Appunti Microbiologia Prof Mattina

Appunti di microbiologia, 03/03/2015

Nel nostro organismo ci sono più batteri che cellule (rapporto di 1:10). La maggior parte dei batteri si trova nell’intestino, il 70% delle feci è costituito da batteri. Pazienti che hanno seguito una terapia antibiotica, tramite un antibiotico che viene smaltito con le feci, devono poi reintegrare i batteri dell’intestino persi tramite probiotici. Al secondo posto, per numero di colonizzazione da parte di batteri, c’è il cavo orale. Nella saliva albergano circa 500 milioni di batteri per cm³. Nella placca dentaria è presente un numero ancora maggiore di batteri, ovvero da 10 a 100 miliardi per grammo umido di placca. Al terzo posto, come quantità di batteri, troviamo la pelle.

Il cavo orale è comunque il primo distretto per numero di specie batteriche diverse. Vengono stimate tra le 300 e le 500 specie batteriche diverse. Molti batteri trovano quindi nel cavo orale condizioni ottimali per vivere e moltiplicarsi. Queste condizioni sono:

• L’umidità
• I nutrimenti (ottenuti dalla dieta quotidiana e dal materiale secreto, ovvero dal liquido crevicolare)
• Una temperatura adatta (37 gradi)
• Una stabilità dell’ambiente in cui risiedono (i batteri hanno una velocità di replicazione rapidissima - 20 minuti)

I batteri, presenti in condizioni di salute, servono a produrre sostanze utili alla nostra salute (vitamine) o ad impedire che forme microbiche patogene vadano ad attaccare il nostro organismo. Un altro distretto colonizzato dai batteri è la vagina, i quali servono a mantenere un pH acido utile per contrastare agenti patogeni esterni.

Microbo

Organismo unicellulare invisibile ad occhio nudo, ma visibile con l’aiuto del microscopio. Non esisterebbe alcuna forma di vita animale o vegetale senza i microbi. Esempi di microbi dannosi per l’organismo responsabili di:

• Tubercolosi
• Difterite
• Polmonite
• Tifo (patologie principalmente batteriche)
• Influenza
• Poliomielite
• Parotite
• Rosolia
• Morbillo
• Epatite virale
• AIDS (patologie virali)

Le malattie sostenute da batteri sono ad oggi sotto controllo, quelle sostenute da virus meno (possono essere prevenute tramite i vaccini). I microrganismi sono ubiquitari (presenti ovunque): suolo, acqua, aria, alimenti, utensili; riescono a vivere nelle condizioni più disparate. Ci sono batteri che vivono in condizioni di stretta anaerobiosi. La maggior parte dei batteri presenti nel cavo orale sono anaerobi obbligati e riescono a vivere perché si inseriscono tra lo smalto dei denti e la placca batterica esterna costituita da batteri aerobi. Alcuni batteri anaerobi producono delle sostanze che servono ad alimentare i batteri aerobi. I batteri patogeni hanno come temperatura ottimale i 37 gradi, i batteri ambientali i 20-21 gradi.

Appunti di microbiologia, 04/03/2015

I batteri colonizzano le superfici cutanee, le mucose, le cavità degli organismi superiori ed anche i protozoi. I batteri sono in grado di riconoscere determinate superfici e andare ad aderire a specifiche superfici per cui è quasi normale trovare determinati microrganismi a livello cutaneo, a livello delle mucose e nelle cavità. I batteri vengono distinti in due grandi gruppi:

• Batteri autoctoni
• Batteri alloctoni

I batteri autoctoni sono quei batteri che, venendo a contatto con una superficie, hanno la possibilità di colonizzarla e di moltiplicarsi, perché hanno ritrovato in quella superficie le condizioni adatte per la loro vita. I batteri alloctoni sono tutti quei batteri che venendo a contatto con una superficie, non riescono ad aderire, e quindi vengono allontanati dalla superficie stessa. A livello del cavo orale alcune specie batteriche sono autoctone e altre alloctone. I batteri autoctoni aderiscono alle mucose della cavità orale e alla superficie dei denti tramite delle adesine.

