitorio, così da permettere il passaggio delle molecole. Il

trasporto attraverso i pori nucleari non riguarda solo proteine che dal citoplasma finiscono nel nucleo, ma

anche complessi proteici che dal nucleo tornano al citosol: le proteine che formano i ribosomi vengono

sintetizzate nel citosol e trasportate nel nucleo dove avviene il montaggio dei ribosomi che sono molto

grandi (superano i 40 nm), quindi il trasporto di queste subunità richiede un trasporto attivo dal nucleo

verso il citosol. Gli RNA messaggeri vengono anch’essi sintetizzati nel nucleo, poi si complessano in nucleo-

proteine che possono avere dimensioni molto grandi, ma anche queste devono poi andare nel citosol.

Proteine che hanno un peso al di sotto dei 50 kD e diametro inferiore a 6 nm passano per semplice

diffusione, mentre proteine con diametro superiore hanno bisogno di un trasporto attivo e questo può

essere bidirezionale. Il riconoscimento delle proteine che finiscono nel nucleo è legato a sequenze di 62

riconoscimento nucleare (possono essere più di una all’interno della proteina), le quali sono sufficienti per il

trasporto nel nucleo. Si può avere una proteina normalmente citosolica e la si può modificare con una

sequenza nucleare (NLS) la proteina viene trasportata nel nucleo. Le sequenze NLS sono riconosciute da

un complesso di proteine, le importine: sono proteine di trasporto presenti nel citosol che riconoscono le

sequenze NLS e trasportano la proteina che la contiene nel nucleo. Esistono due categorie di importine, α e

β, e solitamente formano un etero-dimero: un’α si lega a una β ed entrambe portano con sé una proteina.

Dal nucleo al citosol ci sono delle esportine che riconoscono anch’esse delle sequenze (NES). Il trasporto è

mediato da queste proteine trasportine che interagiscono con le nucleoporine: il trasporto è quindi

semplificato non c’è bisogno che ogni singola proteina trasportata interagisca con le proteine del poro

nucleare: basta avere delle sequenze di riconoscimento che vengano riconosciute da un numero limitato di

proteine (importine o esportine), le quali si occupano delle proteine. Un ruolo molto importante è

assegnato alla proteina G monomerica Ran, che di fatto regola il trasporto. Essa, come tutte le G

monomeriche è attivata da una GEF e disattivata da una GAP; ha attività GTPasica legata al fatto che leghi

GAP che attiva l’attività GTPasica delle G monomeriche e per ogni proteina c’è un GAP e un GEF (qui c’è un

Ran GEF e un Ran GAP). Nel caso di Ran esiste un solo gene che codifica per Ran se quel gene non

funziona la cellula non sopravvive. Se si osserva la concentrazione di Ran con GTP legato (Ran è attiva) si

vede che essa si trova soprattutto nel nucleo; Ran con GDP legato è invece ricca nel citoplasma. Quando

porta legato GTP questo complesso è in grado di legare l’importina che a sua vola ha la sequenza segnale

NLS: la proteina è entrata nel nucleo, dove trova Ran GTP che ha la caratteristica di staccare la proteina

dall’importina e di legarla a sé stessa, così la proteina rimane nel nucleo, mentre il complesso Ran-

importina viene trasportato nel citosol, dove c’è Ran-GAP, il quale attiva l’attività GTPasica della Ran, la

quale idrolizza il GTP in GDP e fosfato e quando questo avviene Ran-GTP si stacca dall’importina, la quale è

di nuovo libera e può interagire con un’altra proteina che deve essere portata nel nucleo e anche Ran-GTP

può essere trasportata nel nucleo, dove è presente la GEF che trasforma Ran-GTP in Ran-GDP. La prima

serie di meccanismi da avere presenti quindi sono:

- Ran-GTP agisce su NLS-importina

- Stacca l’importina da NLS

- Il complesso Ran-importina può essere trasferito nel citosol

- Nel citosol Ran-GTP e importina si staccano

La stessa proteina Ran con GTP legato può anche legare nel nucleo un’esportina che porta legata una

proteina con il segnale di esportazione dal nucleo (NES); questo complesso viene trasportato nel

citoplasma, dove avviene di nuovo la disattivazione di Ran tramite GAP. Ran quindi svolge due funzioni:

- Poiché può interagire con l’importina permette alle proteine citosoliche di essere mantenute nel

nucleo

- Può portare proteine fuori dal nucleo, in quanto Ran-GTP può legarsi a un’esportina che a sua volta

lega una proteina con sequenza NES

Trasporto di proteine nei perossisomi

Ci sono delle sequenze a livello del peptide segnale, PTS1 e PTS2. Queste si trovano in due famiglie di

proteine diverse che devono finire nel lume del perossisoma. PTS1 interagisce con un trasportatore, PEX5

(PEX7 interagisce con PTS2), il quale interagisce a sua volta con proteine che fanno parte di un canale di

traslocazione a livello della membrana del perossisoma e si lega a livello delle proteine esterne di questa

struttura. I PEX, una volta legati, non vengono trasportati, ma permettono alla proteina legata di essere

trasportata all’interno: hanno una funzione tipo chaperon (proteine che permettono ad altre proteine di

mantenere una certa conformazione lineare e allungata e facilitano il trasporto tramite canali di

membrana) e in più interagiscono con il canale di traslocazione (non sono le chaperonine che interagiscono

in modo diretto con il canale). Questo è un trasporto attivo, richiede il consumo di ATP e i particolari sono

63

ancora poco noti: si sa che esiste un’interazione tra la regione N-terminale e il canale, ma non molto altro.

Proteine totalmente sintetizzate nel citosol e trasportate nei perossisomi agiscono come appena descritto.

Proteine che invece vengono trasportate dal RE ai perossisomi svolgono un percorso diverso e di queste si

sa ancora di meno, non si sa come avvenga il trasporto: è probabile che siano coinvolte delle vescicole. Le

proteine di membrana dei perossisomi derivano dal RE.

Trasporto delle proteine nei mitocondri

Anche le proteine mitocondriali hanno un peptide segnale, oltre a sequenze di riconoscimento specifiche

per le proteine della membrana mitocondriale interna, per l’esterna e per il lume. La membrana esterna e

interna comprendono una serie di canali di traslocazione che spesso sono funzionalmente legati tra loro:

- Canale SAM: sulla membrana esterna

- Canale TOM (transportation outter membran): sulla membrana esterna

- Canale TIM (transportation inner membran): sulla membrana interna

Proteine che sono state sintetizzate nel citosol e devono passare nei mitocondri vanno in contro a un

problema: se è stata totalmente sintetizzata e ha raggiunto la sua dimensione completa potrebbe essere

troppo grande per passare. Ci sono porine dei mitocondri che possono far passare molecole di 5 kDa, ma

una proteina globulare può avere facilmente una dimensione superiore che le impedisce il passaggio. Qui

entrano in gioco le chaperonine, piccole proteine che si legano a regioni idrofobiche di una proteina: una

proteina viene sintetizzata nel ribosoma e man mano che fuoriescono regioni idrofobiche dal ribosoma

interagiscono con le chaperonine, ma queste interazioni non sono molto stabili: si legano per staccarsi e per

poi rilegarsi. Tramite questo meccanismo si permette alle proteine di raggiungere una conformazione

corretta: quando si staccano tendono ad assumere una forma globulare, quando si attaccano diventa

lineare attraverso questi processi ripetuti può assumere la conformazione corretta. Questo processo si

ha ovunque, sia nel mitocondrio, che nel RE ecc. Nel caso delle proteine che finiscono nei mitocondri,

l’interazione tra chaperonine e le proteine mitocondriali permette alla proteine di mantenere una forma

allungata e attraversare così i canali di traslocazione, infatti la regione iniziale (quella del peptide segnale)

ha una prima regione idrofilica e può entrare senza nessun problema nel canale di traslocazione, poi c’è la

regione anfipatica, che avendo delle cariche positive può ancora interagire con il canale, ma il resto delle

regioni sono idrofobiche; il problema si risolve con le chaperonine, che portano queste regioni nel canale di

traslocazione. Anche in questo caso il trasporto è attivo. Quando la proteina ha attraversato il canale TOM il

più delle volte attraversa anche il canale TIM: il grosso delle proteine che finiscono nel mitocondrio, anche

se dovessero essere delle proteine che vanno nello spazio intermemrbana inizialmente vanno comunque

nel lume del mitocondrio.

Le uniche proteine che rimangono a livello della membrana sono quelle che interagiscono con SAM che

permette alle proteine di interagire con il doppio strato lipidico della membrana; tutte le altre entrano nel

nucleo, dove il peptide segnale viene tagliato via da una peptidasi del segnale e qui ci sono alternative

diverse: se la proteina è destinata al lume raggiunge la sua conformazione corretta grazie a chaperonine del

mitocondrio e la proteina rimane nel citosol; le proteine nel citosol possono anche avere una destinazione

diversa: possono restare nel lume oppure possono essere intercalate nel doppio strato lipidico; questo

dipende se nella sequenza interna ci sono delle sequenze di riconoscimento che possono essere

riconosciute da proteine della membrana mitocondriale interna, le quali le possono traslocare a livello della

membrana interna. Inoltre ci possono essere proteine che una volta entrate in TIM vengono traslocate

nella membrana interna (processo che si realizza anche nel RE); queste proteine contengono una sequenza

di riconoscimento.

Trasporto delle proteine nel reticolo endoplasmatico 64

Con questo trasporto si intende anche il trasporto di proteine che dal reticolo vengono poi smistate al

Golgi, alla membrana plasmatica e anche a quelle che verranno poi secrete all’esterno. Le proteine che

sono tipiche di un qualunque compartimento ad eccezione del citosol hanno un peptide segnale e/o una

sequenza di riconoscimento.

Le proteine che sono dirette al RE hanno un peptide segnale che ha i primi amminoacidi carichi (quindi

idrofilici) seguiti da una sequenza idrofobica che non è necessariamente conservata in una sequenza di

amminoacidi. Alla fine di questa sequenza c’è quello che è considerato il segnale di riconoscimento di un

enzima: la peptidasi di segnale (come si verifica anche nei mitocondri). Questa sequenza è necessaria nel

trasporto verso il RE, anche se in certi casi potrebbe non essere presente nel terminale amminico. Questa

sequenza, quando la proteina viene sintetizzata (la sintesi avviene nei ribosomi), è la prima a fuoriuscire dal

ribosoma: l’RNA messaggero viene trasferito nel ribosoma, dove viene letto e trasdotto in proteina e man

mano che la proteina viene sintetizzata esce dal ribosoma. Nel momento in cui la sequenza segnale esce dal

ribosoma viene riconosciuta da un complesso proteico nel citosol e che si chiama SRP (“proteina di

riconoscimento del segnale”), una ribonucleoproteina (contiene sia proteine che acidi nucleici) che ha una

forma leggermente allungata e che contiene due siti di legame: uno riconosce il peptide segnale e uno può

legarsi al ribosoma (ma è un legame non molto stabile). Questa ribonucleoproteina ha una somiglianza con

le G eterotrimeriche, ma non viene considerata una G perché: è diversa dal punto di vista della struttura e il

legame del GTP è molto debole (ma è comunque in grado di idrolizzarlo: quando porta legato GTP può

legarsi al ribosoma e alla sequenza segnale, congelando la sintesi proteica: le due subunità del ribosoma

rimangono unite, l’RNA è legato al ribosoma, la sintesi è iniziata ma non procede oltre). L’SRP può anche

legarsi a un proprio recettore che si trova sulla membrana del RE: l’intero complesso del ribosoma viene

così legato alla membrana del RE (quando diciamo che esiste un RER intendiamo questa situazione in cui

l’SRP ha legato il ribosoma a livello del RE). Il recettore lega l’SRP ma anche il recettore è una proteina che è

in grado di legare GTP e ha anch’esso attività GTPasica (somiglianza con le G monomeriche); questo legame

è importante perché è ciò che permette al recettore di legare il complesso che porta legato SRP. Quando il

GTP viene idrolizzato SRP si stacca dal recettore però nel frattempo i recettori per SRP sono sulla

membrana del reticolo e accanto ad essi ci sono canali di traslocazione, ai quali si lega il ribosoma, non

perché interagisca con il traslocatore, ma perché il peptide segnale (che nel frattempo era fuoriuscito) può

entrare nel canale di traslocazione e nel momento in cui SRP si stacca la sintesi proteica può riprendere.

Perciò:

- SRP porta il ribosoma al canale di traslocazione

- Avviene l’idrolisi di GTP

- SRP si stacca

- La sintesi riprende

Tramite il peptide segnale la proteina è ancorata alla membrana, ma il resto della proteina può penetrare

all’interno: la sintesi quindi procede all’esterno, ma la proteina viene trasportata nel reticolo

endoplasmatico. Il traslocatore è chiamato Sec 61: è una proteina eterotrimerica ed ha proteine accessorie.

Un enzima importante in questo processo è l’oligosaccaril-transferasi. Una volta che la proteina viene

trasportata all’interno il peptide segnale che era rimasto inizialmente a livello del canale di traslocazione

viene ora traslocato nel doppio strato lipidico. Nello stesso tempo la peptidasi del segnale taglia il peptide

segnale dal resto della proteina (alla fine del peptide segnale c’è una sequenza di riconoscimento per la

peptidasi). La sintesi proteica continua, il ribosoma rimane legato grazie al peptide che entra, quando c’è un

segnale di stop la sintesi finisce, le due subunità del ribosoma si staccano l’una dall’altra e ritornano nel

citosol. Questo è quando avviene per proteine solubili nel lume del RE.

Questo processo è stato studiato negli anni 80/90 e oltre metà delle conoscenze che abbiamo derivano da

studi fatti a livello del RE. Questo processo spiega bene ciò che avviene nel caso di proteine solubili nel RE,

65

ma esistono anche proteine di membrana e proteine del Golgi che devono prima passare dal RE e solo dopo

raggiungono la loro ultima destinazione: come possono essere intercalate nel doppio strato lipidico?

Questa domanda porrebbe dei problemi se il meccanismo si limitasse a quanto descritto finora. Le proteine

di membrana, una volta che la membrana stessa è stata raggiunta, in realtà hanno una posizione che

cambia il meccanismo.

Una caratteristica del traslocatore è di essere una sorta di canale che può esistere allo stato chiuso e

aperto. Inoltre questo canale è caratterizzato dal fatto di avere una regione che può aprirsi e chiudersi

verso il doppio strato lipidico, non solo verso il lume. Quando una sequenza idrofobica penetra nel canale di

traslocazione l’apertura verso il doppio strato permette il passaggio laterale della sequenza nel doppio

strato lipidico (essendo idrofobica la sequenza non può restare nel canale che di per sé è idrofilico). Questo

meccanismo è importante anche per le proteine integrali di membrana.

Le proteine di membrana hanno una disposizione all’interno del doppio strato che può variare: ci sono

proteine in cui il terminale amminico è rivolto verso l’interno e il terminale carbossilico è rivolto verso

l’esterno, ma c’è anche la situazione opposta, in cui il gruppo NH3 è nel citosol e il gruppo COOH è

all’interno; ci sono proteine inserite nella membrana senza avere una regione rivolta nel citosol e una nel

lume; abbiamo infine proteine che passano nella membrana plasmatica più di una volta. Come può la

cellula inserire una proteina più volte a livello della membrana (tenendo presente che il ribosoma è

localizzato nel citosol)? Per queste ragioni il meccanismo descritto sopra non può bastare. Le proteine di

membrana del Golgi e della membrana plasmatica sono state inserite nel RE, quindi quello che vale per il RE

vale anche per queste proteine.

Ci si è accorti che quello che si è chiamato peptide segnale è qualcosa di più complesso. Possiamo avere la

situazione in cui

- tipo I: il peptide segnale è all’inizio della proteina poi c’è all’interno una regione idrofobica

(meccanismo visto sopra)

- tipo II: Parte iniziale senza peptide segnale: la proteina è sintetizzata nel citosol; all’intero della

proteina c’è poi una sequenza che è simile al peptide segnale (alcuni amminoacidi idrofilici vicino a

una regione idrofobica)

- tipo III: Regione idrofilica (quindi non c’è il peptide segnale iniziale) e poi c’è una regione con il

peptide segnale

- tipo IV (a e b): Peptide segnale all’interno, non nella parte iniziale, seguito da sequenze idrofobiche.

