Appunti per la relazione di Fisiologia vegetale

PRIMA PARTE:

Verranno preparate 4 capsule petri contenenti dischi di carta. Una verrà imbibita con

mezzo di crescita MS di controllo, e tre verranno imbibite con mezzo MS a tre

diverse concentrazioni di ABA.

Verranno disposti i semi per la germinazione.

Le capsule saranno sottoposte a trattamento al freddo per 5-7 giorni dopodichè

saranno spostate alla luce ed a una temperatura costante di 25 gradi per consentire la

germinazione.

 Sulla piastra di controllo con mezzo MS tutti i semi sono in grado di germinare.

 Sulle piastre contenenti ABA i semi wild type non possono germinare poichè la

dormienza viene mantenuta dagli elevati livelli di ABA, mentre il mutante

insensibile all'ABA può germinare.

SECONDA PARTE

Le piastre verranno osservate per identificare i semi che saranno stati in grado di

germinare nonostante la presenza di ABA. Tali semi sono mutanti abi.

Le plantule verranno raccolte e il loro DNA genomico verrà estratto al fine di

sottoporlo a una reazione di PCR che consentirà di amplificare in modo specifico il

gene abi.

TERZA PARTE

I prodotti di PCR saranno analizzati con elettroforesi su gel di agarosio.

Lo stesso prodotto di PCR verrà sottoposto ad una digestione con uno specifico

enzima di restrizione che consentirà l'identificazione definitiva della mutazione. La

presenza-assenza della mutazione verrà visualizzata sulla base del pattern di

restrizione del prodotto di PCR ottenuto durante l’esercitazione precedente, mediante

corsa elettroforetica su gel di agarosio.

SCOPO

Valutare la percentuale di germinazione su piastre contenenti acido abscissico di una

popolazione segregante di mutanti abi1-1 di Arabidopsis thaliana. Identificare mediante

PCR (polymerase chain reaction) il genotipo delle plantule germinate.

METODOLOGIA

Nella precedente esercitazione 3 piastre sono state seminate con una popolazione di semi di

arabidopsis segregante per la mutazione semidominante abi1-1:

1. Controllo (mezzo MS)

2. MS + ABA 1 mM

3. MS + ABA 5 mM

Sulla piastra di controllo contenente il mezzo MS tutti i semi possono germinare mentre, in

presenza di ABA, soltanto i semi che portano la mutazione abi1-1 sono in grado di

germinare. Le plantule cresciute in presenza di ABA rappresentano quindi i mutanti abi1-1

insensibili ad ABA.

La mutazione riguarda il gene ABI1, codificante per una proteina fosfatasi PP2C. La

modifica di un nucleotide all’interno della sequenza codificante del gene da Guanina ad

Adenina (vedi sequenze in appendice) ha due conseguenze importanti:

1) esso causa il cambiamento nella sequenza aminoacidica della proteina con un acido

aspartico (D) al posto di una glicina (G) (sufficiente a causare una perdita delle

caratteristiche biochimiche della PP2C)

2) distrugge il sito di riconoscimento per un enzima di restrizione, l’endonucleasi NcoI,

fornendoci un prezioso sistema di screening per la ricerca di tale mutazione nel DNA della

pianta.

In questa esercitazione gli studenti dovranno i estrarre il DNA genomico dai mutanti e

utilizzarlo per effettuare un'amplificazione per PCR (polymerase chain reaction) della

porzione del gene ABI1 contenente il sito di restrizione riconosciuto da NcoI.

Il frammento amplificato verrà sottoposto durante l'ultima esercitazione al taglio con

enzima di restrizione NcoI al fine di verificare la presenza della mutazione.

PROCEDURA

Estrazione del DNA genomico

 Dopo aver aperto le piastre, contare le plantule germinate, prelevarle e porle con una

pinzetta in una provetta.

 Aggiungere 200 microlitri di tampone di estrazione del DNA e omogeneizzare le

plantule con un piccolo pestello di plastica.

Genotipizzazione dei mutanti insensibili all’ABA

SCOPO

Identificare il genotipo delle plantule germinate su piastra contenente ABA e distinguere le

plantule wild type da quelle mutanti eterozigoti e da quelle mutanti omozigoti.