Van Leeuwenhoek nel 1683, fu il primo che, grazie ad un rudimentale microscopio, riuscì ad osservare e descrivere microrganismi di forma diversa (cellule batteriche). Diverse scoperte fatte in seguito hanno anche un certo grado di fortuna. La penicillina ad esempio fu scoperta per un errore in fase di coltura. La fortuna di Van Leeuwenhoek è dovuta al liquido che ha scelto da osservare. Egli andò ad osservare la placca dentaria. La descrizione fatta da Van Leeuwenhoek è diventata il caposaldo della batteriologia. Egli riuscì a distinguere varie forme batteriche e ci disse che alcuni di questi batteri risultavano immobili, altri invece che erano dotati di movimento. Abbiamo quindi delle informazioni utili tutt’oggi per studiare una specie batterica.

Redi fu il primo ad emettere la teoria che ogni essere vivente deve essere per forza generato da un altro essere vivente (“Omne vivum ex vivo”). Spallanzani (1729-1799) dimostrò che l’innalzamento della temperatura previene la comparsa di microrganismi. La sterilizzazione si può far in tantissimi modi, una delle tecniche più adoperate è proprio l’aumento della temperatura. Bassi (1773-1856) dimostrò le capacità patogene dei microrganismi di dare ad un animale una malattia infettiva. Introdusse quindi i due concetti ancora oggi fondamentali di infezione e di disinfezione.

I veri padri della batteriologia sono stranieri, il primo Luigi Pasteur. Pasteur (1822-1895) ha fatto numerosissime scoperte, tra cui il vaccino contro la rabbia (causata dal Rabdovirus). Pasteur ha scoperto anche il processo della pastorizzazione, che prevede la scomparsa di flora microbica, utilizzando dei trattamenti termici tali da non denaturare le proteine di determinate bevande o alimenti. Mentre Pasteur lavorava in Francia, in Germania c’era un altro famoso scienziato, Roberto Koch, che scoprì il bacillo della tubercolosi. Koch riuscì anche ad introdurre i terreni di coltura, quindi la possibilità di coltivare in laboratorio i diversi batteri, sia quelli patogeni, sia quelli non patogeni. Questo aprì una strada importante nella diagnostica da laboratorio. Koch è importante anche per il fatto di aver emesso quattro postulati:

• Il microrganismo deve essere associato alla malattia ed essere assente nei soggetti sani. [commento: in effetti in un individuo sano perché un batterio patogeno, possa causare una malattia infettiva, è importante anche la quantità di batteri che entra in contatto con l’individuo (carica batterica). Se la carica batterica è piccola, in un individuo sano e immuno-competente, la patologia non si instaura. Ci sono anche degli individui poi, definiti portatori sani per una determinata specie batterica, che presentano all’interno del loro organismo una determinata carica batterica, senza però manifestare la patologia].
• Il microrganismo deve essere isolabile dalla persona infetta e lo si deve poter ottenere in coltura pura in laboratorio. [commento: per dei batteri, come le Spirochete, non esiste un terreno di coltura per coltivarli. Ci sono quindi delle piccole eccezioni].
• La coltura del microrganismo deve causare analoghe manifestazioni patologiche in un animale da laboratorio suscettibile. [commento: ci sono delle eccezioni, es. l’agente eziologico della gonorrea, non è possibile farlo riprodurre in animali di laboratorio].
• Lo stesso microrganismo che è stato isolato dalla persona infetta, deve essere ottenuto in coltura pura dall’animale infetto.

Questi quattro postulati ancora oggi sono validi per poter definire un batterio patogeno. Miller (1853-1907) è considerato il padre della microbiologia del cavo orale. È stato il primo ad ipotizzare, per la carie dentale, la teoria chimico-parassitaria, teoria che tutt’oggi è valida. La carie viene definita una malattia multifattoriale, dove i tre fattori sono rappresentati dalla:

• Presenza di batteri cariogeni
• Presenza nella dieta di zuccheri raffinati che verrano attaccati dai batteri cariogeni che produrranno acidi forti capaci di intaccare lo smalto dei denti
• Predisposizione da parte dell’ospite

Se questi tre fattori sono contemporaneamente presenti è possibile che inizi il processo cariogeno. I microrganismi vengono suddivisi in sei gruppi principali:

• Protozoi
• Alghe
• Batteri
• Cianobatteri
• Virus
• Funghi

Sono tutti microrganismi unicellulari, ad eccezione di funghi e alghe. Le branche fondamentali della microbiologia sono quattro:

• Batteriologia
• Virologia
• Micologia (funghi e miceti)
• Parassitologia

I microrganismi vengono suddivisi anche in:

• Saprofiti: microrganismi che, venendo in contatto con il nostro organismo, non danno alcun fastidio e alcuni sono addirittura utili per la nostra salute.
• Patogeni: quei batteri che, se vengono a contatto con un individuo in una quantità sufficientemente elevata, sono in grado di provocare una malattia infettiva.
• Patogeni potenziali: per patogeno potenziale intendiamo quel microrganismo che, se viene isolato in un determinato habitat, non dà problemi alla persona che lo porta al suo interno. Ma se questo microrganismo dovesse spostarsi in un altro distretto corporeo, è in grado di provocare un’infezione. L’esempio classico di un potenziale patogeno è Escherichia Coli. Se Escherichia dall’intestino dovesse trasferirsi a livello vescicale, qui trova un ottimo terreno di coltura, causando all’individuo un’infezione urinaria (cistite).
• Opportunisti: microrganismi che aspettano un’occasione adatta per mostrarsi “cattivi”. Gli opportunisti vanno ad infettare individui che sono immunodepressi e che in un individuo immuno-competente non causerebbero nessuna patologia.

Batteriologia

Batteri = microrganismi unicellulari che non hanno un nucleo ben organizzato, non contengono clorofilla, e si riproducono per scissione binaria. I batteri sono organismi procarioti. La differenza fondamentale tra una cellula eucariota e una procariota risiede proprio nel nucleo. La cellula procariota ha una struttura nucleare estremamente semplice (un unico cromosoma vagante nel citoplasma). Nella cellula procariotica sono sempre assenti la membrana nucleare, il nucleolo, l’ergastoplasma e il reticolo endoplasmatico.

I batteri devono essere classificati per poter essere studiati. La classificazione li distingue in:

• Classe
• Ordine
• Sottordine
• Famiglia
• Tribù
• Genere
• Specie
• Tipo
• Varietà

Salvo rarissime eccezioni, bisogna tenere presente per la classificazione dei batteri, la famiglia, il genere e la specie. La famiglia comprende più generi e ogni genere comprende più specie. Il nome della famiglia finisce sempre in -aceae, il nome del genere è rappresentato solo da una parola (es. Escherichia), la specie si riconosce subito perché formata da due parole (es. il nome del genere più un altro nome: Escherichia Coli).

Criteri classificativi:

• Morfologici: consentono di fare le distinzioni più grossolane - forma della cellula batterica.
• Biochimici: differenziano i generi e le specie.
• Antigenici: classificazione più accurata, differenzia i tipi e le varietà.

Proprietà morfologiche: se noi coltiviamo i batteri in un terreno, questi batteri nel giro di 18-24 ore si replicano numerose volte e formano una comunità di cellule batteriche, si sarà quindi formata una colonia batterica, visibile ad occhio nudo. Queste colonie batteriche hanno poi una serie di caratteristiche che sono tipiche di quella colonia batterica. Una colonia batterica, in quanto costituita da cellule provenienti da un unico progenitore, viene definita colonia mono-cito-genetica. Tra le proprietà morfologiche c’è anche l’aspetto microscopico. I batteri, pur essendo tutti molto piccoli, hanno dimensioni variabili da tipo a tipo, così anche la forma e lo stato di aggregazione sono variabili da genere batterico a genere batterico. L’ultima proprietà morfologica è rappresentata dalle proprietà tintoriali, basata sulle differenze nelle risposte a diverse colorazioni.

Proprietà biochimiche:

• Condizioni ottimali di crescita (temperatura, pH, ossigeno, pressione osmotica) Ci sono batteri capaci di vivere sia in presenza di ossigeno, sia in assenza (aerobi facoltativi). Ci sono poi dei batteri, chiamati aerofili, che hanno bisogno di una grandissima quantità di ossigeno e non gli basta l’ossigeno presente nel terreno di coltura ma necessitano di quello atmosferico. Ogni batterio ha una sua pressione osmotica ideale per potersi replicare.
• Capacità di fermentare alcuni prodotti, ad esempio degli zuccheri. In base a questa loro capacità viene fatta la distinzione in genere o specie.

