Appunti Microbiologia

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domenica 26 settembre 2021 19:12

La microbiologia è la disciplina che studia gli organismi invisibili ad occhio nudo ed inizia con

l'osservazione sperimentale della loro esistenza.

1677: Leeuwenhoek con microscopi semplici fa prime osservazioni complete di microorganismi.

1685: comunica l'osservazione dell'esistenza di microorganismi con vita autonoma, in

contrapposizione della teoria della generazione spontanea.

Prima dimostrazione che la generazione spontanea dei microorganismi NON è valida: Lazzaro

Spallanzani, nel 1765, prese delle fiasche/beute di vetro (recipienti) con all'interno degli infusi di

carne bolliti per 2 ore; una beuta la tappò, l'altra la lasciò aperta, in quest'ultima si ebbe

intorpidimento dovuto alla crescita microbica.

Conclusione: la crescita di microrganismi negli infusi è dovuta a contaminazione microbica

esterna all'infuso e non a generazione spontanea all'interno dell'infuso.

I suoi esperimenti non vennero considerati validi perchè nelle fiasche non c'era O2, dimostrato

essenziale per gli organismi viventi; l'assenza di O2 nelle fiasche sigillate non consentiva la

generazione spontanea dei microrganismi.

Per risolvere il problema aria si mise ovatta che la filtrava, ma dicevano che l'ovatta stessa

modificava l'ambiente (l'aria) e impediva il normale processo di nascita di microrganismi,

sostenevano quindi ancora la teoria delle generazione spontanea.

Ci sono stati 2 contributi fondamentali nella storia della microbiologia:

- Pasteur nel 1864 dimostra che i microorganismi sono presenti nell'aria e demolisce

definitivamente la teoria della generazione spontanea.

- Koch nel 1878 dimostra l'eziologia microbica di una malattia contagiosa (carbonchio).

Esperimento di Pasteur

Uso di una beuta con il collo modificato (a collo di cigno) con dentro brodo di carne. Sterilizza

l'ambiente interno, poi piega il collo scaldandolo. I microorganismi sono liberi di entrare nella

beuta ma si fermano nell'ansa del collo e non vanno nel brodo, non diventa torbido. Se io rompo il

collo/piego la beuta, i microrganismi finiscono all'interno della beuta e il brodo si intorpidisce.

Il problema delle spore batteriche: le spore resistono anche a bollire, per ucciderle è necessario il

calore di 121° per 30 minuti -> viene inventata l'autoclave nel 1884.

Esisteva un'opinione diffusa che le malattie epidemiche fossero contagiose ("miasmi malsani",

"organismi invisibili causa di malattie"); Semmelweis nel 1840 intuì la trasmissibilità indiretta

ambiente-uomo ma non fu creduto anzi deriso, dopo circa 40 anni la sua scoperta fu accettata.

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domenica 26 settembre 2021 19:16

Robert Koch: scoperta dell'eziologia microbica delle malattie contagiose = il carbonchio è una

malattia infettiva (1878), scopre nel 1882 la tubercolosi ( Mycrobacterium tuberculosis ).

Carbonchio (antrace):

prelevò sangue da un animale malato di carbonchio

- seminò il sangue infetto in un terreni nutriente (propagazione in vitro)

- con questa coltura infettò un animale sano

- l'animale si ammalò della stessa patologia e isolò di nuovo il microrganismo creando un

- ciclo

Tubercolosi:

prelevò dell'espettorato (campione polimicrobico) da un individuo malato

- semina su fettine di patata biliata e glicerinata

- Un microbatterio di tubercolosi si moltiplica in 24 ore, per avere una colonia ci vogliono 3

settimane.

le colonie vennero essiccate e polverizzate

- usò delle cavie (animali suscettibili all'infezione) e li infettò per via aerogena

- le cavie si ammalarono

- venne nuovamente isolato il microbatterio dalle cavie malate

-

I POSTULATI DI KOCH 1881: servono per spiegare l'eziologia microbica.

1- L'agente causale (microorganismo) deve essere presente in tutti gli individui malati e

assente in quelli sani.

2- L'agente causale deve essere isolato nel soggetto malato e in coltura deve dare origine ad

una popolazione omogenea (coltura pura).

3- L'inoculazione di una coltura pura in individui sani da luogo alla comparsa della malattia di

cui è ritenuto responsabile.

4- L'agente causale deve essere re-isolato dall'organismo infettato sperimentalmente.

Affianco a questi ci sono i POSTULATI DI KOCH MOLECOLARI (3):

1- tutti i ceppi patogeni di una data specie hanno il gene implicato nella virulelnza.

2- L'inattivazione del gene attraverso la creazione di un ceppo mutante, non deve dare

virulenza guardano il fenotipo.