INTRODUZIONE

La mutazione nel gene ABI1, codificante per la fosfatasi PP2C, consiste nel cambiamento

di una Guanina ad una Adenina con conseguente distruzione del sito di riconoscimento per

l'enzima di restrizione NcoI, fornendoci un prezioso sistema di screening per la ricerca di

tale mutazione nel DNA della pianta.

Nella precedente esercitazione è stata amplificata per PCR una porzione di 513 basi del

gene Abi1 contenente il sito di restrizione NcoI:

GCTCTGTTTCTGGGTCACATGGTTCTGAATCTAGGAAAGTTTTGATTTCTCGG

ATCAATTCTCCTAATTTAAACATGAAGGAATCAGCAGCTGCTGATATAGTCGTC

GTTGATATCTCCGCCGGAGATGAGATCAACGGCTCAGATGTTACTAGCGAGAA

GAAGATGATCAGCAGAACAGAGAGTAGGAGTTTGTTTGAATTCAAGAGTGTGC

CTTTGTATGGTTTCACTTCGATTTGTGGAAGAAGACCAGAGATGGAAGATGCTG

TTTCGACTATACCAAGATTCCTTCAATCTTCTTCTGGTTCCATGTTAGATGGTCG

GTTTGATCCTCAATCCGCCGCTCATTTCTTCGGTGTTTACGACGGCCATG

G CGG

TTCTCAGGTAAAAGATTGGATCTTTTGATTAGGGTTGTTTACAGTTTGCAGAAT

CTGATTTGGTTGTTGTTGTGTAGGTAGCGAACTATTGTAGAGAGAGGATGCATT

TGGCTTTGGCGGAGGAGATAGCTAAGGAGAAACCGATGCTCTGCGATGGTGAT

ACGTGGCTGGAGAAGTGGAAGAAAGCTCTTTTCAACTCGTTCCTGA

In questa esercitazione il prodotto di PCR sarà sottoposto a digestione con l'enzima di

restrizione NcoI. Successivamente la miscela di reazione verrà sottoposta ad elettroforesi su

gel di agarosio al fine di visualizzare il prodotto della digestione. Sarà così possibile

confrontare le plantule wild type con quelle mutanti e distinguere le plantule mutanti

omozigoti da quelle mutanti eterozigoti:

GENOTIPO DIGESTIONE BANDE ATTESE SU GEL

wild type NcoI taglia entrambi gli alleli 372 + 216 bp

mutante omozigote NcoI non taglia nessuno dei due alleli 583 bp

mutante eterozigote NcoI taglia un allele e non taglia l'altro 583 bp +

372 + 216 bp

PROCEDURA

Aggiungere l'enzima di restrizione NcoI alla miscela di PCR.

Notiamo che il volume dell'enzima di restrizione deve essere sempre < o = 1/10 del volume

finale e che il buffer dell'enzima deve essere 1/10 del volume finale, essendo lo stock

concentrato 10 volte.

Miscela PCR 10 uL

NcoI 1 uL

TOTALE 11 ul

La reazione deve essere incubata a 37°C per 20 minuti quindi caricata sul gel di agarosio.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI

CLOROFILLE

INTRODUZIONE

I cloroplasti di tutte le Piante superiori contengono 2 classi principali di pigmenti che

assorbono l'energia solare e partecipano direttamente o indirettamente al processo

fotosintetico. Questi pigmenti sono le clorofille verdi (a e b) e i carotenoidi

(normalmente rossi, arancione o gialli).

Caratteristica dei pigmenti, da cui deriva il loro nome, è quella di assorbire la

radiazione elettromagnetica solare nell'intervallo di 400-700 nm, lo stesso percepito

dall'occhio umano. L'assorbimento della radiazione visibile è reso possibile

dall'esteso sistema di doppi legami coniugati che caratterizza la molecola di tutti i

pigmenti in conseguenza del quale si riduce il livello energetico della molecola

eccitata. In tal modo anche la radiazione visibile (a lunghezze d'onda alte e perciò ad

energia minore), in accordo con la teoria quantistica, riesce ad eccitare la molecola di

pigmento e quindi può essere utilizzata per il lavoro fotochimico.

