Appunti Microbiologia( cellula, antibiotici, respirazioni, fermentazioni ecc..)

Capitolo 2: La cellula

Cellule eucariote e procariote

Le cellule eucariote hanno dimensioni maggiori rispetto alle procariote. Nei eucarioti i cromosomi sono all'interno di un nucleo definito da una membrana nucleare, mentre nei procarioti non c'è membrana nucleare e non c'è nucleo definito. Il materiale genetico in una cellula procariota è costituito da cromosoma ed è a diretto contatto con il citoplasma, formando una struttura chiamata nucleoide. La divisione cellulare in procarioti avviene per scissione binaria, mentre nei eucarioti attraverso mitosi. Nei procarioti non sono presenti processi di zigosi e meiosi.

Classificazione e caratteristiche dei procarioti

I procarioti si distinguono in: Bacteria e Archea. I batteri presentano dimensioni di 0.2 a 2 µm e sono per lo più unicellulari. Il batterio è determinato da una parete mureinica o sacculo costituito dal peptidoglicano che avvolge la cellula. Nel citoscheletro del batterio è presente la proteina FtsZ, simile alla tubulina. I batteri a forma di bastoncello contengono la proteina MrcB, simile ad actina, necessaria alla curvatura della cellula.

Distinzione tra batteri Gram + e Gram -

I Bacteria si distinguono in Gram + e Gram -. I Gram + sono privi di membrana esterna e la parete presenta uno spesso strato di peptidoglicano, mentre i Gram - presentano una membrana esterna con doppio strato lipidico e uno spazio tra le due membrane detto periplasma, in cui si trova uno strato sottile di peptidoglicano, un polimero formato da aminozuccheri e aminoacidi.

Membrana plasmatica e trasduzione del segnale

La membrana plasmatica è una barriera permeabile tra ambiente extracellulare e citoplasma. È al livello di questa struttura che nei procarioti avvengono respirazione e fotosintesi. Le cellule sono in grado di rispondere ai cambiamenti delle condizioni ambientali grazie ai sistemi di trasduzione del segnale. I segnali possono essere di tipo fisico (luce, temperatura) o fisico-chimico (osmolarità, disponibilità di H₂O, nutrienti, molecole tossiche).

Meccanismo d'azione degli antibiotici

È sede di processi biologici e per tale motivo funziona da bersaglio molecolare su cui agiscono alcuni farmaci antimicrobici come: polimixine, lipopeptidi, polieni.

• Polimixine: meccanismo d'azione: antibiotici formati da un anello peptidico e da una parte lipofila. Agiscono interagendo con i fosfolipidi della membrana citoplasmatica, aumentando la permeabilità cellulare e alterando l'integrità osmotica. Meccanismi di resistenza: la resistenza si basa su meccanismi riguardanti l'alterazione della membrana esterna nei batteri G-. Resistenze rare.
• Lipopeptidi: meccanismo d'azione: agisce principalmente sulla membrana citoplasmatica batterica. Forma micelle e in seguito le micelle si dissociano e può inserire la sua coda lipofila in membrana creando dei pori e causando una depolarizzazione con morte cellulare. Meccanismi di resistenza: resistenza rara e riguarda un'alterazione dell'espressione genetica con cambiamento di cariche elettriche impedendo legame tra target e antibiotico.
• Polieni: agiscono formando steroli, attivi nei confronti di cellule eucariote. L'interazione con steroli causa un aumento della membrana. Usati per trattamento di infezioni fungine. Il maggior rappresentante è l'anfotericina B. Meccanismi d'azione rari.

Struttura della membrana citoplasmatica

La membrana citoplasmatica di bacteria e eukarya è costituita da fosfolipidi in cui la testa polare è rappresentata da una molecola di D-glicerolo 3-fosfato e la coda da due molecole di acidi grassi. Gli acidi grassi presenti nei fosfolipidi sono in maggioranza saturi. In membrane citoplasmatiche eucariote sono presenti steroli, lipidi caratterizzati da un nucleo a 4 anelli aromatici. Nella maggior parte dei bacteria sono presenti opanoidi, molecole simili a steroli. Il diplotene è un opanoide, in Archea non sono presenti.