Le regioni descritte come SA sono le sequenze di ancoraggio: sono sequenze simili al peptide

segnale, ma mancano della sequenza riconosciuta dalla peptidasi del segnale, quindi fanno parte

integrante della proteina. Le regioni STA non hanno gli amminoacidi idrofilici tipici del peptide

segnale: hanno degli amminoacidi idrofobici che quindi possono intercalarsi nella membrana e

proprio per questo motivo vengono chiamate proteine di stop di trasferimento (è il trasferimento

che viene interrotto); sono anch’esse regioni di ancoraggio come le SA

Trasporto e inserzione di proteine nella membrana de RE (tipo II e III)

Abbiamo una proteina con NH3 nella regione del lume del RE, la sequenza segnale è stata tagliata, il resto

della proteina è penetrata nel lume del RE. Nel mezzo c’è però una sequenza STA, la quale è una sequenza

idrofobica. Man mano che la proteina è sintetizzata vengono sintetizzati amminoacidi idrofobici che vanno

nel canale di traslocazione. Questa sequenza può essere traslocata nel doppio strato lipidico, con la

conseguenza che la sintesi proteica non viene bloccata, ma il ribosoma continua a sintetizzare la proteina

nel citosol (il resto della proteina non può più entrare). Si ha a questo punto una proteina con il terminale

amminico che è all’interno del RE, la regione idrofobica nel doppio strato lipidico e il resto della proteina

che è stata sintetizzata nel citosol. La proteina con il peptide segnale viene sintetizzato nel canale di 66

traslocazione, il peptide segnale viene tagliato, il gruppo NH3 è nel lume e la sintesi continua verso il lume;

nel momento in cui c’è la regione idrofobica questa viene traslocata nel doppio strato lipidico, ma la sintesi

continua, quindi nella regione citosolica si avrà il resto della proteina con il gruppo COOH libero. Questo è

quello che si verifica con le proteine che si trovano in membrana con il gruppo NH3 verso il lume e il COOH

verso l’esterno.

Nel caso di proteine che portano NH3 all’esterno e COOH all’intero è diverso. La regione amminica non ha il

peptide segnale, quindi ci si aspetterebbe che venisse sintetizzata nel citosol; di fatto la proteina viene

sintetizzata, fuoriesce dal ribosoma e va nel citosol. Ma nel momento in cui la sequenza SA esce dal

ribosoma l’SRP si può legare, come farebbe se fosse all’inizio della proteina, quindi a questo punto l’SRP si

lega e si congela la sintesi proteica; porta il ribosoma a livello della membrana dove è situato il traslocatore

e qui la proteina (non la parte iniziale sintetizzata, ma quella che è sintetizzata dopo) va all’interno del

traslocatore, dove viene tradotta per poi uscire. L’ultimo amminoacido è quindi un COOH. Si ha quindi una

proteina nel doppio strato con un’unica regione transmembrana con un’unica presenza di una regione che

assomiglia a un peptide segnale con cui l’SRP può interagire. Quando la proteina è legata al canale, essa

può entrarvici, ma il ribosoma non è legato al canale, bensì è tenuto al canale tramite la proteina che

penetra all’interno.

Trasporto e inserzione di proteine nella membrana del RE (tipo IVa e IVb)

Queste hanno sequenze di ancoraggio e sequenze di stop di ancoraggio che si ripetono più volte.

Le proteine di tipo IVa non hanno peptide iniziale, la sintesi avviene nel citosol, ma a un certo punto c’è una

sequenza di ancoraggio che fa sì che l’SRP possa interagire con il ribosoma. Fuoriesce questa regione, l’SRP

si lega e tutto viene trasferito a livello del RE. Questa regione rimane quindi a livello del doppio strato

lipidico e questa parte viene sintetizzata e traslocata verso il lume. La proteina continua ad essere

sintetizzata e si trova una STA, che è idrofobica, quindi viene traslocata in membrana e il resto della sintesi

avviene nel citosol, con il ribosoma che si è staccato. Se c’è una SA allora l’SRP si lega di nuovo al ribosoma

e si ripete quanto è avvenuto prima. Quindi il fatto di avere queste sequenze ripetute in modo variabile

permette di avere proteine che attraversano la membrana più volte. Quello che è essenziale è l’avere SA e

STA che si ripetono in modo alternato. Quando c’è una SA interviene SRP e ogni volta che avviene congela

la sintesi per riportare la proteina a livello del reticolo, dove può avvenire regolarmente l’inserzione e così il

processo si può ripetere.

Nel tipo IVb ci sono due SA rivolte in maniera opposta: l‘SRP si lega alla prima SA che viene sintetizzata nel

citosol ed esce dal ribosoma, poi incontra un’altra SA che lega di nuovo SRP, ma la sequenza idrofilica è

dopo la sequenza idrofobica quindi questa regione può essere intercalata all’interno (dato che è idrofobica)

e finire nel doppio strato lipidico, mentre la regione carica positivamente finirà nel citosol e continuerà la

sintesi. Quindi si ha una parte che va verso il citosol e una parte che va verso il lume

Ancoraggio di proteine nella membrana del RE con una coda lipidica

Ci sono proteine ancorate in membrana perché hanno una coda lipidica covalentemente legata alla

proteina. La coda lipidica non può essere trascritta nell’RNA messaggero (l’RNA messaggero codifica per gli

amminoacidi, non conosciamo RNA messaggeri che codificano code lipidiche). La proteina viene sintetizzata

e penetra nel lume del reticolo; la proteina contiene un sito di riconoscimento, quindi una sequenza che

viene riconosciuta da specifici enzimi, i quali possono essere enzimi che trasferiscono una sequenza di GPI

(glucosio fosfato inositolo, quindi una catena idrofilica con un glucosio) e legarla a una proteina. Nel

momento in cui la proteina ha una sequenza che è stata riconosciuta da questo enzima, questo enzima

taglia la proteina in quel punto e la lega covalentemente ad un GPI; il GPI si trova nella membrana

plasmatica. Si possono avere gruppi GPI o altri lipidi, come i farnesili (che vengono legati alla proteina Ras,

67

la quale ha una coda lipidica farnesilica), ma il processo è sempre simile; la stessa cosa vale per altre catene

lipidiche.

Modificazioni e maturazione delle proteine nel RE

Quando le proteine si trovano nel RE possono andare in contro a diverse modificazioni:

- glicosilazione di tipo N

- folding, ovvero ripiegamento e formazione di eventuali ponti di solfuro: la proteina raggiunge la sua

forma corretta (nel caso dei mitocondri questo ruolo è svolto dalle chaperonine; questo avviene ne

caso del citosol e nel RE); i ponti disolfuro tra le cisteine si possono formare solo in un ambiente

ossidante (l’ambiente del citosol è riducente e quindi non avviene la formazione dei ponti di

solfuro)

- oligomerizzazione: sappiamo che altre proteine in realtà sono formate da monomeri diversi; queste

proteine vengono assemblate, ma l’assemblaggio avviene nel reticolo, anche quando questo

riguarda le proteine della membrana. Si deve coordinare la sintesi in modo da coordinare anche la

topologia dove queste proteine possono interagire tra di loro (questo vale anche per le proteine

solubili)

- controllo di qualità e degradazione di proteine malformate: la cellula sintetizza nuove proteine e

quando la proteina non è funzionale vengono degradate. Il processo viene interrotto e la proteina

non va in contro al suo normale destino (in alcuni casi però continua il suo percorso e dà luogo alle

mutazioni)

Glicosilazione di tipo N di proteine nel RE

È una delle più importanti modificazioni: a una sequenza amminoacidica vengono legati degli zuccheri. Il

processo avviene a livello della membrana del RE ed è un processo molto semplice e molto conservato. A

livello della proteina viene trasferita una catena precostituita di zuccheri formata da due residui di N-

acetilglucosamina, 9 residui di mannosio e 3 di glucosio. Il dolicolo è un lipide della membrana del RE che

finisce con l’avere legato un oligosaccaride. La proteina viene quindi sintetizzata; c’è la regione del peptide

segnale che viene traslocata nel doppio strato; man mano che viene sintetizzata ed entra nel nucleo

fuoriescono degli amminoacidi; quando c’è una sequenza ben definita (treonina o serina seguita da un

amminoacido qualunque e poi asparagina) questa sequenza è riconosciuta come una sequenza di

glicosilazione: a livello dell’NH2 terminale viene legata l’intero oligosaccaride con un legame covalente

(questa è la ragione per cui viene chiamata di tipo N: il legame avviene all’NH2 dell’asparagina). È una

reazione abbastanza semplice. Può esserci più di una catena legata. Mentre la proteina si trova ancora nel

reticolo, i tre residui di glucosio vengono tagliati, così rimangono solo l’N-acetil-glucosamina e 9 (o solo 6)

residui di mannosio. La proteina viene poi portata nel Golgi. Il successivo taglio del glucosio è legato al

controllo di qualità.

Formazione ponti disolfuro

Perché la struttura sia corretta deve anche avvenire la formazione di ponti di solfuro. Abbiamo una

proteina con delle cisteine; per formare ponti di solfuro gli idrogenioni devono essere in alto; l’ambiente è

ossidante, quindi la reazione può avvenire, ma solo se è presente la disolfuro isomerasi, la quale porta già

legati due atomi di zolfo e per questo può ricevere degli idrogenioni: le cisteine cedono l’atomo di H a

questo enzima, che inizialmente finisce con l’essere in una forma non stabile, infatti cede i due idrogenioni

a una proteina simile alla PDI, ma anche questa è una reazione provvisoria quindi l’H viene ceduto all’O. Alla

fine si forma acqua (che viene eliminata) e un ponte disolfuro all’interno di una proteina. I ponti disolfuro

servono a stabilizzare una proteina, ma potrebbero formarsi tra due cisteine sbagliate: non è detto che

queste cisteine siano ottimali così intervengono le chaperonine che hanno la funzione di far assumere la

conformazione corretta: esse si legano nelle regioni idrofobiche delle proteine, fanno in modo che la 68

proteina assuma una forma lineare, poi si staccano così la proteina ritorna nella forma globulare e

attraverso delle reazioni la portano nella forma tridimensionale corretta. Questo rientra nel controllo di

qualità.

Controllo di qualità e ruolo di chaperons

Nel caso della calnexina e calreticolina entra in gioco il glucosio. La prima è in grado di riconoscere un

residuo di glucosio: la proteina è stata sintetizzata e ha subito una glicosilazione di tipo N, quindi ha i suoi

residui di glucosio, poi ne sono stati eliminati due ed è rimasta con un solo residuo; nel frattempo la

proteina ha cercato, grazie alle chaperonine solubili, di assumere la forma corretta. Questa proteina, grazie

al residuo di glucosio si lega alla calnexina (che è anch’essa una chaperonina), facilitando l’assunzione della

forma corretta. Dopodiché il residuo di glucosio viene tagliato via e la proteina finisce nel lume del reticolo,

non essendo più legata alla calnexina. Se la proteina non ha ancora una forma corretta viene di nuovo

glicosilata (attraverso una glicosiltransferasi), quindi viene aggiunto un altro residuo di glucosio e in questo

modo la calnexina si può legare di nuovo, in mondo da tornare a svolgere la sua azione di chaperonina: il

glucosio viene tagliato, torna nel lume e il processo si può ripetere più volte se la forma continua a non

essere corretta. La proteina corretta può entrare nel lume o essere trasportata altrove. Se il processo

invece continua a non funzionare la proteina viene trasportata nel citosol (probabilmente tramite lo stesso

canale di traslocazione attraverso cui era entrata) dove viene ubiquitinata da ubiquitina ligasi per poi essere

trasportata nel proteasoma dove viene distrutta.

Regolazione di chaperons e dell’attività de RE (UPR: unfolded protein response)

La quantità di chaperonine che viene sintetizzata e si trova all’interno del reticolo è proporzionale alla

funzione della cellula: se ci sono troppe proteine magari le chaperonine sono poche e la cellula aumenta la

sintesi delle chaperonine. La cellula quindi regola la concentrazione di chaperonine nel reticolo in base alle

necessità. A livello del RE ci sono dei sensori, cioè delle proteine transmembrana e alcune di queste

possono essere fosforilate, mentre altre possono essere tagliate e trasferite al Golgi dal quale possono poi

essere trasferite al nucleo. Quando queste proteine vengono fosforilate esse a loro volta favoriscono la

fosforilazione di fattori di trascrizione che entrano all’interno del nucleo e sono quelle che regolano di fatto

la sintesi di chaperonine. Questi fattori di trascrizione hanno una doppia funzione:

- favoriscono la sintesi di nuove chaperonine

- rallentano la sintesi proteica in generale, quindi la sintesi di chaperonine finisce con il prendere il

sopravvento rispetto alla sintesi di proteine

Questo è un sistema di tutoraggio, ma se insistono nel non riuscire vengono portate nel proteasoma.

Generazione di nuova membrana nel RE

Il RE è anche deputato alla sintesi di lipidi di membrana, non solo di proteine. La sintesi avviene a livello

della regione citosolica del reticolo. I nuovi lipidi vengono inseriti a livello dello strato rivolto verso il citosol

che quindi tende ad aumentare di dimensioni. Se non ci fossero altri meccanismi avremmo uno strato che

tende ad aumentare e uno che rimane sottile. Ci sono però delle flippasi che trasferiscono i lipidi da uno

strato all’altro: i lipidi non potrebbero attraversare il doppio strato lipidico se non ci fossero le flippasi. In

questo modo la membrana si accresce e con lei si accresce anche la porzione proteica: questa è la

condizione necessaria perché dalla membrana del RE si formino delle vescicole: il processo di trasporto

avviene con vescicole: la membrana plasmatica, il Golgi e tutto il resto si formano tramite vescicole.

Trasporto e smistamento dal re al Golgi e ai compartimenti post-Golgi

Il trasporto tramite vescicole non riguarda soltanto il RE ma anche altri due fenomeni: 69

- il trasferimento delle vescicole dal Golgi alla membrana

- il trasferimento delle vescicole dalla membrana verso i lisosomi, con i quali poi si fondono

In entrambi i casi le proteine coinvolte, anche se non sono le stesse, seguono uno stesso meccanismo. Le

problematiche del traffico delle vescicole sono:

- come si formano le vescicole?

- non tutte le proteine del RE devono lasciarlo: come avviene la selezione?

- Le vescicole ad un certo punto devono fondere con il compartimento di destinazione, ma non

devono fondersi a caso; come fanno le vescicole a riconoscere i compartimenti di destinazione in

modo selettivo?

- Come si muovono le vescicole? Non si muovono per diffusione, ma si muovono sul citoscheletro, o

di actina o dei microtubuli, movimento che richiede energia e che deve essere estremamente

rapido

Man mano che il reticolo aumenta di dimensioni (per inserzione di proteine di membrana e di lipidi) la

membrana si ingrandisce, ma questo non basta per far formare le vescicole, infatti affinché si formino la

membrana deve prendere la forma delle future vescicole, quindi deve incurvarsi. Non c’è però nulla di

intrinseco nella struttura della membrana che fa pensare che si formino queste vescicole in automatico e

infatti, affinché si formino, c’è bisogno di alcune proteine particolari: queste proteine rivestono alcune zone

della membrana plasmatica e del Golgi e per alcune loro caratteristiche particolari si possono staccare e

possono così formare le vescicole. Queste proteine sono delle clatrine; la clatrina polimerizza e dà così

origine a un polimero che ha una forma di vescicola. La stessa cosa vale per le proteine COP I e II: anch’esse

polimerizzano e danno origine a una forma rotondeggiante. Grazie a questo processo queste proteine

portano alla formazione di vescicole se al loro interno c’è il doppio strato lipidico di una membrana a mano

a mano che polimerizzano. Sia le clatrine che le COP potrebbero polimerizzare anche senza la membrana,

ma non avremmo poi una vescicola. La clatrina si trova a livello della membrana plasmatica (nei processi di

endocitosi) e a livello del trans Golgi; COP I e II si trovano a livello del RE (in particolare COP II); le vescicole

che si staccano dalla regione intermedia del RE e dal cis Golgi hanno COP I. La clatrina è formata da tre

catene pesanti e tre leggere e nell’insieme queste subunità prendono il nome di trischelion; quando più

proteine con questa forma polimerizzano tra loro danno origine a una struttura composta da esagoni e

pentagoni che nell’insieme possono circondare una vescicola. La ragione è dovuta alla forma che hanno i

monomeri. La stessa cosa avviene per le COP I e II anche se in questo caso la forma non è così

rotondeggiante come nella clatrina. È necessario che sotto ci sia la membrana perché si formi la vescicola.