Grazie alle caratteristiche di assorbimento dei pigmenti fotosintetici le piante

riescono ad utilizzare le radiazioni più abbondanti dello spettro solare convertendole

in energia chimica di legame nel processo fotosintetico.

La maggior parte dei pigmenti del cloroplasto non effettua lavoro fotochimico ma

partecipa alla raccolta della luce (antenne). Una clorofilla dell'antenna ed eccitata da

un fotone trasferisce l'eccitazione ad altre clorofille, secondo un gradiente decrescente

di energia di eccitazione (e quindi di lunghezze d'onda crescenti della luce assorbita)

ed infine alla clorofilla a dei centri di reazione (P680 o P700).

Le clorofille a e b sono i pigmenti più abbondanti delle piante. Le clorofille hanno

una struttura porfirinica formata da 4 anelli pirrolici chelati al centro con un atomo di

Mg2+ ed una catena lineare di 20 atomi di carbonio, il fitolo, esterificato con il

gruppo carbossilico di un residuo di acido propionico legato al IV anello pirrolico

(vedi figura). La differenza tra clorofilla a e b consiste nella presenza nella prima di

un gruppo metilico al posto di un gruppo aldeidico nell'anello II: ciò rende la

clorofilla a leggermente più solubile della clorofilla b in solventi non polari come

l’esano. Questa caratteristica può essere utilizzata per separare cromatograficamente

le due clorofille. La catena idrocarburica non polare del fitolo ha la funzione di

ancorare la molecola di clorofilla alla porzione idrofobica della membrana del

tilacoide.

La clorofilla a ha una colorazione blu-verde e la clorofilla b giallo-verde: il loro

spettro di assorbimento della luce fra 350-700 nm è infatti leggermente diverso.

Entrambe hanno massimi di assorbimento nel blu-violetto (intorno a 450 nm) e nel

rosso (650-700 nm) e minimi nel verde e nel giallo (500-600 nm); i picchi della

clorofilla b si trovano all'interno rispetto a quelli della clorofilla a (nella zona del

rosso il massimo di assorbimento della clorofilla b, in acetone, corrisponde a 646.6

anzichè 663.6 nm, tipica della clorofilla a). Va notato che la clorofilla a nella cellula

intatta mostra molti picchi di assorbimento superiori: 670, 680, 685, 690 e tra 695 e

720 nm. Questi picchi non sono dovuti alla presenza di forme molecolari diverse di

clorofilla a ma costituiscono spostamenti di spettro dovuti alle interazioni con

proteine o ad aggregazioni.

Il rapporto tra le due clorofille nelle piante superiori e nelle alghe verdi è spesso

di 2-3 clorofille a per una clorofilla b, ma varia in relazione alle condizioni

ambientali.

Scopo dell'esercitazione

 Estrazione dei pigmenti dei cloroplasti di foglie.

 Determinazione degli spettri di assorbimento nell'intervallo di lunghezze

d'onda 350-700 nm.

 Determinazione della concentrazione delle clorofille a e b e della clorofilla

totale utilizzando la diversa assorbanza nel rosso (massimi di assorbimento a

663.6 e 646.6 nm) delle due forme.

MATERIALI

- Foglie 0.2 g - 1 cilindro da 100 ml

- Acetone all'80 %, -Centrifuga e provette

- mortaio e pestello

PROCEDURA

ESTRAZIONE DELLE CLOROFILLE

4. tagliare la lamina fogliare. Pesare 0.1/0.2 g di questo materiale, aggiungere 2 ml di

acetone all'80 % e omogeneizzare.

5. centrifugare a 3000g per 5 minuti prelevando il sovranatante.

6. Estrarre di nuovo il residuo solido con 2 ml di acetone all'80%, centrifugare e

unire questo secondo sovranatante al primo. Misurare il volume finale

dell’estratto.

7. Mantenere l'estratto al buio fino alla lettura spettrofotometrica.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELLE CLOROFILLE

8. Misurare allo spettrofotometro l'assorbanza a 663.6,