Proteine della membrana citoplasmatica

Le membrane citoplasmatiche dei batteri contengono numerosi tipi di proteine: proteine integrali di membrana (insolubili in soluzioni acquose e non estraibili facilmente), proteine periferiche (più facilmente rimovibili). Le lipoproteine: proteine ancorate alla membrana citoplasmatica. Si trovano in batteri G+ esposte verso l'esterno della cellula, sia in G-, dove sono esposte verso il periplasma.

Membrana plasmatica in Archea

La membrana plasmatica in Archea viene prodotta con L-glicerolo, catene laterali alifatiche costituite da isoprenoidi e non acidi grassi. I lipidi possono essere dietri o tetraeteri. I primi costituiti da due catene alifatiche con 20 atomi di C legati a un'estremità a una molecola di glicerolo e i secondi costituiti da due catene con 40 atomi di C, legati a ciascuna delle due estremità a due molecole di glicerolo.

Differenze tra lipidi di Bacteria e Archea

A differenza dei lipidi dei bacteria che ad alte temperature diventano più permeabili all'H₂O e ai protoni, i lipidi degli Archea formano un'implacatura rigida che mantiene impermeabile ad alte temperature.

Peptidi antimicrobici

Peptidi anionici: piccole dimensioni, alta concentrazione di acido glutamico, attivi su G- e G+. Peptidi lineari cationici: dimensioni non maggiori di 40 aminoacidi e non hanno cisteina. Peptidi cationici con alte concentrazioni di uno specifico aminoacido (prolina). Peptidi anionici e cationici che contengono cisteina. Peptidi anionici e cationici: caratterizzati da frammenti di proteine più grandi.

Batteriocine

Batteriocine: gruppo principale di peptidi, prodotti da G- e G+, con attività batteriostatica o battericida. Classificate in tre classi: lantibiotici, classe eterogenea di piccoli peptidi e batteriolisine con dimensioni più grandi, come l'esempio di enterolisina A.

Parete batterica

Sia G- che G+ possiedono il sacculo che conferisce rigidità e forma e avvolge la cellula formando un esoscheletro cellulare. Essa è costituita da un peptidoglicano o mureina. Il peptidoglicano ha una struttura reticolare e la sua unità base è costituita da un disaccaride legato a un tetrapeptide formato da catene glicaniche con due aminozuccheri: NAG e NAM. La parete può essere indebolita o rimossa con trattamento antibiotico o con enzimi come il lisozima.

Condizioni ambientali e parete batterica

Se le cellule si trovano in ambiente isotonico si ottengono cellule prive di parete dette protoplasti in G+ e sferoplasto in G-. In ambiente ipotonico si verifica lisi cellulare e conseguente morte. In ambiente ipertonico le cellule collassano per fuoriuscita di H₂O.

Biosintesi del peptidoglicano

La biosintesi del peptidoglicano si svolge in tre diversi comparti: sintesi unità monomerica, polimerizzazione e transpeptidazione. Nel citoplasma si svolgono quattro tappe che portano alla formazione dei due aminozuccheri: NAM e NAG legati a UDP a formare NAG-UDP e NAM-UDP. La sintesi dell'UDP-NAG nel citoplasma avviene a partire dal fruttosio-6-P e UTP. Mentre la sintesi dell'UDP-NAM è catalizzata da Mur A e Mur B (enzimi). Questi enzimi catalizzano il legame dell'alanina al residuo carbossilico dell'UDP-NAM.

Trasporto e polimerizzazione del peptidoglicano

Il precursore del glicano tetrapeptide è sintetizzato come glicano pentapeptide. Una volta sintetizzati i precursori saranno trasportati all'esterno della membrana citoplasmatica. Il trasporto dei precursori avviene ad opera del bactoprenolo, trasportatore lipidico. Il NAM-pentapeptide si lega al bactoprenolo formando il lipide 1, successivamente verrà legata una molecola di NAG a formare il lipide 2. Viene trasportato il monomero di glicano sulla faccia esterna e qui avviene la polimerizzazione dei monomeri. Infine si forma il legame peptidico tra catena pentapeptidica del nuovo monomero e tetrapeptide di una catena di glicano adiacente. Questa reazione è catalizzata da enzimi detti transpeptidasi. Essi hanno un'affinità forte per gli antibiotici Beta-lattamici, e ciò avviene a causa della somiglianza strutturale tra antibiotici Beta-lattamici e il dipeptide D-ala-D-ala. Durante l'accrescimento della cellula anche la parete aumenterà la propria estensione.