Quando la clatrina o le COP I e II polimerizzano ci sono delle proteine che permettono loro di aderire alla

membrana; questa adesione è mediata da altre proteine (sia la clatrina che le COP di per sé non

aderirebbero alla membrana), ovvero da proteine G monomeriche della famiglia Arf. Le Arf sono proteine

monomeriche libere nel citosol che contengono al loro interno una coda lipidica. Questa coda è protetta

all’interno della proteina stessa; come tutte le G monomeriche le Arf vanno in contro al ciclo GTP – GDP.

Quando le proteine Arf legano GTP, grazie all’azione di proteine accessorie GEF, a livello della proteina

avviene un cambiamento conformazionale tale per cui la coda lipidica viene esposta all’interno e di fatto la

proteina non ha alternativa se non inserire la coda nella membrana. A questo punto c’è il reclutamento in

membrana delle proteine clatrina o COP, che cominciano a polimerizzare attorno alla membrana. Quando

la polimerizzazione è ultimata ci dovrebbe essere la formazione della vescicola; però la vescicola può

crescere per la polimerizzazione di COP o clatrina, ma quando la polimerizzazione è quasi arrivata alla fine

l’ultima formazione (dove si dovrebbe avere la chiusura della membrana per polimerizzazione all’esterno

della clatrina) non avviene facilmente, in quanto le proteine che polimerizzano non sono in grado di

strozzare la membrana: possono piegarla, ma non sono in grado di ultimare la chiusura della membrana

stessa. Quest’ultimo processo richiede l’azione di un’altra proteina, la dinamina, che è una proteina che 70

polimerizza intorno alla membrana come un anello ed è in grado di strozzare la membrana, in modo tale

che le due membrana interne finiscano con l’avere lo spazio sufficiente per poter fondere (quando abbiamo

due membrane lipidiche al di sotto di 20 nm le membrane possono fondere tra di loro). Tutte le vescicole

che si fondono nella cellula richiedono l’intervento della dinamina; anch’essa ha una attività GTPasica e

funziona con lo stesso meccanismo delle G monomeriche. La vescicola si è quindi staccata dalla membrana.

Ci sono Arf che agiscono a livello del RE, Arf che agiscono a livello della membrana plasmatica. Per sapere

quale sia la membrana giusta in cui intercalarsi sfruttano i fosfatidil inositolo fosfati (PIP). Esistono diverse

classi di PIP: a livello del trans Golgi abbiamo il PI4P, a livello della membrana plasmatica abbiamo il PI4,5P;

la presenza di questi lipidi diversi condiziona il legame alla membrana delle proteine della famiglia ARF, le

quali hanno un dominio PH che permette loro di riconoscere i vari PIP che si hanno in membrana. i domini

PH riconoscono i PIP, ma non in modo indiscriminato: alcuni riconoscono PIP4, altri PIP3,4 ecc. In base al

dominio PH le Arf si legano a una membrana piuttosto che a un’altra, favorendo la polimerizzazione delle

vescicole in quella membrana: il processo è abbastanza regolato: da un lato ci sono le Arf che si devono

intercalare in membrana dopo aver riconosciuto il giusto PIP; dopo di che, che sia la clatrina o COP, Arf

polimerizza intorno e si ha la formazione della vescicola completa.

Le vescicole servono al trasporto. Come avviene il riconoscimento da parte delle proteine che devono

lasciare per esempio il RE e finire al Golgi? Oltre alle proteine che circondano la vescicola, oltre alle Arf c’è

una terza classe di proteine, che entrano a far parte della vescicola e che sono della famiglia delle adattine;

queste sono proteine che interagiscono a livello della membrana da un lato con possibili recettori di

membrana, dall’altra interagiscono con le proteine del rivestimento proteico: grazie alle adattine i recettori

possono essere ancorati alla vescicola. I recettori a loro volta possono portare dei ligandi che sono proteine

le quali devono essere trasportate in altri compartimenti. Alla base dell’interazione tra i recettori e le

proteine che devono essere trasportate ci sono dei segnali di riconoscimento che danno origine a una

struttura tridimensionale corretta della proteina che viene riconosciuta dai recettori. Questo avviene anche

nel caso del trasporto delle LDL all’interno della cellula. Una volta che la vescicola è chiusa essa può

muoversi, grazie all’interazione con il citoscheletro, cioè grazie all’interazione con le proteine motrici.

Le proteine più esterne, una volta che la vescicola si è formata, non sono più aderenti alla vescicola stessa:

il rivestimento proteico formato dalla clatrina e dalle COP si distacca dalla vescicola dopo che la vescicola si

è formata con un processo opposto rispetto a quello che aveva portato alla polimerizzazione del

rivestimento proteico: se le Arf sono responsabili del rivestimento proteico grazie al fatto di aver legato

GTP ed essersi così intercalate in membrana, nel momento in cui il GTP viene idrolizzato le Arf ritornano ad

avere la loro struttura (portano legato GDP) e nel momento in cui riacquisiscono la loro forma originaria la

coda lipidica torna ad essere all’interno della proteina, quindi avviene il distacco dalla membrana e il

conseguente distacco del rivestimento proteico. La polimerizzazione del rivestimento proteico era stato

possibile grazie alle Arf, ma nel momento in cui queste si staccano dalla membrana, anche le proteine del

rivestimento si staccano. Quindi si ha una vescicola senza il rivestimento più esterno, ma con le proteine

della membrana che attraversano il doppio strato e che quindi hanno una regione all’esterno, che è quella

con cui possono interagire con le chinesine e le dineine. Le vescicole trasportate sono nude: non hanno più

il rivestimento proteico. La vescicola deve poi fondere con il compartimento e la fusione è dovuta alle

proteine Rab (G monomeriche) e SNARE; le Rab vanno anch’esse in contro al ciclo GTP-GDP, hanno

anch’esse una coda lipidica. Quando portano legato GTP si legano alle vescicole. C’è una famiglia enorme di

Rab; alcune di queste si trovano legate a particolari vescicole o a particolari compartimenti. Le Rab sono in

grado da un lato di legarsi con la coda lipidica alle vescicole o ai compatimenti, dall’altro lato sono in grado

di legare adattatori che a loro volta possono interagire con altre vescicole o altri compartimenti. Di fatto le

Rab mediano l’interazione tra una vescicola e il compartimento di destinazione, grazie a proteine effettrici.

L’interazione tra le proteine e il compartimento di destinazione non è molto stabile: il legame mediato dalle

Rab è un legame transitorio. Le Rab permettono l’ancoraggio della vescicola, facendola rimanere 71

provvisoriamente legata al compartimento di destinazione e se non c’è allora la vescicola può staccarsi; il

passo successivo è dovuto alle proteine della famiglia SNARE, le funi che ancorano in maniera stabile la

vescicola alla membrana. Sono proteine che inizialmente furono scoperte nei virus: i virus interagiscono

inizialmente con la membrana, si forma una vescicola e vengono poi endocitati; i virus non vogliono finire

nei lisosomi e allora producono delle proteine che finiscono nella vescicola ancorando così il virus alla

cellula al di fuori dei lisosomi. Queste proteine SNARE determinano un arrotolamento e quindi la

formazione di strutture stabili. L’attorcigliamento delle SNARE una sull’altra fa sì che la vescicola si accosti

sempre più alla membrana facendo in modo che la vescicola e la membrana stessa siano a 20 nm di

distanza, così che si possano fondere. A seguito della fusione quello che c’era nella vescicola finisce nel

lume del compartimento di destinazione e la membrana della vescicola accresce la membrana del

compartimento di destinazione.

Le proteine che lasciano il RE per andare al Golgi hanno sequenze specifiche che sono quelle che

permettono alla cellula di capire quali devono andare nel Golgi e quali devono rimanere nel RE. Quando si

forma la vescicola, grazie alle sequenze di riconoscimento vengono riconosciute le proteine che vengono

trasportate. Le proteine che non hanno sequenze di riconoscimento proprie del RE vengono trasportate via

dal RE. Se hanno sequenze specifiche del Golgi restano nel Golgi. Se non hanno le sequenze specifiche del

Golgi verranno trasportate verso la membrana. Proteine che non hanno nessun segnale interno sono

destinate alla membrana plasmatica o ad essere secrete. Quindi alcune sequenze permettono di tenere le

proteine nel RE o di riportarle al RE, altre di mandarle nel compartimento di destinazione. Quando le

proteine si staccano dalla membrana plasmatica hanno un pH intorno a 7, man mano che fondono in un

compartimento tramite vescicole hanno un enzima che serve per abbassare il pH. I cambiamenti di pH

riguardano anche le proteine che vanno verso l’esterno.

Questo discorso non riguarda solo proteine, ma anche lipidi: tutti i precursori dei glicolipidi, del colesterolo

ecc vengono sintetizzati nel RE. Una buona parte dei lipidi sintetizzati a livello della membrana del RE

lasciano il reticolo: almeno il 70% dei lipidi di membrana sintetizzati nel RE finiscono nella membrana. Come

fa la cellula a sapere quali lipidi devono andare dove? Non sappiamo ancora il meccanismo esatto;

sappiamo per esempio che tutti gli steroli lasciano il RE. Il grosso dei lipidi lasciano il RE tramite vescicole; ci

sono altri lipidi che lasciano il RE legati a proteine: sono lipidi che finiscono nei mitocondri o nei

perossisomi, ma anche in questo caso non si conosce ancora il meccanismo di selezione di questi lipidi.

Le proteine lasciano il RE e vanno al Golgi, dal quale vanno poi alla membrana. Il Golgi, insieme al RE è la

sede della maturazione delle proteine e dei lipidi. Nel Golgi avviene:

- O-glicosilazione di proteine e lipidi: aggiunta di singoli zuccheri o a livello di una Ser o Thr o a livello

di una catena di zucchero preesistente. Le catene glicosidiche vanno in contro a modifiche: alcuni

residui possono essere tolti oppure possono essere aggiunti altri zuccheri. Poiché l’aggiunta di

zuccheri avviene con un legame su un gruppo OH terminale, prende il nome di glicosilazione di tipo

O. Quando le proteine arrivano cambiano gli enzimi glicosidici che si hanno nei vari compartimenti:

il substrato che arriva in un compartimento incontra certi enzimi e non altri. Se non ci fosse questa

suddivisione in compartimenti si avrebbe la formazione di catene glicosidiche del tutto casuali,

invece si ha una sequenzialità nell’aggiunta dei carboidrati e grazie a ciò viene garantita la

formazione di una sequenza glicosidica corretta nelle varie proteine: se si prendono copie della

stessa proteina tutte queste copie hanno la stessa glicosilazione (ma questo è possibile non perché

si ha lo stampo, ma perché c’è una sequenza diversa di enzimi che si trovano in compatimenti

diversi). Le catene gliscosidiche stabilizzano le proteine. Avendo catene glicosidiche proiettate

verso l’esterno (le catene glicosidiche sono idratabili) esse proteggono la parte proteica della

glicoproteina. La prima funzione delle catene glicosidiche è quindi quello di proteggere le proteine

di membrana; la seconda funzione è quella antigenica: vengono riconosciute da altre cellule per 72

garantire la specificità di interazione e in questo modo possiamo avere una risposta anticorpale

specifica.

- Sintesi di sfingolipidi a partire da ceramide (aggiunta nel RE)

- Solfatazione di carboidrati e tirosine terminali: la solfatazione è l’aggiunta di gruppi solfato. La

cellula può aggiungere dei gruppi solfato a livello di tirosine terminali o di carboidrati. Se si

aggiunge un residuo di solfato a un lipide o a un carboidrato vuol dire che si aggiungono cariche

negative. La solfatazione fa sì che proteine che potrebbero essere meno solubili diventino più

solubili e inoltre, avendo carica negativa possono interagire con cariche positive. A differenza delle

fosforilazioni che sono transitorie, le solfatazioni sono più stabili; molte proteine che sono enzimi

idrolitici vengono solfatate (anche se di ciò non è chiaro il fine)

- Maturazione proteolitica di pro-proteine: essa comincia nel RE, dove si formano oligomeri e le

proteine che formano dei complessi interagiscono tra di loro. L’ultima reazione pro avviene nel

Golgi; questa reazione serve per le proteine che hanno una regione all’N terminale che viene

tagliata prima che la proteina sia maturata; le proteine pro vengono quindi mandate nel Golgi sotto

forma di proteine immature; il collagene forma dei polimeri, dovuti al fatto che i monomeri

interagiscono tra di loro, ma questa interazione non avviene finché le proteine di collagene sono di

pro-collagene è necessario che la regione pro sia tagliata via affinché il collagene possa

aggregare lo stesso procedimento è usato dalle pro-proteine, le quali o formano aggregati o

formano altri polimeri. Queste reazioni avvengono solitamente nel trans Golgi, regione terminale di

maturazione prima che le vescicole si fondano con la membrana plasmatica. Molte di queste

proteine sono proteine extra cellulari e vengono secrete all’esterno, ma come proteine mature,

maturazione che avviene nel trans Golgi

- Lo smistamento di proteine della membrana plasmatica e dei lisosomi.

Proteine che non hanno segnali particolari finiscono in membrana. Dal trans Golgi però una parte delle

proteine fini sono nei lisosomi; questi sono gli enzimi idrolitici. Ci sono più meccanismi attraverso cui la

cellula li smista; quello che si conosce meglio è legato alla presenza di un mannosio che viene legato

tramite un gruppo fosfato in posizione 6 alla parte più esterna di una catena glicosidica e a sua volta il

mannosio viene riconosciuto da un recettore a livello del trans Golgi. Quando gli enzimi idrolitici lasciano il

RE gli oligosaccaridi legati a un proteina interagiscono in un primo tempo con una GlucNac-fosfo

transeferasi (cioè con un enzima che trasferisce un N-acetil glucosammina e a sua volta ha legato un

fosfato); questa reazione avviene a livello del cis Golgi: a livello della catena laterale glicosidica di un enzima

idrolitico viene legata la catena di N-acetil glucosammina con due gruppi fosfato; il passaggio successivo è il

taglio dell’N-acetil glucosammina dal fosfato (il fosfato era legato al mannosio terminale, infatti le catene

che avevano lasciato il RE avevano come gruppi terminali i mannosi); si generano così delle catene legate

alla proteina che hanno un mannosio 6 fosfato terminale, il quale, a livello del trans Golgi (quindi

nell’ultima regione del Golgi) viene riconosciuto da un recettore, il quale lega l’enzima e forma così una

vescicola. Questa lascia il trans Golgi, fonde con i lisosomi, dentro cui il pH è basso e questo permette

all’enzima di staccarsi dal recettore, così il recettore viene di nuovo riciclato a livello del Golgi. All’interno

del lisosoma il fosfato viene poi eliminato e in certi casi viene eliminato anche il mannosio, così l’enzima

può agire all’interno del lisosoma stesso. Ci sono alcuni casi in cui questi enzimi idrolitici finiscono

all’esterno della cellula, quindi è come se il meccanismo di trasporto non fosse così selettivo. Però le cellule

hanno a livello della membrana plasmatica un recettore per il mannosio 6 fosfato, quindi vengono legati e

ritrasportati all’interno della cellula per endocitosi e fondono con i lisosomi; quindi anche questi enzimi

idrolitici fanno la stessa fine (quest’ultima è una via di recupero).