3- Creando un ceppo complementare con il gene funzionante, la virulenza ritorna.

Lezione 1 Pagina 2

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martedì 28 settembre 2021 10:16

La dimostrazione dell'eziologia microbica delle malattie contagiose stimolò lo sviluppo di vaccini.

I termini "vaccino" e "vaccinazione" vengono da Pasteur per onorare Jenner, un medico che nel

1798, introdusse la pratica empirica di somministrare essudato di pustole di vaiolo vaccino (non

letale per l'uomo) ad individui sani, allo scopo di proteggerli dal vaiolo umano, letale per l'uomo. Il

termine vaccino deriva dalla parola Varìola vaccinae, cioè vaiolo della mucca.

1880 Pasteur e il colera dei polli:

Propagò in vitro l'agente eziologico Pasteurella septica

- Casualmente inoculò colture vecchie in animali che non ammalarono

- Inoculò gli stessi animali con colture fresche; gli animali non contrassero le malattie che si

- sviluppò invece in animali non infettati in precedenza con le colture vecchie

….

-

Differenza tra diarrea e dissenteria: diarrea sono feci acquose, la dissenteria è associata da perdite

di sangue, poiché danneggia le mucose intestinali.

Grazie alle scoperte della microbiologia, dal 1700 abbiamo guadagnato 55 anni di speranza di vita.

1838-39 viene scoperta la prima eziologia microbica.

1983-84 isolamento HIV, scoperta PCR

2001 attacco bioterroristico a base di antrace (carbonchio).

Oggi la microbiologia ha come oggetto di studio discipline molto diversificate:

Microbiologia medica: i microrganismi patogeni sono un numero limitato rispetto alla totalità

- di microrganismi; lo studio è mirato a comprendere i meccanismi attraverso i quali il

microrganismo danneggia l'uomo.

Fisiologia microbica: flessibilità metabolica superiore a tutti gli organismi viventi, sono capaci

- di vivere in qualsiasi tipo di ambiente, hanno rapide risposte adattive.

Ecologia microbica: i batteri colonizzano tutti gli ambienti naturali, con formazione di consorzi

- pluricellulari.

Biotecnologie microbiche: i microrganismi diventano uno strumento per produrre servizi utili

- alla comunità.

Classificazione

Con l'avvento del microscopio elettronico, nel 1938 i batteri vengono classificati da soli come

procarioti, distinti dagli eucarioti.

Nel 1990 con studi molecolari avevamo 3 domini: batteri, archei (sempre procarioti) ed eucarioti.

I procarioti si distinguono in: archeobatteri (metanogeni, termoacidofili, alofili estremi) ed eubatteri.

La vita microbica sulla Terra ha dominato per più di 3-5 miliardi di anni; i microrganismi sono

ubiquitari e quindi colonizzano tutti gli ambienti; sono alla base della catena alimentare ed

essenziali per il riciclo degli elementi; i patogeni sono una minoranza, sono per lo più innocui o

benefici.

Attualmente li ritroviamo ovunque i batteri: nei ghiacciai, nelle saline, nelle aree desertiche e

rocciose, nelle sorgenti termali; la quantità di microbi che colonizzano il nostro corpo è

elevatissima. Lezione 2 Pagina 3

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martedì 28 settembre 2021 11:05

CELLULA EUCARIOTICA E PROCARIOTICA differenze:

Batteri GRAM POSITIVI divisi in base alla loro morfologia: cocchi (sferici, immobili, classificanti in

base a come si distribuiscono nello spazio: streptococchi e stafilococchi), bastoncelli (forma

allungata).

I batteri si dividono per scissione binaria, dal punto di vista genetico si creano dei cloni, ma a

seconda del piano di divisione i cocchi possono disporsi in vari modi:

1) Divisione cellulare secondo un solo asse: diplococchi (disposte in coppie) es. Streptococcus

pneumoniae, streptococchi (disposte a catena in quanto tendono a rimanere unite dopo la

divisione cellulare) es. Streptococcus pyogenes.

2) Divisione secondo 2 assi perpendicolari: tetradi (disposte su un unico piano, 4 cellule

attaccate), cellule disposte su un piano a formare "fogli" monostratificati.

3) Secondo 3 assi perpendicolari: formazione di cubi di 8 cellule (sarcine)

4) Secondo assi casuali irregolari: si formano come dei grappoli (stafilococchi).

Ci sono dei bastoncelli in grado di muoversi, grazie alla presenza di flagelli; tra i bastoncelli ci sono

quei microrganismi in grado di produrre le spore: Bacillus (aerobio) e Clostridium (anaerobio).

I bacilli vengono distinti tramite dimensioni, lunghezza, spessore, motilità flagello-mediata.