Proprietà biologiche:

• Patogenicità
• Caratteristiche sierologiche
• Sensibilità al batteriofago

Preparati microscopici: i preparati microscopici vengono distinti in preparati a fresco e in preparati colorati. Nei primi non si usa alcun tipo di colorante e i batteri vengono usati vivi, nei preparati colorati i batteri invece vengono uccisi. Nei preparati a fresco abbiamo preparati a strato sottile (di poco utilizzo) e a goccia pendente. Il vetrino usato per il preparato a goccia pendente è molto spesso ed è presente in esso un incavo centrale (vetrino porta oggetti). Per allestire un preparato a goccia pendente bisogna preparare una sospensione batterica presente in una provetta. Viene usato un vetrino molto sottile, chiamato vetrino copri oggetto, sul quale viene depositato una goccia della sospensione batterica. Tra il vetrino copri oggetto e il porta oggetto viene depositato un olio, in modo tale da tenerli uniti. Chi attribuisce mobilità alla cellula batterica è un elemento che alcuni batteri possiedono, chiamato flagello o ciglia. I batteri di questo tipo sono chiamati mobili. I batteri che invece non presentano ciglia o flagello sono immobili e si possono muovere solo tramite movimenti brauniani.

I preparati colorati si dividono in colorati semplici e colorati speciali. I colorati semplici sono colorati con un solo colorante, mentre le colorazioni speciali prevedono l’utilizzo di almeno due coloranti. I coloranti vengono definiti come sostanze chimiche colorate capaci di fissarsi ad un substrato, impartendogli una colorazione. È condizione necessaria ma non sufficiente che una molecola sia colorata per essere colorante. Le sostanze coloranti sono divise in sostanza naturali (animali o vegetali) o artificiali (derivati dell’anilina). I coloranti utilizzati possono essere basici, neutri o acidi. In batteriologia si usano solo coloranti basici.

Appunti di microbiologia, 10/03/2015

Le colorazioni possono essere distinte in colorazioni dirette e indirette. Le colorazioni indirette fanno uso di una sostanza chiamata mordente, che serve per far aderire il colorante al substrato con maggior tenacia. I mordenti vengono usati anche nell’industria tessile per evitare che il colorante si perda durante i lavaggi. In batteriologia i mordenti usati sono: acido fenico, acido acetico, idrato di sodio, idrato di potassio. Per fare le colorazioni sono necessarie le soluzioni coloranti:

• Soluzioni acquose (la polverina che porta la colorazione deve essere solubile in acqua);
• Soluzioni alcoliche (Soluzioni Madri, non possono essere usate tal quali - polverina + alcool - ma bisogna usare delle Soluzioni Figlie, aggiungendo dell’acqua distillata);
• Soluzioni idro-alcoliche (Soluzioni Figlie);
• Soluzioni mordenzate.

Le colorazioni possono essere distinte in:

• Semplici (positive e negative, a seconda della parte di cellula batterica che si vuol mettere in evidenza);
• Speciali o combinate.

Le colorazioni semplici vengono distinte in:

• Monocromatiche: maggior parte delle colorazioni, tutte le parti della cellula batterica si colorano in modo uniforme;
• Metacromatiche: quelle colorazioni che sono in grado di impartire ad alcune strutture della cellula batterica una colorazione diversa dal colorante adoperato (es: utilizzando un colorante giallo, i granuli di polimetafosfati di C. Diphteriae si colorano di rosso mattone).

I coloranti sono tantissimi in batteriologia, quelli da ricordare sono i seguenti:

1. Violetto di Nicolle
2. Bleu di Metilene
3. Safranina
4. Fucsina

Gli ultimi due hanno un colore rosso. L’utilizzo di un colorante rispetto ad un altro rispecchia la libera scelta del batteriologo. I coloranti permettono di stabilire la forma, la dimensione e lo stato di aggregazione della cellula batterica. La prima cosa da fare è pulire e sgrassare un vetrino porta oggetto, per poi sottoporlo a colorazione. Nella colorazione semplice bisogna impiegare un solo tipo di colorante e la colorazione che viene fatta, prevede prima di tutto la distensione del materiale sul vetrino pulito. La fissazione del materiale sul vetrino viene fatta passando il vetrino dentro la fiamma di un bunsen e al caldo questi batteri si incollano al vetrino. La placca dentaria deve essere sciolta con dell’acqua distillata sterile e stemperata in una determinata superficie del vetrino.

La colorazione può essere fatta o a freddo (bleu di Metilene, Safranina - tre, cinque minuti), o a caldo (Fucsina, Violetto di Nicolle - un minuto). Dopo questa colorazione il vetrino viene lavato per eliminare l’eccesso di colorante, viene asciugato e si passa all’osservazione al microscopio, utilizzando un particolare tipo di obiettivo, chiamato obiettivo ad immersione (perché sul vetrino che viene colorato viene depositata una goccia di olio di cedro per migliorare la capacità risolutiva del microscopio).