Ci sono una serie di malattie legate a difetti del trasporto

- Sindrome di Zellweger: perossisomi vuoti per difetti in proteine dei canali di traslocazione

- Sindromi da accumulo lisosomiale: danno gravi difetti neurologici 73

- Malattie da mancato trasporto dal RE

PROCESSI DI ENDOCITOSI E FAGOCITOSI

L’endocitosi propriamente detta comprende endocitosi mediata da clatrina e caveolina. L’endocitosi non

mediata da clatrina e caveolina si chiama macropinocitosi, che differisce dall’endocitosi per alcuni motivi:

gli endosomi hanno una struttura relativamente piccola (diametro medio circa 220nm), mentre nel caso

della macropinocitosi non c’è una dimensione definita (possono essere molto piccole ma anche arrivare ai

micron). Un’altra forma di endocitosi è la fagocitosi, che differisce dall’endocitosi perché mentre tutte le

forme di endocitosi sono forme costitutive, cioè non regolate da segnali, la fagocitosi è dipendente

dall’adesione della particella che deve essere fagocitata. L’interazione tra la particella e la membrana

plasmatica in questo caso induce un segnale che porta alla fagocitosi. Poiché è regolato da segnali, nei

mammiferi è limitato solo ad alcune cellule. Non tutte le cellule possono andare in contro a fagocitosi, ma

tutte possono andare in contro a endocitosi. Le cellule che nei mammiferi possono svolgere fagocitosi sono

i macrofagi; ci sono delle cellule in tessuti diversi che si comportano come macrofagi: cellule della microglia

che sono anch’esse dei macrofagi o le cellule di Cuppfer nel fegato. I macrofagi in senso stretto sono cellule

che si trovano nel sangue e sono responsabili della fagocitosi e hanno una funzione difensiva. La membrana

plasmatica finisce con il formare delle invaginazioni all’interno delle quali si può avere dell’acqua

(endocitosi o pinocitosi) o delle particelle (fagocitosi); se le particelle sono particolarmente grandi possono

essere internalizzate da macropinocitosi. Ci sono dei batteri che possono essere endocitati per

macropinocitosi e non fagocitosi. Nel momento in cui si sono formati degli endosomi o dei fagosomi le

vescicole fondono con una serie di vescicole che sono presenti tra la membrana plasmatica e il Golgi;

queste sono vescicole transitorie: endosomi primari sono endosomi che una volta penetrati nella cellula

fondono con un complesso di membrane; il pH intorno alla cellula è intorno a 7; quando ci sono le

endocitosi il pH si abbassa. Dagli endosomi primari si formano gli endosomi tardivi e da questi si formano gli

endolisosomi, in cui si può avere un pH intorno a 4. Nel momento in cui i lisosomi fondono con vescicole

che hanno un pH più alto il pH si abbassa ma è un valore intermedio. Nella prima fase, cioè quando si sono

formati gli endosomi primari e prima che si vada avanti con la maturazione, avviene che, se c’è un ligando

che si è legato a dei recettori presenti sull’endosoma, con l’abbassarsi del pH, che è già più basso,

l‘interazione tra il ligando e il recettore cessa; il recettore, rimasto attaccato alla membrana dell’endosoma,

attraverso la formazione di vescicole viene riciclato a livello della membrana. Questo avviene spesso perché

in questo modo si risparmia tempo ed energia. Il ligando che si è staccato fonde invece con vescicole che

derivano dal lisosoma e avviene così la formazione degli endosomi maturi con un pH ancora più basso. La

stessa cosa avviene con i fagosomi: il batterio viene internalizzato e con l’abbassamento del pH avviene il

distacco, poi il recettore è riutilizzato, il batterio viene trasportato a un pH più basso e questo

abbassamento è una forma di digestione. I lisosomi non contengono solo l’ATPasi di membrana che serve

per l’abbassamento del pH, ma contengono anche enzimi idrolitici. Il processo digestivo è graduale.

Non tutte le vescicole che fondono derivano direttamente dal lisosoma; ci possono essere anche vescicole

che dal trans Golgi fondono con gli endosomi primari e quindi le proteine sintetizzate dal RE e trasportate al

Golgi fondono anch’esse con gli endosomi primari; queste non raggiungono la membrana plasmatica

perché contengono enzimi utili ai lisosomi e servono per la loro maturazione. Nel processo da endosomi a

lisosomi le Rab svolgono un ruolo importante: esse facilitano la fusione con le vescicole che provengono dal

lisosoma e dal Golgi. La macropinocitosi è un processo costitutivo della cellula.

Così come la cellula può fagocitare particelle dall’esterno, in particolari condizioni la cellula fagocita

materiale endogeno: le cellule distruggono una parte del loro contenuto cellulare (mitocondri, proteine,

perossisomi) e si parla di autofagia. Questo processo è legato al fatto che quando la cellula non può

sfruttare una fonte energetica esterna utilizza una fonte interna; è ciò che succede nelle situazioni di

digiuno prolungato. 74

Endocitosi mediata da recettore

Le LDL sono delle lipoproteine a bassa densità formate da proteine complessate con lipidi. I lipidi formano

una sorta di struttura idrofobica; all’esterno si hanno fosfolipidi, le code lipidiche sono all’interno e dentro

questa struttura c’è del colesterolo che viene trasportato all’interno delle cellule. È un processo che avviene

per lo più nel fegato ma non solo. Ci sono recettori a livello della membrana che legano queste strutture e

una volta che questo avviene il recettore si muove passivamente lungo la membrana plasmatica e può

finire nelle fossette endocitiche, dove ci sono le adattine, proteine che da un lato interagiscono con il

recettore di membrana e dall’altro interagiscono con la clatrina e attraverso questa interazione questi

recettori portano LDL e finiscono con l’essere ancorati alla fossetta endocitica. Se il legame tra recettore e

adattina non avviene allora il recettore penetrato nella fossetta endocitica lascia la fossetta e non viene

internalizzato. Se invece è tutto normale si forma l’endosoma. I casi in cui abbiamo l’ipercolesterolemia

famigliare, legata all’LDL, ci si riferisce al fatto che c’è una base genetica per cui il colesterolo rimane alto

nel sangue. Le cause possono essere:

- Recettori di LDL o apo-B difettosi: il recettore non lega l’LDL oppure il legame avviene, ma c’è un

difetto a livello della regione citosolica in ogni caso LDL non viene internalizzato. Se è difettosa

l’apo-B allora la particella non può legarsi al recettore

- Legame di LDL al recettore normale, ma difetto nell’ancoraggio all’adattina

- Difetti nella formazione della vescicola (ma non limitati al solo riciclo di LDL) più raro

Questo processo è importante. Uno dei meccanismi che la cellula usa per controllare la sintesi di sostanze

importanti è il controllo delle modificazioni chimiche e la loro concentrazione: se c’è del colesterolo sotto

forma esterificata nel citosol e la sua concentrazione è bassa questa stimola la sintesi per nuovo RNA per gli

enzimi che servono per la sintesi di nuovo colesterolo; man mano che il colesterolo viene sintetizzato e

intervallato nelle membrane nel RE, esso viene trasportato verso l’esterno; c’è quindi la formazione di

vescicole di HDL che diventano di LDL le quali finiscono nel circolo sanguigno e da qui vanno negli epatociti.

Se non c’è assunzione di colesterolo la concentrazione di colesterolo all’interno della cellula rimane basa,

quindi la cellula risponde producendo più colesterolo. Nel caso dell’ipercolesterolemia, il colesterolo c’è,

ma non riesce ad entrare nella cellula e si accumula all’esterno, quindi la cellula vede sempre poco

colesterolo e quindi continua a produrne. Negli omozigoti ci possono essere concentrazioni molto alte di

colesterolo nel sangue, il che può provocare problemi a livello cardiovascolare: l’aumento di colesterolo

(che in circolo viene ossidato) dà origine alle placche che portano al restringimento a livello dei vasi

sanguigni e se questo si verifica a livello del cuore o delle coronarie o a livello delle arterie che portano

sangue al cervello si rischia infarto o ictus. Nel caso degli eterozigoti i valori non saranno alti come negli

omozigoti, ma si deve comunque abbassare la concentrazione di colesterolo. Uno dei farmaci usati è la

statina, che blocca la sintesi di colesterolo a monte, ma così facendo blocca anche la produzione di steroidi,

quindi hanno altri effetti negativi. Servirebbe un farmaco che blocchi la sintesi di colesterolo all’ultimo

stadio.

Altro esempio di endocitosi è il trasporto di ferro nelle cellule. Il ferro circolante nel sangue assunto tramite

la dieta, viene legato a un recettore di membrana. Il Fe viene assunto anche attraverso un recettore di

membrana DMT1: questo trasporta Fe ferroso (Fe++). Il Fe+++ (ferrico), più comune, tende a precipitare e si

lega alla transferrina formando così un complesso Fe-trasferrina, il quale si lega al recettore di membrana

(recettore della transferrina). Questo recettore finisce nelle fossette endocitiche, anch’esse ricoperte di

clatrina, e così il complesso viene internalizzato. All’interno dell’endosoma il pH si abbassa, la

ferrotransferrina si stacca dal recettore, il Fe+++ si stacca dalla transferrina, la transferrina viene

trasportata in membrana, il Fe+++ viene ridotto a Fe++ tramite delle reduttasi che ci sono sulla membrana

dell’endosoma e viene quindi trasportata nel citosol tramite un trasportatore simile al DMT1, che si chiama

Nramp1. Il grosso del Fe serve nei mitocondri dove forma i gruppi eme e i gruppi Fe-S. Il Fe è un cofattore di

75

una serie di enzimi nella cellula, è molto importante nelle cellule, ma è anche dannoso: soprattutto il ferro

ferrico può dare origine a radicali dell’ossigeno, dannosi per le cellule. È necessario tenere la concertazione

del Fe sotto controllo e la cellula lo fa con una serie di proteine.

L’endocitosi mediata da recettore è anche utilizzata dalla cellula in quello che si chiama desensitizzazione

dei recettori. Uno dei meccanismi che la cellula usa per ridurre la sensibilità ai segnali esterni è quello di

ridurre il numero dei recettori di membrana quindi se c’è un segnale sempre costante all’esterno,

riducendo i recettori diminuisce la risposta al segnale (processo alla base della sopportazione di sostanze

tipo alcol). Questo processo è reversibile.

L’endocitosi mediata da recettori è sfruttata dai virus per entrare nella cellula. I virus hanno una membrana

all’esterno che è simile alla membrana plasmatica: ha un doppio strato lipidico, ha alcune proteine rivolte

verso l’esterno. Questa membrana, affinché il virus entri nella cellula deve fondere con la membrana

plasmatica, quindi deve interagire con delle proteine, che sono recettori di membrana, recettori molto vari.

Questi recettori permettono al virus di ancorarsi alla membrana e una volta ancorato il virus trasferisce a

livello della membrana una parte della proteina che gli è servita per entrare a contatto con la membrana;

queste si chiamano proteine di insieme (?) e agiscono come le SMEA (proteine che permettono alle

vescicole che arrivano in un compartimento di fondere con quel compartimento): queste proteine di

fusione, legate da una parte alla membrana del virus e dall’altro alla membrana plasmatica, permettono

l’ingresso del virus nella cellula). Questo è uno di meccanismi con cui i virus infettano le cellule.

Fagocitosi

È un processo non costitutivo ma mediato da segnali, i quali derivano da contatto tra la particella che deve

essere fagocitata e la membra plasmatica del fagocita. Ci sono delle cellule che normalmente non sono

fagociti professionali ma sono in grado di fagocitare: per esempio le cellule epiteliali fagocitano solo in

particolari condizioni e diventano quindi fagociti non professionali. La particella deve interagire con

proteine (dei recettori) all’interno della membrana così che si formi una interazione stretta in modo tale da

circondare la particella che deve essere fagocitata; i recettori che hanno interagito con la particella da

fagocitare stimolano quindi l’actina a polimerizzare. Mentre l’endocitosi è legata alla polimerizzazione della

clatrina o della caveolina, nel caso della fagocitosi è direttamente coinvolto il citoscheletro di actina, che

polimerizza a livello della membrana in modo che la membrana sia proiettata verso l’esterno. L’actina deve

scomparire perché finché l’actina è intorno alla vescicola essa non è in grado di fondere con altre vescicole

della via endocitaria. L’actina è fondamentale nella parte iniziale, ma dopo deve essere eliminata perché la

vescicola possa fondere per formare i fagosomi primari, fondendo con vescicole che portano la VH+ ATPasi

per abbassare il pH. La membrana plasmatica contiene soprattutto PI(4,5)P, il quale è in grado di legare

proteine con domini PH e alcune di queste proteine sono associate all’actina. Le proteine associate

all’actina si legano ai siti PI4,5 fosfato e a loro volta, le proteine associate all’actina permettono

l’assemblaggio di actina alla membrana: l’actina si lega solo perché queste proteine fanno da ancora con

lipidi come PI(4,5)P. Questo permette la formazione dell’actina intorno alla membrana e quindi attorno alla

particella che deve essere fagocitata. La cellula quindi attiva la fosfolipasi C, enzima che idrolizza l’inositolo

legato alle catene fosfatidiche, in modo tale che l’inositolo venga trasportato nel citosol, quindi si riduce la

quantità di PI4,5 in membrana e questo porta al disassemblaggio dell’actina attaccata alla membrana. Un

altro enzima che contribuisce è la PI3K, che fosforila il PI(4,5)P, aggiungendo un altro fosfato in posizione 3

e formando così il PI(3,4,5)P. Il 3,4,5 fosfato è diverso al 4,5 fosfato: le proteine che si associavano ala

membrana perché riconoscevano il 4,5 fosfato ora non si legano più. L’actina quindi in questi due modi

viene disassemblata.

Il fagosoma a questo punto può fondere con le vescicole e questo dà origine all’ambiente acidico dove ci

sono gli enzimi idrolitici che servono a degradare la cellula all’interno del fagolisosoma. Questo è il lipide a

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livello della membrana che a sua volta lega proteine che permettono alle vescicole di fondere con il

fagosoma nudo.

L’autofagia

Segue una via simile, la differenza è che siamo all’interno della cellula. Un mitocondrio, per esempio, viene

trasportato nel lisosoma. Si sintetizza una membrana intorno al mitocondrio, quindi questa specie di

vescicola fonde con il lisosoma e il mitocondrio viene degradato all’interno del lisosoma. Si può avere anche

il trasporto delle proteine che vengono distrutte per autofagia e vengono trasportate mediante

chaperonine.

Il fago-lisosoma

Il lisosoma contiene una grande varietà di enzimi idrolitici (nucleasi, proteasi, glicosidasi, lipasi, fosfatasi,

solfatasi, fosfolipasi) i quali agiscono bene a pH basso. Il lisosoma ha un pH basso grazie alla VH+ ATPasi:

essa sfrutta ATP per pompare protoni all’interno del lisosoma. Il batterio che si trova all’interno del

lisosoma viene aggredito dagli enzimi, come il lisozima: esso ha la caratteristica di aggredire la membrana

dei batteri. A livello del lisosoma non ci sono solo enzimi idrolitici, ma anche altri elementi, come l’O,

soprattutto nella forma radicale: in questa forma l’O è molto ossidante e può distruggere proteine, DNA

ecc… la cellula sfrutta questi radicali per aggredire batteri e qualunque sostanza che penetri all’interno. Ma

sfrutta anche gli stessi protoni, che abbassano il pH all’interno del batterio se vengono internati in esso.

L’Nramp invece ha la funzione di buttare all’esterno il Fe: il Fe infatti serve anche ai batteri e ci sono molti

batteri patogeni che accumulano molte quantità di Fe. Quindi la cellula butta fuori il Fe dall’endosoma o dal

lisosoma e lo fa sfruttando i protoni.

I batteri patogeni cercano di difendersi da questi processi: il batterio cerca di impedire la fusione con le

vescicole acide (penetrano all’interno delle cellule e bloccano la fusione del fagosoma, il pH rimane alto e si

crea un ambiente favorevole alla crescita dei batteri, sia per il pH sia perché il batterio sfrutta l’energia della

cellula); ci sono dei batteri che invece riescono a sopravvivere all’ambiente acido (possono anche arrivare al

lisosoma, ma in modo lento e così il lisosoma è neutralizzato); ci sono dei batteri che non appena il

fagosoma è penetrato nella cellula fuoriescono dal fagosoma e vanno nel citosoma, dove rimane (es: la

listeria, che rimane nel citosol e prolifera).