Lezione 2 Pagina 4

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martedì 28 settembre 2021 11:20

La tassonomia batterica è basata su caratteristiche fenotipiche; l'unità tassonomica

fondamentale è la specie, una categoria sistematica naturalmente delimitata in base a

interfecondità parentale, fertilità della progenie. La propagazione dei batteri è clonale, per cui la

definizione di specie batterica è arbitraria.

"Una specie batterica è un insieme di ceppi che condividono un fenotipo (determinato dal loro

genotipo), che si mantiene stabile ed è diverso da quello che caratterizza altri insiemi di ceppi."

La validità di questa definizione di basa sul concetto di genoma equilibrato, che favorisce il

mantenimento di specie stabili e ben adattate a determinati ambienti, tramite selezione

stabilizzante (negativa, che elimina le deviazioni eccessive) e selezione divergente (positiva, che

può costituire la base di ulteriore speciazione).

Quali sono i criteri fenotipici che conserviamo?

Identificazione di specie:

Morfologia cellulare

- Presenza di spore

- Caratteristiche tintoriali

- Motilità

- Forma della colonia

- Tipo di metabolismo

- Suscettibilità ad antibatterici (potrebbe modificarsi a differenza delle altre, perché alcuni tipi

- di resistenza possono sopraggiungere quando il batterio acquisisce informazioni

dall'esterno)

Habitat

- Sequenze geno-specifiche

-

Identificazione di tipo (dentro la specie):

Sierotipizzazione (sierotipo, identifica un ceppo all'interno di una specie)

- Biotipizzazione (biotipo, caratterizzazione della base dell'uso di alcuni metaboliti, o

- sostanze)

Tipo della colonia (morfotipo)

- Genotipizzazione sequenze geno-tipiche

-

Oltre ai cocchi e ai bastoncelli abbiamo anche altre forme: il vibrione, lo spirillo, la spirocheta. La

morfologia può cambiare anche in risposta al variare delle condizioni ambientali.

COLORAZIONI BATTERICHE : alcune proprietà tintoriali sono assunte come criterio tassonomico e

consentono anche di meglio rilevare caratteristiche della cellula batterica.

1) Colorazione di Gram 1884: colorazione differenziale -> usa un colorante primario

( cristalvioletto, colora blu-viola ciò che c'è sul vetrino) e uno di contrasto (safranina, colora

rosa-rosso).

Dopo aver utilizzato il colorante primario, aggiungo una soluzione mordenzante a base di

iodio: lo iodio crea dei complessi con il cristalvioletto per cui rimane intrappolato ed ha

difficoltà ad uscire. Il trattamento decolorante è effettuato con alcol per 15-20 secondi. Il

decolorante agisce solo sulla parete dei batteri gram negativi, per cui l'alcol fa fuoriuscire il

colorante; nella parete dei gram positivi il colorante rimane intrappolato. Il colorante di

contrasto entra in tutto ciò che è rimasto decolorato sul vetrino, non nella parete dei gram

positivi poiché sono già "piene" di colore blu. Batteri differenziati sulla base delle proprietà

chimiche della parete. Lezione 2 Pagina 5

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martedì 28 settembre 2021 11:40

2) Colorazione di Ziehl-Neelsen

Batteri con parete che strutturalmente ricorda quella dei gram negativi, ma è rivestita di cere ed

è fortemente idrofobica; la complessità della parete spiega il tempo così lungo di colorazione.

Uso una colorazione differenziale: il colorante primario contiene fenolo (fucsina fenicata) e

viene usato con calore così che penetri nella parete; sciacquo senza mordenzante e uso come

miscela decolorante una miscela di alcol e acido, uso il colorante di contrasto (blu di metilene)

che mi farà apparire blu i bacilli di tubercolosi.

3) Colorazione con blu di metilene

Colora tutto nello stesso modo, è meno informativa però può essere interessante quando so

cosa sto colorando es. Corynebacterium diphtheriae.

Preparazioni microscopiche non colorate: preparazioni "a fresco" per mettere in evidenza strutture

molto rifrangenti: le spore batteriche.

Batteri : microrganismi unicellulari, procarioti, di dimensioni di solito nell'ordine di pochi micrometri,

ma possono variare da o,2 micrometri dei microplasmi, fino a 30 micron di alcune spirochete.

Lezione 2 Pagina 6

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giovedì 30 settembre 2021 18:07

La parete batterica

La parete dei batteri gram + sembra più uniforme, mentre quella dei gram - c'è un po' di confusione

per noi che la osserviamo. La struttura della parete batterica dei gram +, nel versante più esterno

c'è un'altra membrana completamente diversa dalla membrana plasmatica. Ritroviamo questa

struttura scarsamente rappresentata nei gram-. Questa strutturazione spiega perchè la colorazione

di Gram funziona così.