ADESIONE INTERCELLULAE E CELLULA-SUBSTRATO

L’adesione intercellulare è stata molto studiata negli anni 60-70-80 periodo in cui sono state individuate le

principali molecole di adesione. L’adesione è molto importante nello sviluppo embrionale: un’adesione

debole nelle prime fasi conduce alla nascita di gemelli monovulari. L’adesione non è solo un discorso di

“cemento”.

Adesione intercellulare e morfogenesi

Gli organismi pluricellulari hanno forme di adesione dinamica. È una conditio sine qua non affinché si

formino gli organismi pluricellulari: è una funzione strutturale senza la quale non si potrebbe avere

l’architettura dell’organismo. Ma anche una funzione morfogenica: attraverso l’adesione la cellula manda

segnali che servono per il mantenimento della forma e per regolare il differenziamento. È una trasmissione

di segnali da contatto. Entrambe le funzioni sono di tipo dinamico.

L’esempio di funzione strutturale è l’epitelio. Le cellule si moltiplicano fino a quando non entrano in

contatto tra di loro: quando si raggiunge la congruenza le cellule non proliferano più. Questo non accade

con le cellule cancerogene, che portano a un tumore. Nelle cellule tumorali si è persa la capacita di

controllare la proliferazione perché è diminuita l’adesione cellula-cellula. L’adesione intercellulare regola la

proliferazione e la morfogenesi. 77

Nelle prime fasi dello sviluppo embrionale si vede che alcune cellule sono molto aderenti tra di loro (

morula compatta), altre aderiscono molto meno bene; in queste prime fasi la forma di adesione non è

molto stabile. La formazione della morula compatta è dovuta alla aumentata sintesi della proteina caderina

E. Se si inibisce la sintesi della caderina non si forma la morula e l’embrione non riesce a sopravvivere la

caderina è essenziale. Ci sono delle cellule monostrato che danno origine al tubo neurale; questo si forma

perché queste cellule penetrano verso linterno, si richiudono e danno origine a un tubo. Questo processo è

dovuto sempre alla caderina E ma anche alla N-CAM; viene inoltre prodotta anche la caderina N. La sintesi

della caderina N e della N-CAM provoca la formazione del gruppo neurale. Le cellule della cresta neurale

grazie alla diminuzione della caderina E perdono l’adesività e si muovono, spostandosi in posizioni diverse;

acquisiscono poi di nuovo capacità adesiva e si aggregano in punti diversi dell’embrione.

Ci sono due forme di adesione in tutti gli organismi pluricellulari: dagli organismi più semplici (amebe) a

quelli più complessi sono presenti:

- Adesione omofilica ed eterofilica

o Omofilica: le proteine che regolano l’adesione sono le stesse a livello della membrana: sono

due proteine identiche che sono in grado di aderire l’una con l’altra

o Eterofilica: due proteine diverse che sono però complementari l’una con l’altra

- Calcio dipendete o indipendente

o Dipendente: hanno bisogno dl Ca e a volte anche del Mg

o Indipendente: le molecole di adesione non hanno bisogno del calcio

Le due molecole possono essere distinte attraverso l’EDTA: le dipendenti sono inibite da EDTA, le

indipendenti sono resistenti all’EDTA.

Tutte le cellule degli organismi pluricellulari hanno una forma di adesione Ca dipendete e indipendenti, così

come tutte hanno una forma di adesione omofilica e una eterofilica.

L’adesione è tessuto specifica, cioè cellule che appartengono a tessuti diversi aderiscono meno bene tra di

loro, perché hanno quantitativamente e qualitativamente proteine diverse. L’adesione ha anche una

funzione morfogenetica necessaria nella fase embrionale (in fase adulta ci si accorge di meno di questa

funzione, ma è presente, soprattutto nelle cellule tumorali). Nell’Alzheimer ci si è accorti che c’è una

diminuzione dell’adesione intercellulare tra le cellule nervose: questa ridotta adesività finisce per causare la

demenza (le cellule non riescono a scambiare i messaggi in modo efficace). L’adesione cellulare può essere

EDTA sensibile, cioè Ca dipendente (l’EDTA è una sostanza in grado di legare calcio, quindi se si aggiunge

EDTA alle cellule questa lega molecole di calcio nel liquido eliminando così gli ioni calcio, quindi le cellule

non sono più in grado di aderire); oppure può essere EDTA resitente, Ca indipendente.

L’adesione può essere omofilica se è mediata da due proteine di adesione che sono due copie della stessa

proteina: si possono avere due copie della stessa proteina presenti su membrane opposte. C’è

complementarietà nell’adesività, che però è dovuta al fatto che il sito di adesione è tale da poter fare

interagire con le due proteine. L’adesione può anche essere eterofilica se le due molecole che mediano

l’adesione sono diverse. Alla base di tutte le interazioni c’è sempre la interazione sterica tra molecole.

Principali famiglie di proteine di adesione cellula-cellula e cellula-matrice

La prima ad essere stata scoperta sono le proteine della famiglia CAM, comune a molti organismi. La

famiglia delle CAM si trova nelle amebe che vanno in contro di organismi pluricellulari, esprimendo cellule

di adesione sia della famiglia delle caderine sia della famiglia delle CAM.

Ci sono poi le selectine che sono le ultime in ordine di tempo nella scoperta. Sono presenti solo in una

famiglia particolare di cellule. Sempre nel caso delle selectine ci sono dei precursori, per esempio nelle

piante e negli organismi più semplici: questi precursori sono le lectine. 78

Ci sono poi le integrine, le quali mediano l’adesione cellula-cellula, ma in realtà la maggior parte di loro

media l’adesione cellula-matrice. Le caderine e le CAM invece mediano adesione cellula-cellula.

C’è anche la famiglia delle connessine.

Caderine

Dal punto di vista strutturale sono formate da dimeri a livello della membrana; i dimeri hanno una regione

citosolica e una regione rivolta verso l’esterno. Una caratteristica delle caderine è di avere un dominio

tipico: hanno una regione ovale ripetuta più volte. Legando ioni Ca permette a due monomeri di caderina

sulla stessa cellula di interagire tra di loro. Gli ioni Ca sono importanti perché permettono alle caderine di

assumere la forma corretta in modo da permettere a caderine poste su cellule opposte di interagire tra di

loro. Senza il Ca la loro forma tridimensionale non è corretta per l’interazione. L’interazione è a livello

dell’ultimo dominio. Tutte le proteine di questa famiglia sono glicoproteine, le quali richiedono la presenza

delle catene glicosidiche, inizialmente si pensava perché queste fossero direttamente coinvolte

nell’adesione, ma si è poi scoperto che in realtà la funzione degli zuccheri a livello delle proteine è quello di

proteggerle dall’attacco di proteasi esterne. L’adesione non sembra essere mediata dagli zuccheri, ma dagli

amminoacidi che fanno parte dalla struttura. La parte terminale delle caderine interagisce con caderine

diverse; il Ca è importante perché venga mantenuta la struttura tridimensionale efficacie per l’interazione

con il ligando. Tutte le interazioni sono sempre dinamiche: non è un’interazione di tipo covalente, ma

sterica relativamente stabile. La cellula può modulare questa interazione per esempio modificando i livelli

di Ca.

Le caderine hanno una regione citoplasmatica, importante perché l’adesione per essere più stabile richiede

l’interazione tra le proteine di membrana e il citoscheletro. Ci sono due tipi di interazione nella famiglia di

queste proteine:

- Caderine che interagiscono con il citoscheletro di actina tramite proteine associate all’actina, tra cui

le catenine α e β, le quali hanno una doppia funzione: da un lato permettono l’interazione tra la

caderina e l’actina (interagiscono da un lato con i filamenti di actina e dall’altro con la caderina),

dall’altro essa regola il ciclo cellulare, quindi regola la proliferazione cellulare. Questa forma di

adesione si trova nelle giunzioni aderenti

- Le caderine possono interagire anche con il citoscheletro dei filamenti intermedi: l’adesione è

mediata da proteine che si associano ai filamenti intermedi: sono le desmoplachine, le quali

interagiscono con proteine di membrana, che prendono nomi diversi perché fanno parte dei

desmosomi, ma in realtà sono parte della famiglia delle caderine. Come tutte le caderine esse

formano dimeri e aderiscono in modo omofilico e sono Ca dipendenti. Queste si trovano nei

desmosomi

La caderina è importante nelle fasi iniziali di sviluppo. La caderina E (che sta per epitelio) è presente

nell’uovo fecondato e media l’adesione tra i blastomeri nelle prime fasi dello sviluppo embrionale. La

caderina viene poi espressa in quantità maggiore man mano che le cellule si dividono. Quando c’è la

formazione della morula compatta, la caderina E viene iper-espressa e permette a queste cellule di aderire

in modo molto più stabile. Se questo processo non avviene l’embrione non è più in grado di svilupparsi. Se

nella fase di sviluppo si somministra EDTA si disassemblano i blastomeri. Viene poi espressa anche la

caderina N (che sta per neurale); la caderina E rimane espressa nelle cellule dell’ectoderma esterno;

quando si comincia a formare il tubo neurale una parte delle cellule esprime anche la caderina N. Viene

espressa anche la N-CAM quando le cellule entrano nello sviluppo del tubo neurale. Il tubo neurale nella

fase iniziale di sviluppo è il tessuto esterno che rientra. Una volta che si è formato il tubo neurale si

aggiunge EDTA e proteasi, così le cellule disaggregano e poi tornano di nuovo ad aderire tra di loro in modo

tessuto specifico; questo avviene perché le cellule che aderiscono con la N caderina aderiscono tra di loro e

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si separano da quelle che esprimono la caderina E. È quello che viene chiamato sorting out, cioè

separazione dei tessuti diversi. Questo dice che le capacità adesive che hanno formato il tubo neurale sono

diverse da quelle rimaste nell’ectoderma; questa diversità è data da cellule che fanno parte della stessa

famiglia ma mediano una adesione omofilica diversa. Se invece si hanno cellule che esprimono caderina E

ma in quantità diversa (per esempio abbiamo cellule di una fase tardiva della morula e cellule delle fasi

iniziali), avremo che le cellule saranno nello strato più esterno o più interno, ma non saranno

completamente separate. Ci sono tessuti che mantengono adesività e tessuti che invece si separano. È un

fenomeno che si riscontra anche nella fase adulta: se si prendono cellule del fegato e del cuore i due tipi

vanno in contro a fenomeni di separazione.

CAM

Hanno una struttura che riprende le Ig. Hanno domini ripetuti più volte, con dei ponti zolfo all’interno

(come gli anticorpi). I domini della fibronectina sono i più importanti per la proteina. La caratteristica delle

CAM rispetto alle caderine è che in certi casi hanno una regione citosolica, in altri casi invece sono legati

alla membrana tramite una coda lipidica (quindi in questo caso non hanno un dominio citoplasmatico).

Un’altra caratteristica è di essere proteine glicosilate, ma nel caso dei mammiferi le CAM posseggono in

quantità diversa l’acido sialico o acido neuroamminico, unico zucchero che ha una carica negativa. Tutti gli

zuccheri sono idrofilici perché hanno diversi gruppi OH, l’unico con carica negativa (ha un gruppo COOH) è

l’acido sialico. Le CAM sono presenti in particolare nel sistema nervoso; la prima ad essere stata scoperta è

stata la N-CAM: è presente nelle sinapsi, media l’adesione tra cellule nervose e cellule muscolari. La

famiglia delle L-CAM sono un misto di CAM diverse (si trovano in tessuti non neurali). L-1 è sempre una

CAM, ma è presente in una sottocategoria di cellule nervose. L’unica diversa è la I-CAM: pur essendo una

proteina della famiglia CAM media adesione eterofilica ed è coinvolta nella interazione tra cellule

endoteliali e cellule leucocitiche. L’ultima scoperta in ordine di tempo è la V-CAM, espressa nelle cellule

endoteliali.

Sono proteine sializzate. L’acido sialico è carico negativamente, quindi la sua presenza su N-CAM, le quali si

trovano su membrane opposte, può ridurre l’adesività: ci sono cariche negative che finiscono con l’opporsi

 non c’è interazione, ma repulsione. Proteine poli-sializzate nella parte più esterna (anche in questo caso

l’adesione è dovuta all’ultimo dominio) riducono la capacità adesiva. Uno dei meccanismi che la cellula

utilizza per ridurre l’adesività delle CAM è il grado di sializzaizone: una volta che si è formato il tubo neurale

ci sono alcune cellule nella parte più esterna del tubo neurale (cellule della cresta neurale) che si devono

staccare e migrare per formare i gangli periferici; queste cellule esprimono proteine e anche N-CAM;

aumentando il grado di sializzazione queste cellule aderiscono molto meno e quindi sono più mobili, si

muovono lungo la matrice cellulare e finiscono con l’aderire di nuovo tra di loro quando diminuisce il grado

di sializzaizone. Quando la sializzaiozne è più bassa le molecole di N-CAM aderiscono meglio tra di loro.

Può anche esserci un’espressione patologica di N-CAM: è espressa in cellule in cui non dovrebbe essere

presente e queste cellule divettano tumorali. Uno dei marcatori di certi tumori è diventato N-CAM (che ha

preso il nome di CD56). Si trova in certi mielomi, leucemia, tumori neuroendocrini ecc. Nella prima fase

tumorale c’è l’aumento della dimensione tumorale e le cellule quindi aderiscono tra di loro; la metastasi

avviene poi quando queste si separano.

Nei malati di Alzheimer c’è un’espressione ridotta di N-CAM: la degenerazione del tessuto nervoso è dovuta

al fatto che le cellule non aderiscono tra di loro. N-CAM è uno dei bersagli delle proteine βmieloide.

Selectine

Sono espresse nelle cellule endoteliali, nei neutrofili, nei leucociti. I leucociti normalmente non aderiscono

tra di loro: le selectine mediano una adesione eterofilica e Ca dipendente. Interagiscono quindi con altri tipi

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di proteine. Le selectine si trovano sulla membrana di leucociti o sulla membrana di cellule endoteliali

(cellule endoteliali che sono pareti dei vasi sanguigni).

Da un punto di vista strutturale sono proteine monopasso, hanno una regione citoplasmatica che permette

l’ancoraggio ai siti di actina. Nella parte intracellulare sono caratterizzati da domini ripetuti; il dominio in

alto è un dominio lectinico. Le lectine sono proteine che si trovano in molti organismi in particolare però nei

vegetali. Sono proteine che hanno la caratteristica di interagire con zuccheri. Tutte le lectine legano catene

glicosidiche e riconoscono un particolare zucchero (es la galectina riconosce il galattosio). L’ultimo dominio

quindi interagisce con zuccheri; nel caso delle selectine di mammifero questi zuccheri terminali sono acido

sialico o fucosio. Un leucocita che ha sulla membrana una selectina che riconosce il fucosio, il leucocita si

muove e migra (i leucociti tra di loro non aderiscono); muovendosi arriva in un punto dell’endotelio dove

sono presenti proteine particolarmente espresse ricche dello zucchero riconosciuto dalla selctina (es acido

sialico) il leucocita aderisce in quel punto, quindi si ferma. Qualunque tipo di associazione tra leucociti

ed endotelio è alla base del processo di extravasazione. Questo fenomeno è molto importante: quando c’è

infezione in un punto dell’organismo c’è accumulo di macrofagi e leucociti; alla base dell’infiammazione in

realtà c’è una risposta delle cellule che fanno parte del flusso sanguigno (leucociti) che si inseriscono nel

punto in cui è avvenuta l’infezione, perché la funzione, in particolare dei macrofagi, è quella di creare un

ambiente tossico per la sostanza che ha creato l’infiammazione. Le cellule che originariamente si trovano

nel flusso sanguigno devono attraversare l’endotelio che separa il flusso del sangue dai tessuti circostanti e

queste cellule devono accumularsi nei tessuti circostanti: le cellule sono in grado di attraversare la membra

del flusso sanguigno intercalandosi tra due cellule che fanno parte dell’endotelio. Nel tessuto sottostante

possono muoversi attirate da sostanze chemiotattiche (prodotte nel punto in cui è avvenuta l’infezione), in

modo tale da concentrarsi là dove è avvenuta l’infezione.

Connessine

Sono un tipo particolare di adesione: mediano la connessione tra cellule, ma soprattutto mediano la

connessione diretta tra tipo cellulari. Sono formati da complessi proteici. Ci sono una serie di monomeri che

danno origine a una sorta di canale a livello della membrana. La caratteristica delle connessine è che lo

stesso tipo di canale si forma sull’altra cellula così questo canale connette le due cellule diverse. In base alle

dimensioni del canale e in base alle dimensioni del poro ci possono essere delle molecole presenti in una

cellula che possono attraversare la membrana e finire nell’altra cellula. Questa è una forma di

comunicazione cellulare mediata da molecole che possono attraversare la membrana cellulare entrando

nei canali. Questi canali formati da connessine (nell’insieme questa struttura è chiamata il connessone)

possono essere attraversati da molecole con un peso molecolare minore di 1000 Dalton, quindi non solo

ioni, ma anche molecole che hanno dimensioni intorno a 1KD. Se si prendono due blastomeri e si inietta

una sostanza fluorescente, uno dei due blastomeri diventa fluorescente, l’altro non lo diventa; la stessa

cosa avviene fino a quando non si forma la morula questo dice che fino alla morula non ci sono

connessoni. Quando si passa allo stadio di gastrula si vede che la sostanza fluorescente si trasmette anche

ad altre cellule. La stessa cosa avviene nel tessuto nervoso; le cellule neurali hanno una serie di strutture

periferiche e queste a loro volta sono in comunicazione con altre cellule, scambiandosi molecole le une con

le altre. Se in un tessuto neuronale si inietta GFP (che ha un peso molecolare alto), essa diffonde in tutta la

cellula e mostra tutte le ramificazioni della cellula nervosa; non passerà da una cellula all’altra perché le

dimensioni sono moto alte. Se nella stessa cellula si inietta invece il Lucifer Yellow, che ha un peso minore,

esso mostra tutte le cellule, perché riesce a passare da una cellula all’altra, quindi la sostanza fluorescente

può diffondere attraverso i connessoni. Piccole molecole al di sotto di mille dalton possono essere

facilmente trasferite non tra due o tre cellule ma tra complessi di cellule che sono unite tra di loro. Le

connessioni mediate dalle connessine sono molto importanti soprattutto dal sistema nervoso, ma non solo

in questo. Questo fa capire anche come certe molecole molto piccole, come per esempio certe droghe, non

si limitino a raggiungere solo alcune zone del sistema nervoso ma diffondano oltre. 81

Integrine

Esse mediano una adesione in larga parte eterofilica, Ca dipendente; è un’adesione tra cellula e matrice

cellulare (solo poche mediano adesione tra cellule; nel fenomeno dell’extavaszione ci sono anche integrine

che mediano adesione con selectine, ma sono una minoranza).

Hanno la caratteristica dal punto di vista strutturale di essere formate da dimeri, ma questi dimeri sono

eterodimeri: si tratta di due proteine diverse che nell’insieme danno origine all’integrina (normalmente

un’integrina è format da un’α e una β). Si possono formare eterodimeri diversi, i quali hanno in comune il

fatto che la loro struttura, dal punto di vista extracellulare, richiede la presenza del calcio e il substrato con

cui devono interagire. In assenza di uno dei due non si forma un dimero funzionale; se invece sono presenti

è possibile la formazione di un dimero che può interagire con il ligando. La caratteristica dell’interazione

delle integrine con la matrice è dovuta al fatto che tutte le integrine riconoscono come ligando una

sequenza tripetidica R-G-D (asparagina-glicina-aspartico), sequenza presente in proteine diverse che

posseggono più gruppi RGD e quindi possono interagire con l’integrina; a loro volta le integrine, a seconda

dei livelli di α e β, hanno maggior affinità per una proteina piuttosto che per un’altra (α e β riconoscono

RGD ma riconoscono anche la struttura intorno al dominio). Il dominio delle proteine rimane RGD. Oltre

all’RGD c’è anche l’interazione con altri elementi di proteine esterne che specificano quale tipo di integrina

interagisce con quale tipo di proteina della matrice.

Dal punto di vista citoplasmatico, le integrine hanno interazione con il citoscheletro di actina tramite

proteine associate all’actina, di cui la più nota è la talina. Una caratteristica dell’interazione tra talina e

citoscheletro è che ha interazione anche con segnali che a loro volta stimolano chinasi intracellulari. Una

delle interazioni che possono dare origine a interazioni intracellulari sono interazioni meccaniche (come le

integrine). DUPLICAZIONE CELULARE E CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE

Molti studi sono stati svolti sul lievito.

Duplicazione cellulare = le cellule si dividono, crescono, vanno in contro a una divisione cellulare, la quale

vuol dire duplicazione dei cromosomi, mitosi, separazione dei cromosomi, riformazione dei due nuclei e poi

separazione vera e propria della cellula. Nel caso delle nostre cellule e in generale dei mammiferi si ha una

duplicazione in circa 24 h. Cellule differenziate non sono più in grado di dividersi.

La duplicazione cellulare è un ciclo che si ripete e che è caratterizzato da una fase che è la mitosi

propriamente detta. Nel ciclo cellulare, le uniche cose che si vedono bene sono la mitosi e la divisione della

cellula. Il resto, dal punto di vista morfologico, non si riesce ad osservare. Tra due mitosi avvengono una

serie di processi: le cellule dopo essersi divise, vanno in contro a crescita (infatti dopo essersi divise le

cellule sono più piccole), quindi si ingrandiscono anche i compartimenti e sono presenti anche dei processi

che riguardano la preparazione alla successiva divisione cellulare. Perché la cellula possa andare in contro a

mitosi è necessario che il DNA si sia duplicato: durante l’interfase (fase tra due mitosi), anche se

visibilmente non avviene nulla, c’è un processo di preparazione, in cui il momento più importante è la

duplicazione del DNA. Questo avviene come preparazione alla fine della divisione cellulare, nella fase G1

dell’interfase; prosegue poi nella fase S (duplicazione del DNA); prosegue nella fase G2, dopo la quale si

entra nella fase M, fase della mitosi vera e propria. Nel ciclo abbiamo due fasi G (gap = intervallo), durante

le quali apparentemente non avviene nulla, ma in realtà nella fase G1 la cellula si prepara alla duplicazione

del DNA, mentre nella fase G2 la cellula si prepara per entrare in mitosi. Queste due fasi sono le più lunghe

all’interno del ciclo. La fase S è breve e varia a seconda del tipo cellulare (quelle che hanno un DNA più

grande impiegheranno più tempo, ma non è comunque lunga); anche la mitosi non è particolarmente

lunga. Le fasi G sono variabili: la loro durata dipende da fattori esterni (presenza o meno di sostanze

nutritive, fattori di crescita) e interni (la cellula ha messo in piedi dei meccanismi di controllo che regolano

82

la durata del ciclo: è un controllo di qualità se c’è qualcosa che non funziona rallenta il ciclo, per esempio

se ci sono dei danni al DNA è necessario che venga riparato prima che si duplichi; una volta che la

duplicazione del DNA è iniziata prosegue e per questo è importante che il controllo sia fatto prima. Stesso

discorso vale per quando la cellula deve iniziare la mitosi: è importante che ci siano dei controlli prima che

questa inizi).

La divisione cellulare e la duplicazione riguarda tutti i compartimenti della cellula, non solo del DNA.

Quando la cellula inizia ad entrare in mitosi, il reticolo endoplasmatico si distribuisce tutto intorno al nucleo

e finisce con l’essere diviso in parti uguali nelle cellule figlie (vedere lavoro “Jongsma et al, 2014, trends cell

biol, doi 10.1016). Anche il Golgi si duplica: esso si frammenta in piccole vescicole prima di entrare in

mitosi, vescicole che poi fondono e si dividono durante la mitosi. Stesso discorso per i mitocondri, i quali

hanno un proprio DNA: i mitocondri sanno regolare in modo quasi autonomo la loro duplicazione; ci sono

dei meccanismi che comunque suggeriscono che la loro duplicazione sia sincronizzata con quella del

nucleo; anche in questo caso i mitocondri si distribuiscono intorno al nucleo, dividendosi anch’essi nelle

cellule figlie.

Quando i cromosomi condensano, la duplicazione è già avvenuta (nella fase S): in profase, con la

condensazione dei cromosomi, si sa che ogni cromosoma contiene una copia di sè stesso, quindi si parla di

cromatidi fratelli che sono associati insieme. Questo processo prosegue fino alla metafase. All’inizio

dell’anafase iniziano a dividersi i cromatidi fratelli. La meiosi, da questo punto di vista, non differisce dalla

mitosi (differisce dal fatto che c’è una doppia divisione: una duplicazione del DNA + 2 divisioni). Quando

avviene la condensazione dei cromosomi, i cromosomi a loro volta dovranno posizionarsi sulla piastra

cromosomica e questo prevede un’organizzazione del citoscheletro: i microtubuli formano il fuso mitotico

nelle cellule che hanno i centrioli (non tutti li hanno, ma tutte hanno il centro organizzatore dei

microtubuli), quando la cellula entra in mitosi, in corrispondenza della duplicazione del DNA si ha una

duplicazione dei centrioli: i centrioli si duplicano ed essi sono contenuti nei centri organizzatori dei

microtubuli, i quali danno origine alla organizzazione dei microtubuli stessi che servono per la formazione

del fuso mitotico. Nelle cellule che non hanno i centrioli, i centri dell’organizzatore dei microtubuli possono

comunque dare origine al fuso mitotico. C’è quindi sempre la duplicazione dei centri di organizzazione dei

microtubuli e la formazione del fuso mitotico. Inizialmente i microtubuli sono distribuiti lungo la cellula, poi

gli stessi microtubuli vengono depolimerizzati e la tubulina che si è liberata da questa depolimerizzazione

va a formare il fuso mitotico. Ci sono quindi due processi importanti: duplicazione del DNA e del centro

organizzatore dei microtubuli, processi che vanno in parallelo e che controllano la mitosi.

Mitosi: cromosomi e microtubuli

Il trascinamento dei cromosomi nelle cellule figlie non è dovuto alla contrazione del fuso mitotico. La

drosophila è caratterizzata dal fatto che durante la duplicazione del nucleo non c’è duplicazione della

cellula: ad un certo punto si avranno quasi un migliaio di nuclei all’interno della stessa cellula iniziale.

Poiché tutti i nuclei si trovano all’interno dell’ambiente citoplasmatico, i segnali che regolano questa

duplicazione possono influenzare tutti i nuclei. La duplicazione dei nuclei è quindi sincronizzata. Ci sono dei

meccanismi che regolano la formazione del fuso mitotico e ci sono dei meccanismi che regolano la

condensazione e la segregazione dei cromosomi alle estremità del fuso: questi processi devono essere

coordinati.

Ogni coppia di cromatidi ha il centromero, regione dove due cromosomi sono uniti tra di loro (sono uniti da

proteine chiamate coesine, che sono come proteine di adesione che tengono uniti i cromosomi durante

questa fase). Sempre a livello del centromero ci sono anche delle proteine che servono per collegare i

cromosomi al fuso mitotico: i microtubuli del fuso mitotico si legano sempre in questa regione, dove sono

presenti delle proteine che collegano i cromosomi ai microtubuli del fuso. Quando si parla del centromero

si parla di una regione del DNA che fa parte integrante del cromosoma. Le proteine che fanno parte del 83

centromero e che mediano l’adesione al fuso mitotico sono proteine del cinetocore. Quindi il centromero è

la regione del cromosoma a cui aderiscono le proteine del cinetocore, alle quali si legano poi ai microtubuli.

I centri organizzatori dei microtubuli da cui si dipartono i filamenti che fanno parte del fuso mitotico sono ai

poli. Alcuni di questi microtubuli si legano al cinetocore, altri sono liberi. I microtubuli crescono al polo

positivo, quindi se ai capi + c’è polimerizzazione la tubulina cresce e i microtubuli si allungano. Tra un

microtubulo e l’altro ci sono delle proteine che fanno da ponte, permettendo ai microtubuli di

polimerizzare e tenendo uniti i cromosomi tra loro. Nel momento in cui i microtubuli si sono legati al

centromero, lì non c’è più crescita: i microtubuli hanno aderito a proteine che fanno parte del centromero e

non c’è più spazio per nuovi dimeri di tubulina per potersi integrare in quel punto. Ma visito che ci sono dei

microtubuli con un capo libero, questo si può allungare, quindi il fuso può crescere. Quando i cromosomi si

separano vengono SOLO APPARENTEMENTE trascinati verso la periferia: in realtà, poiché al polo positivo i

microtubuli possono anche depolimerizzare, si accorciano (non si contraggono); depolimerizzano, NON si

staccano dai cromosomi, perché a questo capo ci sono chinesine e dineine che giocano un ruolo

importante: esse fanno da ponte e il microtubulo in sé non aderisce direttamente al cinetocore

aderiscono chinesine e dineine, le quali da un lato si legano al microtubulo, dall’altro si legano al

cinetocore. Nel momento in cui il microtubulo comincia a depolimerizzare le chinesine si possono muovere

lungo il microtubulo. Quindi le chinesine si spostano e trascinano con sé il cromosoma. Il trascinamento

NON è dovuto a un fenomeno di contrazione, ma a un fenomeno di depolimerizzazione dei microtubuli.

Questo è un processo che deve essere altamente regolato: se alcuni microtubuli depolimerizzano e altri no,

allora questa separazione così precisa non potrebbe avvenire ci deve essere un meccanismo di

regolazione che riguarda tutto quello che avviene a livello del fuso mitotico. Quando i cromosomi vanno in

contro a condensazione ci deve essere contemporaneamente anche la formazione del fuso mitotico, del

cinetocore e il legame tra i due; quando avviene la separazione le proteine che legano microtubuli e

cromosomi devono sparire. È quindi alta la necessità di meccanismi di regolazione che regolano più

processi che di per sé sono l’uno indipendente dall’altro.

La mitosi finisce con il dare origine a due nuovi nuclei all’interno di una stessa cellula: si è duplicato il

nucleo, ma non si è ancora duplicata la cellula. Alla fine della mitosi ci deve essere la separazione delle due

cellule figlie. Se non avviene la cellula finisce con l’avere più nuclei (condizione di poliploidia). La

duplicazione della cellula richiede anch’esso il contributo del citoscheletro, ma di quello formato da actina,

non da microtubuli. L’actina, insieme alla miosina, permette un fenomeno di contrazione: le due danno

origine a miofibrile che permettono alla cellula di contrarsi nel centro, fino a separare le due cellule figlie. Ci

sono ancora i microtubuli, che hanno questa volta un ruolo secondario: sono alla periferia della cellula e

fanno sì che la cellula aderisca al substrato e che parte della cellula tenda ad andare verso la periferia, ma

questo non è essenziale, in quanto cellule in sospensione non aderenti possono anch’esse andare in contro

a divisione. Il punto cruciale è la formazione dell’anello di contrazione di actina e miosina. Il meccanismo

che regola l’actina e la miosina si rifà alle proteine della famiglia Rho: essere regolano formina e ARP2,3 che

portano alla formazione di actina e all’attivazione di una chinasi che regola la fosforilazione della catena

leggera della miosina II in modo che questa possa interagire con l’actina per formare così miofibrille.

Il ciclo DEVE essere regolato: i processi devono avvenire in contemporanea e se così non è il patrimonio

cromosomico non può essere separato in modo eguale. Ci sono una serie di check-points che servono per

controllare che il processo vada bene. Prima che avvenga la mitosi la cellula controlla se il DNA è

danneggiato o se è duplicato bene. Dopo la mitosi la cellula figlia va di nuovo in contro a divisione cellulare

e prima della duplicazione c’è un altro controllo. La fase G1 può anche diventare G0: la cellula decide di

uscire dal ciclo e allora ha tre alternative:

- Differenziare

- Ripensarci ed entrare in G1 84

- Apoptosi

Se invece continua in G1 controlla se ci sono dei danni al DNA e se ci sono è necessario ripararli prima che il

DNA si duplichi: prima di entrare in fase S, se il DNA è danneggiato cerca di ripararlo. Se il meccanismo di

controllo dà l’ok allora si procede con la fase S, durante la quale non ci sono meccanismi di controllo. Una

volta finita la duplicazione c’è di nuovo un check-point per controllare eventuali danni avvenuti durante la

duplicazione del DNA. Alcuni dei meccanismi attivi in G1 sono attivi anche in G2. Anche nella mitosi c’è un

controllo: i cromosomi fratelli devono essere allineati in maniera corretta. Se ci sono tutti questi controlli ci

devono essere anche meccanismi attraverso cui la cellula darà delle risposte.