Di pareti ce ne sono diverse: quella dei gram + , quella dei gram - , quella dei micobatteri (con cere)

e quella dei funghi (o miceti, tanti provocano infezioni nell'organismo), che è completamente diversa

da quella dei batteri.

Nei 2 tipi di batteri la parete è posizionata nel periplasma, sopra la membrana cellulare.

Lezione 3 Pagina 7

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venerdì 1 ottobre 2021 10:46

La parete batterica (o sacculo) ha importanti funzioni:

Proteggerlo dalla lisi osmotica

- Mettiamo una cellula batterica in una soluzione ipotonica (concentrazione minore del

citoplasma batterico) con l'enzima lisozima, questo taglierà dei legami importanti della parete,

così la cellula va incontro a morte, poiché per osmosi la cellula scopppia. In una soluzione

isotonica, anche con l'enzima la parete si distacca ma la cellula non muore.

Se c'è la parete non succede niente perché protegge.

Si chiamano protoplasti le cellule che si ottengono dai gram + dopo digestione con lisozima; Si

chiamano sferoplasti le cellule che si ottengono dai gram - dopo digestione con lisozima.

Determina la forma del batterio

- Molti dei componenti della parete sono unici in natura

- Numerosi agenti antibatterici hanno come bersaglio la parete (anche il lisozima presente nelle

- lacrime e nella saliva)

La struttura della parete è diversa nei batteri gram + e gram -

-

Il sacculo conferisce rigidità e forma, è costituita prevalentemente da peptidoglicano (o mureina)

fatto da peptidi e zuccheri. I gram + hanno una parete fatta dal 90% di peptidoglicano, quelli gram -

hanno un piccolo strato di peptidoglicano invece.

Lezione 3 Pagina 8

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venerdì 1 ottobre 2021 10:59

LPS= lipopolisaccaride -> elemento che rende conto della patogenicità dei batteri gram - ; sta sulla

membrana esterna, quindi i gram + non ce li hanno perché non hanno la membrana esterna.

Peptidoglicano:

Strato rigido presente sia nei batteri gram + (quasi totalità) che gram -

- Comporto da uno scheletro di catene glicaniche composte da 2 zuccheri che si ripetono, legate

- da ponti aminoacidici

l'esatta composizione molecolare di questo stato è specie specifica

-

I 2 zuccheri sono:

N-acetilglucosamina (NAG)

- Acido N-acetilmuranico (NAM)

-

Tenuti insieme da un legame glicosidico beta (1->4), questo legame è il bersaglio di alcuni antibiotici,

del lisozima ecc.

Sono l'unità funzionale questi 2 zuccheri.

Attaccata al NAM c'è una catena peptidica di 4 aminoacidi (legame carbo-aminico):

L-alanina

- Acido D- glutammino

- L-lisina se gram + (o acido diaminopimelico se gram - )

- D-alanina

-

Per passare dalla L-alanina alla D-alanina è necessario l'intervento dell'enzima racemasi.

Com è fatta la parete?

L'esagono blu sarà il NAM, quello verde è il NAG, le palline sono i peptidi, il rosso sono i ponti

interpeptidici. I legami crociati si formano tra ….

Unità base (monomero) di questo etero polimero è costituita da un disaccaride legato ad un

tetrapeptide. Lezione 3 Pagina 9

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venerdì 1 ottobre 2021 11:12

Il NAM è diverso dal NAG per la presenza di un residuo di acido D-lattico legato con legame etere al

C3 del glucosio, cui è legato un tetrapeptide formato da aminoacidi D e L alternati.

La composizione del tetrapeptide è variabile, ma quella più frequentemente osservata è:

1) L-alanina

2) Acido D-glutammico

3) Acido meso-diamino pimelico (DAP)

4) D- alanina

Alcuni aa non sono usati nella sintesi proteica ribosomale (D-aa e DAP) e sono quindi

esclusivamente sintetizzati per la costituzione del peptidoglicano.

Gli aminoacidi D conferiscono la resistenza alle proteasi (enzimi proteolitici), che si trovano nei

nostri fluidi biologici e che intaccherebbero la parete.

I legami beta ( 1->4) formano catene lineari di varia lunghezza da specie a specie; come avviene il

legame tra varie catene? I filamenti di glicano adiacenti sono interconnessi da legami tra i

tetrapeptidi; nella maggior parte dei casi si formano in una posizione bel precisa: tra il gruppo

carbossilico della D-alanina in posizione 4 di un tetrapeptide, e il gruppo aminico di un DAP (acido….)

in posizione 3 di un tetrapeptide del fi