Per capire il controllo del ciclo sono stati fondamentali due esperimenti

- Uova di rana, le quali sono abbastanza grandi (quasi 1 cm). Questo uovo va in contro, durante la

fase di maturazione, alla meiosi. Dopo la prima divisione meiotica le cellule di rana, non entrano

subito nella seconda divisione meiotica. Alla fine della prima divisione vanno in contro alla G2, ma

poi si bloccano (e in parte questo succede anche nei mammiferi). La seconda divisione meiotica può

avvenire o perché ci sono dei segnali esterni (come il progesterone) che la inducono, oppure in certi

casi c’è un segnale di fecondazione: segnali di membrana scatenano la seconda divisione meiotica

prima che il pronucleo dell’uovo e il pronucleo dello spermatozoo si fondano insieme. Si possono

quindi avere delle uova di rana che possono essere quasi pronti per entrare nella seconda divisione

prima della seconda divisione e alla fine della G2. Se c’è qualche proteine che regola la mitosi,

questa proteine si potrebbe accumulare durante l‘interfase, aumentare durante la fase G2 e

sempre questa proteine potrebbe essere quella che fa entrare la cellula in mitosi. Si può vedere

come questa proteina che si accumula nel citoplasma sia anche responsabile del fatto che il nucleo

vada in contro a meiosi: si può iniettare il nucleo dello spermatozoo nel citoplasma dell’uovo di

rana e si osserva come, se c’è un ambiente favorevole, il nucleo dello spermatozoo potrebbe ora

andare in contro a duplicazione, nel senso che si forma il fuso mitotico e il DNA condensato. Se si

prende il citoplasma di uovo già in fase avanzata di G2, si vede che si forma il fuso mitotico, che i

cromosomi condensano e che si ha una separazione dei due nuclei. Se invece il citoplasma che si

prende è in una fase molto inferiore rispetto alla G2 allora si vede che non c’è nessuno dei processi

di mitosi

- Oocita fermo in G2. Se si dà progesterone avviene divisione, così come avviene se si inietta

citoplasma preso da altre uova che stanno per entrare in mitosi; se invece si inietta citoplasma che

non stanno per entrare in mitosi, la mitosi non avviene

C’è quindi qualche proteina che è stata sintetizzata che regola l’entrata in mitosi. Per individuarle si prende

il citoplasma, lo si fraziona e si esaminano tutte le proteine e i fattori presenti in esso. Questi fattori sono

stati chiamati MPF (fattore che promuove la mitosi). Un’analisi più dettagliata di questo fattore ha

dimostrato che l’MPF aumenta durante il ciclo cellulare. Durante l’interfase e fino all’inizio della fase S,

questo fattore è presente nel citoplasma e sembra essere regolato in proporzione alla fase del ciclo: è

massimo all’inizio della mitosi e minimo alla fine della mitosi. Inoltre questo fattore non è composto da una

singola proteina, ma è un complesso di minimo due proteine, di cui solo una è regolata in maniera ciclica e

per questo è stata chiamata ciclina B. L’altra proteina che fa parte dell’MPF è una chinasi ed è inattiva se

non è legata alla ciclina, cioè è ciclina-dipendente e perciò è anch’essa regolata dal ciclo. La chinasi regola la

mitosi. Alla fine della mitosi la ciclina (solo lei, non il complesso) viene ubiquitinata, quindi distrutta nei

proteasomi e deve quindi essere sintetizzata di nuovo. Gli ulteriori studi hanno dimostrato una regolazione

più fine che è formata da tre momenti:

- Fosforilazione della chinasi: prima si deve formare il complesso ciclina-chinasi. Una volta formato la

chinasi viene fosforilata da un’altra chinasi (CAK), la quale fosforila la CDK in due punti diversi

(questo vale per il lievito come per i mammiferi) 85

- Una fosfatasi defosforila la stessa CDK1 (in un solo punto) e il fattore attivo è quindi un complesso

che è parzialmente fosforilato e questo controlla la mitosi solo in questo momento è attiva (con

un solo sito fosforilato) 

- Ubiquitinazione della ciclina chinasi inattiva

C’è una secondo livello di regolazione dato da proteine che prendono il nome di CKI: sono piccole proteine

che hanno la caratteristica di legarsi al complesso attivo, ma nel momento in cui si legano inibiscono il

complesso. Fosforilazione e defosforazione sono essenziali perché la ciclina CDK sia attiva, ma nonostante

sia attiva potrebbe essere inibita dalla CKI. Questo è il meccanismo di regolazione ma non dice quali sono i

substrati che vengono regolati. L’MPF è quindi una chinasi che può essere attivata da fosforilazione e che

può a sua volta fosforilare creando una cascata di reazioni a valle: l’MPF fosforila la lamina nucleare,

proteina all’interno del citoscheletro dentro al nucleo che permette la stabilizzazione della membrana

nucleare, quindi se viene fosforilata la membrana sparisce regolando la lamina nucleare c’è la

frammentazione della membrana nucleare in vescicole. Lo stesso MPF fosforila l’istone H1 e le condensine,

i quali fanno da ponte tra i vari nucleosomi e per poter permettere ai nucleosomi di essere condensati deve

 

essere fosforilato MPF fosforila cromosomi condensano. Le condensine facilitano il processo di

condensazione, le coesine facilitano l’adesione dei cromatidi fratelli sempre controllato da MPF. La

chinasi ha anche un altro substrato, la pericentrina, che è uno dei complessi γturc: essa facilita la

polimerizzazione dei microtubuli se viene fosforilata essa facilita la formazione del fuso mitotico. Queste

tre attività regolano la mitosi in modo coordinato (avvengono in contemporanea); quando inizia la mitosi

sparisce la membrana nucleare, si forma il fuso mitotico e si condensano i cromosomi a partire da una

stessa chinasi la cellula regola tutto il processo della mitosi. Sempre la MPF fosforila (un po’ più avanti nel

tempo) un’altra proteina, la APC/C: essa permette la separazione dei cromatidi nella transizione metafase-

anafase e distrugge la ciclina mitotica una volta fosforilata degrada la ciclina e quindi disattiva il sistema,

dall’altra parte permette la separazione dei cromatidi i cromosomi sono tenuti insieme da coesine, quindi

per essere separati le coesine devono essere distrutte APC/C agisce a livello di una securina che blocca la

separasi APC/C ubiquitina la securina, che si stacca dalle separasi, che agisce sulle coesine e le distrugge.

In sintesi possiamo affermare che L’MPF regola mitosi e sé stessa attraverso l’APC/C.

Regolazione della mitosi

La CDK 1 regola la mitosi, ma per essere attiva deve essere complessata con una ciclina, sintetizzata

durante l’interfase in modo lento: aumenta nella fase che precede la mitosi, all’inizio della mitosi è ad alti

livelli e man mano che la ciclina si complessa con la CDK 1 il complesso è potenzialmente attivo: per esserlo

del tutto la CDK deve essere fosforilata. La fosforilazione avviene in punti diversi della CDK: c’è una

fosforilazione in un sito che la attiva e in un altro sito che la inibisce. La funzione inibitrice viene eliminata

per azione di una fosfatasi e quando ciò avviene il complesso è attivo e di fatto regola la mitosi, in quanto

questa chinasi è ora in grado di fosforilare substrati che a loro volta regolano i vari substrati della mitosi.

Quando la lamina è fosforilata depolimerizza e così scompare la membrana nucleare; permette inoltre la

condensazione dei cromosomi (fosforila H1) e la formazione del fuso mitotico (fosforila la pericentrina).

Infine viene fosforilata l’APC/C, la quale regola la separazione dei cromosomi alle due estremità del fuso e

la stessa MPF, ubiquitinando la ciclina che viene così distrutta. L’APC/C ha la caratteristica di ubiquitinare:

ubiquitina la ciclina, le condensine e le coesine che tengono uniti i cromosomi. Una volta scoperto questo

complesso che regola la mitosi e capito che c’è la regolazione tramite la ciclina, si è capito che anche le altre

fasi del ciclo sono regolate da cicline: questo ha portato alla scoperta di una serie di cicline (inizialmente nel

lievito). La Cdc28 del lievito è la chinasi che corrisponde alla CDK1 nei mammiferi; in base al tipo di cicline

che si legano a queste chinasi viene regolata una fase del ciclo piuttosto che un’altra (questo nel lievito).

Nei mammiferi sono diverse anche le chinasi, non solo le cicline: la CDK4 e la 6 regolano la G1, la 2 regola la

fase S, la CDK 1 la G2 e la mitosi. Ci sono quindi chinasi e cicline diverse, cicline che vanno in contro a sintesi

e poi a degradazione rapida per ubiquitinazione. Nella fase G1 c’è la ciclina D che si complessa con la CDK4;

86

nella fase S inizialmente la CDK2 si complessa con la ciclina E e poi con la ciclina A, ciclina che inizialmente si

complessa con la CDK1 nella fase G2 e poi la CDK1 si complessa con la ciclina B nella mitosi chinasi

diverse e cicline diverse regolate in modo molto preciso.

Nella fase G1 le cellule tornano a crescere (fase di crescita cellulare); in questa fase la cellula può decidere

di uscire dal ciclo (punto G0). I segnali che regolano questa decisione da un lato sono fattori di crescita

(devono essere presenti se deve rimanere nel ciclo) e fattori che facilitano il differenziamento cellulare;

questi ultimi, se prendono il sopravvento, permettono alla cellula di uscire dal ciclo e differenziare, quindi

non si divide più. Il G0 può essere una fase intermedia: la cellula può restare per un periodo illimitato di

tempo oppure può essere una fase intermedia. Se la cellula decide di restare nel ciclo allora deve capire se

il proprio DNA abbia subito dei danni: il DNA subisce danni regolarmente, è esposto a diversi rischi che

possono essere di natura esterna o interna. Ci sono molti meccanismi che permettono il riconoscimento di

questi errori. La cellula deve riparare il DNA e deve essere messa in condizioni di ripararlo. Se il DNA non

viene riparato, quando avviene la fase S il danno diventa permanente e si trasmette alle cellule figlie.

La funzione delle CDK4 e 6 è quella di preparare la cellula per entrare nella fase S: vengono attivati fattori di

trascrizione che servono alla sintesi dei geni per la ciclina E tramite l’azione della CDK 4, che anche per la

funzione di attivare alcune subunità della DNA polimerasi (la quale deve essere assemblata con tutte le

subunità) e della DNA ligasi; vengono quindi preparati gli enzimi che servono per la sintesi della DNA ad

opera della CDK 4 e 6. La CDK 6 ha la capacità di fosforilare le CKI. Le CDK sono regolate dall’interazione con

le proteine CKI, dove I sta per inibitorie: sono proteine dal peso molecolare basso che si possono legare alla

ciclina CDK; la ciclina-CDK potrebbe essere attiva, ma se si complessa con un CKI allora è di nuovo inattiva: è

un secondo freno che regola le CDK. La fosforilazione delle CKI ha come effetto che le CKI possono essere

fosforilate e quindi ubiquitinate da SCF, quindi non inibiscono più la CDK e la cellula può entrare nella fase

S. Se c’è un danno al DNA la cellula rallenta l’entrata nella fase S prolungando la G1.

Nela fase S è attiva la CDK 2, legata la ciclina E. Nel momento in cui il DNA comincia ad essere duplicato la

duplicazione continua, non può esserci blocco della duplicazione (per questo è importante la correzione

degli errori prima dell’entrata in fare S). Nella fase G2 ci sono anche dei meccanismi di controllo che sono

però meno chiari dal punto di vista di studio: può esserci la CKI21 che rallenta l’entrata nella fase M, ma si

conosce meno bene.

I fattori di crescita agiscono a livello di recettori con domini transmembrana, come le tirosine chinasi di

membrana che nei mammiferi sono le più importanti. Queste interagiscono con i fattori di crescita che

controllano la crescita e la duplicazione cellulare.

Perché la cellula possa crescere è necessario che ci siano sostanza nutritive: amminoacidi, glucosio. I fattori

di crescita non sono coinvolti nel controllare la quantità di queste sostanze, perché queste ci devono essere

indipendentemente dai fattori di crescita. Se si è in una fase di digiuno la crescita è rallentata anche se si

aggiungono fattori di crescita. Cruciale nel controllo della crescita è una chinasi che si chiama TOR, di cui

esistono due complessi, 1 e 2. TOR è una chinasi che interagisce con almeno 4 subunità diverse: il

complesso TOR 1 chinasi è regolato dalle sostanze nutritive, in particolare dagli amminoacidi, che entrano

nella cellula e attivano questo complesso, così come lo attiva la presenza di O e di ATP. TOR, attivata a sua

volta, fosforila dei fosfati, i quali servono per la crescita, in quanto sono substrati coinvolti nella sintesi dei

lipidi, substrati coinvolti nella crescita dei mitocondri, substrati coinvolti nella crescita in generala (ATP,

proteine ecc). Anche i fattori di crescita controllano TOR, in quanto interagendo con i recettori di

membrana, tra cui i recettori tirosina-chinasi e l’autofosforilazione di questi recettori porta all’attivazione

della PI3K, la quale provoca la formazione di fosfo-inositidi di membrana fosforilati, PI3,4,5P, i quali

provocano l’attivazione di un’altra chinasi, la PKB che fosforila a sua volta TOR. Ci sono quindi due

meccanismi di controllo: presenza di amminoacidi, O ecc e la fosforilazione tramite la PKB regolata dalla

PI3K. I fattori di crescita, oltre a regolare la crescita in senso stretto, regolano anche la duplicazione tramite

87

la via Ras: gli stessi recettori di membrana che interagiscono con i fattori di crescita, agendo su Ras attivano

la sua via di trasduzione che comporta l’attivazione delle MAP chinasi, fino ad arrivare al controllo

dell’espressione genica che ha due livelli:

- Primo livello: risposta immediata al fattore di crescita extra cellulare: provoca la sintesi di fattori di

trascrizione, i quali si legano al DNA e portano alla sintesi di altri fattori di trascrizione: i primi

fattori di trascrizione sono fosforilati dalle MAP chinasi, si legano al DNA, dove attivano dei geni che

sono a loro volta dei fattori di trascrizione. Questi fattori di trascrizione sono tutti dei proto-

oncogeni e regolano a loro volta altri geni. Tra i geni regolati ci sono anche delle cicline, tra cui la D,

che deve essere sintetizzata e perché lo sia c’è bisogno che l’mRNA venga trascritto la ciclina D si

lega a CDK4 uno dei substrati a valle di CDK4 è la proteina Rb, che se mutata provoca il

retinobalstoma. Rb normalmente è associata a un fattore E2F necessario per la sintesi dell’mRNA

- Secondo livello: Distacco Rb. Il complesso Rb-E2F è normalmente inattivo, quindi il controllo di

trascrizione è basso; ma quado RB è fosforilato dal complesso ciclina D e CDK 4 si stacca e la

trascrizione può avvenire ad un alto livello. Tra i geni che vengono trascritti ci sono anche la ciclina

E, la A e la CDK necessaria nella fase S. Il controllo della duplicazione a partire dai fattori di crescita

regola l’entrata in fase S. Se la proliferazione cellulare non è regolata subentra il tumore

Controllo degli errori del ciclo

La proteina P53 viene attivata ogni volta che si presenta un danno a livello del DNA. La rottura del DNA, che

può essere una rottura in uno dei due filamenti o in entrambi, sono processi che avvengono spesso, in

quanto ci sono diversi fattori che possono provocare questa rottura. L’esposizione a sostanze metalliche

che insieme all’O possono provocare radicali dell’O possono provocare la rottura del DNA, anche se

l’esposizione è di pochissimi minuti. Questi danni però vengono riparati. Danni al DNA attivano proteina

ATM e ATR che attivano altre chinasi che fosforilano la p53, proteina cruciale a livello di mammiferi: è

molto importante, in quanto è un soppressore di tumori; mutazioni in p53 sono correlate a diversi tipi di

cancro e nel 50% dei tumori umani p53 è mutato. Non basta una mutazione a p53, ma se c’è un tumore è

molto probabile che p53 sia mutato, in quanto essa regola la riparazione del DNA e se non funziona allora si

possono accumulare più danni a livello del DNA il tumore viene causato dall’accumulo di altre mutazioni,

accumulo facilitato dal mancato funzionamento di p53. Quando p53 è attiva agisce a diversi livelli, in

particolare regolando p21: essa è una CKI che regola l’entrata nelle diverse fasi del ciclo. P21 attivata blocca

il complesso CDK4-CDK6, cioè il complesso CDK necessario per l’entrata in fase S, e blocca anche il

complesso CDK1 - ciclina A. La p53 è un fattore di trascrizione sintetizzato sempre dalla cellula, ma p53 è

anche facilmente ubiquitinata perché si lega al fattore MDM2 che appunto ne facilita l’ubiquitinazione,

quindi il livello di p53 è mantenuto basso. Quando c’è un danno al DNA c’è una chinasi che fosforila p53, ma

questa fosforilazione provoca il distacco da MDM2, quindi p53 non viene ubiquitinata e può agire come

fattore di trascrizione dando gli effetti a valle. Il livello di p53 è regolato dal danno: se c’è danno non viene

degradata. Quando p53 è attiva blocca il ciclo cellulare, la glicolisi (il recettore per il glucosio viene bloccato

poiché ne diminuisce la presenza), il metabolismo dei lipidi, l’attivazione di geni anti ossidanti; regola

inoltre il metabolismo di nucleotidi e la trascrizione sostanzialmente: p53 agisce su processi a valle che

servono per bloccare la duplicazione del DNA.

Nel caso dei mammiferi c’è un solo gene che codifica per p53. Se p53 presenta mutazioni puntiformi essa è

inattiva (se non è trascritta non c’è vita). Se c’è mutazione in un allele, questa mutazione porta all’eluizione

dell’altro allele, quindi si rimane con un unico allele mutato (questo causa una sindrome estrema). Anche se

è mutata, p53 lega le stesse proteine di quando è attiva ma queste proteine legate assumono una funzione

diversa: se il recettore del glucosio è diminuito quando p53 è sana e attiva, nella forma mutata il numero di

recettori di Glut1 viene aumentato, quindi si hanno più recettori espressi in membrana e lo stesso avviene

88

con le reazioni che erano prima inibitorie. Viene dunque a mancare il suo effetto regolatorio (vedi lavoro

“Haupt et al, 2016, Front. Oncol. 6,12”).

Uno dei processi che vengono regolati dalla p53 è l’apoptosi. Quando la cellula ha un danno al DNA, p53

attiva rallenta tutti i processi che servono per la sintesi del DNA e permette la riparazione del danno. Ma se

il danno non riesce ad essere riparato allora p53 induce l’apoptosi nella cellula. Questa è un’altra risposta

dell’organismo al danno. Questo avviene perché p53 da un lato facilita la trascrizione di alcuni geni che

sono apoptotici, geni chiamati BUGS, e dall’altro ha una funzione più diretta: lega proteine PCL2. Mentre le

BUGS facilitano l’apoptosi, le PCL2 sono antiapoptotiche: se le PCL2 sono superiori allora la cellula non va in

apoptosi, se invece prevale BUGS la cellula va in apoptosi. La BUGS si trova nella membrana esterna del

mitocondrio e più proteine BUGS creano dei pori a livello della membrana facendo sì che Ca e altri fattori,

tra cui il citocromo C, entrino nei mitocondri, il che scatena una serie di reazioni che danno origine

all’apoptosi. I livelli di BUGS sono tenuti bassi da PCL2, ma se p53 lega PCL2 allora favorisce la formazione di

complessi BUGS favorendo appunto l’apoptosi. Quindi da un lato la p53 favorisce la trascrizione delle BUGS

e dall’altro lega la PCL2.

Man mano che si invecchia è più facile andare in contro a mutazioni e sviluppare tumori. Il paradosso di

Peto afferma che “il rischio di cancro non aumenta tra specie diverse con l’incremento del numero di

cellule somatiche o della durata della vita”: più un animale è grande più ci sono proliferazioni. Per esempio

gli elefanti sono tra i mammiferi più longevi e hanno una mortalità infima per cancro (4%), questo perché il

genoma di elefante contiene 20 copie di geni per p53, quindi anche se c’è una mutazione in un gene ce ne

sono molti altri che neutralizzano questo effetto.

LA MORTE CELLULARE

L’apoptosi è definita come morte cellulare programmata e quindi fisiologica, diversa dalla morte cellulare

accidentale chiamata necrosi. La necrosi è accidentale, avviene per dei traumi forti, con lisi immediata e

conseguente fuoriuscita di tutto ciò che nella cellula nell’ambiente extra cellulare; la morte fisiologica è

invece dovuta a una risposta interna della cellula che a seguito di particolari segnali induce lisi cellulare, che

in questo caso è ultimo passaggio e non è lisi vera e propria, ma avviene una formazione di vescicole.

queste vescicole contengono materiale intracellulare, quindi non innescano una risposta immunologia

come nella necrosi. Una terza forma di morte cellulare è la necroptosi: è una forma di evento necrotico,

quindi la cellula si lisa, ma è programmata.

Differenze:

Apoptosi Necrosi

la membrana non si rompe, si ha condensazione l’acqua entra all’interno, c’è rigonfiamento e

cellulare, quindi tutti i compartimenti all’interno conseguente lisi; i compartimenti in questo caso

della cellula possono collassare all’interno, ma rimangono intatti e questo permette di distinguere

senza lisi le due forme

Il DNA condensa, ma non come nella normale

condensazione: il DNA collassa come tutti gli altri

compartimenti

processo attivo che mette in azione una sorta di Non ci sono proteine ad hoc; al massimo possono

suicidio; ci sono delle proteine che hanno la essere liberati lisosomi, che perciò non sono

funzione di regolare questo processo. comunque proteine

La frammentazione avviene in siti ben definiti: ci Qualsiasi DNA nucleasi può intervenire per

sono siti attivati dall’apoptosi che agiscono a livello distruggere il DNA in punti diversi, non in siti

del DNA specifici come nell’apoptosi

Riguarda singole cellule Interi tessuti o frammenti di tessuti vengono

distrutti: nel momento in cui c’è un urto non si 89

distingue tra pelle, osso ecc

Stimoli fisiologici Stimoli non fisiologici

Non c’è infiammazione perché il materiale Se la cellula si lisa automaticamente i frammenti

intracellulare rimane all’interno delle vescicole che si liberano provocano un’infiammazione

Apoptosi

Nel caso dell’apoptosi la morte cellulare è molto importante nella embriogenesi, in cui ci sono una serie di

tessuti che vanno in parte in contro a morte cellulare. Con l’apoptosi c’è anche la riorganizzazione tissutale

e la metamorfosi. L’apoptosi può anche essere una risposta ad attacchi virali: una cellula infettata da un

virus, per evitare che esso proliferi e infetti altre cellule può andare in contro ad apoptosi la cellula

muore per salvare l’organismo. Questo meccanismo è usato anche nelle cellule tumorali: la p53 regola

proliferazione cellulare, ma facilita anche l’apoptosi quando non è possibile riparare il DNA. È un

meccanismo di difesa da casi particolari di malattie.

Nel caso delle rane i girini hanno una lunga coda e quando passano alla versione adulta la coda sparisce

proprio per apoptosi. Altro fenomeno che avviene anche in molti mammiferi riguarda le dita: inizialmente,

negli abbozzi delle dita, tra le dita c’è del tessuto; man mano che l’embrione continua a svilupparsi queste

regioni interne finiscono con lo sparire per apoptosi. Altro fenomeno che avviene durante la fase

embrionale ma anche dopo la nascita riguarda lo sviluppo neurale: quando avviene lo sviluppo embrionale

inizialmente gli embrioni hanno una testa sproporzionata rispetto all’organismo; questo è dovuto anche al

fatto che nella fase iniziale di sviluppo e le fasi post-nascita noi abbiamo molte più cellule neurali, in quanto

queste cellule devono entrare in contatto tra loro e tra le cellule dell’organismo che ne hanno bisogno;

quado questo processo avviene più cellule neurali proliferano e poi la loro proliferazione viene regolata

dall’interazione con il tessuto bersaglio: es cellule muscolari che devono entrare a contatto con cellula

nervose inizialmente si hanno i neuroni che cercano di entrare in contatto con il muscolo; le cellule

muscolari producono fattori di crescita che servono per alterare le cellule neurali e ne permettono il loro

differenziamento. Quando le cellule neurali hanno raggiunto la cellula bersaglio, allora queste cellule che

sono riuscite ad entrare in contatto continuano a ricevere dal contatto le sostanze che le mantengono in

fase proliferativa e poi in fase differenziativa, mentre le cellule nervose che non sono riuscite ad entrare

contatto muoiono per apoptosi, quindi il numero totale delle cellule nervose diminuisce. Questo potrebbe

essere deleterio nei casi in cui non avviene l’adesione quando invece dovrebbe: es fibre nervose che

entrano a contatto con il tessuto della retina e attivate da segnali luminosi se in un neonato viene

coperto l’occhio, quest’occhio non riceve segnali e in questo sviluppa cecità. Tutte le cellule nervose che

non entrano in contatto con il bersaglio muoiono. Questo non vale solo per cellule nervose che hanno a che

are con una lesione, ma riguarda tutte e le cellule che riguardano un organismo. Nei primissimi giorni e

mesi di vita è fondamentale il contatto tra madre e neonato: se si avessero pochi contatti le capacità

cognitive e fisiche sarebbero ridotte (esperimento di Federico II). Abbiamo quindi più cellule nervose al

momento della nascita che in tutta la nostra vita.

Come avviene l’apoptosi?

1. Diminuzione dell’interazione con le cellule circostanti

2. Condensazione del nucleo

3. Condensazione di tutti gli altri compartimenti intracellulari

4. Perdita di acqua 

5. Le proteine aggregano collasso delle proteine MA i compartimenti rimangono compatti

6. RE e mitocondri cambiano; i mitocondri aumentano il loro volume: questo è dovuto al fatto che si

formano dei porti sulla membrana dei mitocondri e l’acqua dell’ambiente extracellulare finisce al

loro interno e delle proteine all’interno dei mitocondri fuoriescono 90

7. La membrana plasmatica dà i blebs, delle vescicole

8. Frammentazione vescicolare, NON lisi; le vescicole (corpi apoptotici) vengono fagocitati dai

macrofagi e qui degradati il che impedisce la risposta infiammatoria

Essendo una morte programmata, vuol dire che ci sono dei geni che vengono attivati in funzione della

morte apoptotica. Essendo fisiologica ed essendo legata a questi geni si può immaginare che ci siano dei

meccanismi di regolazione, pro e anti apoptotici. Le prime conoscenze sull’apoptosi avvennero su un

verme, il C. elegans, il quale negli anni 80 venne studiato perché facile da seguirne lo sviluppo: durante la

fase embrionale esso è composto da un numero preciso di cellule e sempre durante questa fase una parte

di queste cellule va in contro ad apoptosi. Essendo trasparente si può seguire il percorso delle cellule

durante tutta la fase embrionale e quindi s possono vedere anche quante cellule muoiono. Ci sono però dei

mutanti, in cui alcune cellule non muoiono, o altri in cui ne muoiono di più. Analizzando questi mutanti è

stato possibili individuare tre geni cruciali dell’apoptosi, chiamati ced-3, ced-4 (pro-apoptotici), ced-9 (anti-

apoptotico). Si sono poi scoperti dei geni ortologhi nei mammiferi: ced-3 corrisponde alle caspasi (provoca

apoptosi), ced-4 ad Apaf-1 (regola apoptosi) e ced-9 a Blc-2 (inibisce apoptosi).

Nel C. elegans si vede che la cced-9 è una proteina che si associa alla membrana esterna del mitocondrio, la

ced-4 è una membrana che interagisce con la 9 e fin quando ciò avviene non succede nulla, ma se la 9

interagisce con Egl-1 e non può più tenere ced-4 allora quest’ultimo dà origine a un tetramero in grado di

legare ced-3, attivando così il processo apoptotico. Questo processo è molto simile a quanto avviene nei

mammiferi. 

L’apoptotsi deve essere indotta da segnali, esterni o endogeni questa è la fase induttiva. La fase

esecutiva, una volta iniziata non può essere interrotta. Nella fase induttiva si può ancora intervenire per

interrompere il processo. La fase esecutiva consiste nell’attivazione di alcune proteasi, che sono delle

idrolasi particolari chiamate caspasi (proteasi che agiscono specificatamente il legame peptidico di una

cisteina legata ad un aspartato). Le caspasi tagliano tra cisteina e aspartato, ma sono esse stesse ricche di

questi due amminoacidi. Nell’uomo ce ne sono circa 10, ma normalmente sono nello stato inattivo, si

trovano allo stato di pro-caspasi. Sono attivate da un taglio proteolitico, taglio effettuato da caspasi proprio

a livello di cys e asp. Guardano la struttura di una caspasi si vede che c’è un dominio a monte chiamato pro-

dominio che viene tagliato da altre caspasi. Nel caso dei mammiferi ci sono due caspasi iniziatrici e due

esecutrici: le iniziatrici agiscono sulle effettrici attivandole. I pro-domini a monte (CARD o DED) sono dei

domini che si legano a proteine (recettori di membrana o recettori interni alla cellula) che contengono dei

domini di morte, in quanto agendo sui domini a monte delle pro-caspasi iniziatrici fanno sì che queste

caspasi vengano attivati: una caspasi di questi domini si lega a un recettore che contiene un dominio di

morte, formando così dei dimeri tra l’unità maggiore e minore e così la caspasi diventa attiva e i questo

modo può agire sulle cappassi effettrici, eliminando il pro-dominio anche in questo e tagliando tra cys e

asp, quindi le effettrici dimerizzano o tetramerizzano i quali sono attivi. C’è una reazione a catena per cui le

caspasi iniziatrici si autoattivano, in quanto interagiscono con altre proteine attraverso il loro dominio di

morti e una volta attivate agiscono le effettrici, le quali una volta attivate agiscono a valle, and origine al

processo apoptotico vero e proprie.

I substrati delle caspasi sono

- lamina B1, che fa parte del reticolo al disotto del nucleo e normalmente ser e per mantenere la

membrana nucleare in situ; il reticolo che sta al di sotto della membrana nucleare è anche un punto

di attacco del DNA. Se si taglia questo reticolo, il DNA collassa: il fenomeno del collasso della

cromatina è quindi dovuto al fatto che le caspasi hanno distrutto la lamina B1

- Siti coinvolti nella riparazione del DNA sono anch’essi substrati delle caspasi, quindi il DNA

danneggiato non può essere riparato 91


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DESCRIZIONE APPUNTO

Gli argomenti trattati sono:
Struttura e architettura della cellula e dei compartimenti intracellulari
Compartimenti della cellula
Trasporto di ioni e molecole attraverso le membrane
Conversione di energia
Comunicazione intercellulare: trasduzione dei segnali
Il citoscheletro
Rigenerazione dei compartimenti cellulari
Processi di endocitosi e fagocitosi
Adesione intercellulae e cellula-substrato
Duplicazione celulare e controllo del ciclo cellulare
La morte cellulare
Il differenziamento cellulare
Tali appunti sono stati presi a lezione e rivisti in seguito.
Si consiglia lo studio con visione del libro.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in medicina e chirurgia (ordinamento U.E. - 6 anni) (ORBASSANO - TORINO)
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher giorgiabrodini di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Basi cellulari e genetiche della medicina e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Bozzaro Salvatore.

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