Parete Gram +

La parete Gram + è costituita da uno spesso strato di peptidoglicano, che costituisce il 40% del peso secco della cellula. Si estende per uno spessore di circa 50 nm intorno alla membrana citoplasmatica separata da questa da uno spazio periplasmatico di 20 nm. La parete contiene acidi teicoici, lipoteicoici e teicuronici. Gli acidi teicoici sono polimeri anionici e costituiscono fino al 60% della parete cellulare. Controllano il movimento degli ioni e l'attività delle autolisine. I teicoici e i teicuronici sono presenti in ugual proporzione nella parete di alcuni batteri.

Colorazione di Gram

Nel 1884 Gram mise a punto la colorazione più usata in microbiologia che distingue i Gram+ dai Gram- con la colorazione cristal violetto. Esso interagisce con lo ioduro in soluzione acquosa formando un complesso insolubile che precipita nel citoplasma della cellula. I Gram + appaiono blu-viola al microscopio, i Gram- si decolorano con i lavaggi di etanolo. Per visualizzare i Gram- al microscopio si ricorre a una colorazione con safranina colorandolo di rosso-rosa senza alterare i G+.

Parete Gram -

La parete Gram - è dotata di un sottile strato di peptidoglicano circondato da una membrana esterna a doppio strato lipidico. Lo spazio compreso tra membrana esterna e interna, in cui si trova anche il sottile strato di peptidoglicano, prende il nome di periplasma. È un compartimento acquoso che costituisce dal 20% al 40% del volume totale della cellula. Le proteine periplasmatiche sono coinvolte in numerose funzioni: acquisizione di nutrienti, generazione di energia, sintesi del peptidoglicano, degradazione o inattivazione di antibiotici e altre sostanze tossiche. Il ripiegamento delle proteine che devono essere trasportate alla membrana esterna viene garantito dalla presenza delle chaperonine periplasmatiche: una classe di proteine che aiutano il ripiegamento di altre proteine in diversi comparti cellulari, utilizzando l'energia durante l'idrolisi di ATP.

Membrana esterna nei Gram -

La cellula dei G- è circondata dalla membrana esterna, contenente fosfolipidi nel foglietto interno e lipopolisaccaride nel foglietto esterno. Nel lipopolisaccaride ci sono tre porzioni: uno saccarolipide detto lipide A, una regione polisaccaridica detta nocciolo A e una catena polisaccaridica lunga detta antigene 0. Al lipide A è legato il core, suddiviso in interno ed esterno. La membrana esterna, grazie alla composizione del lipopolisaccaride, rappresenta una barriera di permeabilità in grado di impedire l'ingresso di sali biliari e altri composti tossici. La catena laterale 0 è in grado di indurre la produzione di anticorpi specifici nell'ospite, mentre il lipide A è in grado di attivare l'immunità innata dell'ospite. La diffusione nel periplasma di ioni e piccole molecole è possibile grazie alle porine (proteine canale). Le dimensioni del canale variano a seconda della porina considerata. Oltre a canali non specifici, in membrana sono presenti anche porine che consentono la diffusione di specifici nutrienti (es: LamB che permette l'ingresso di maltosio e maltodestrina in E. coli). Un'altra classe di proteine sono le lipoproteine: funzioni: trasporto, resistenza ad antibiotici. In E. coli le lipoproteine sono ancorate al lato periplasmatico della membrana esterna, in G- sono presenti anche sul lato esterno: Lpp una delle lipoproteine più abbondanti in E.coli ed è costituita da 58 aminoacidi.

Micoplasmi

I micoplasmi sono batteri Gram + senza parete, incapaci di sintetizzare peptidoglicano e quindi privi di parete. Sono circondati solo da membrana citoplasmatica di tipo lipoproteica ed è ricca di steroli. Resistenti a lisi osmotica. Le cellule sono pleomorfe: possono anche essere molto piccole, filamentose e si riproducono per gemmazione, frammentazione, scissione binaria. Solitamente immobili. Richiedono terreni complessi, di colesterolo e acidi grassi oltre che vitamine, aminoacidi e acidi nucleici. Maggior responsabili di patogeni: Mycoplasma pneumoniae che causa polmonite.

Clamide

Clamide: batteri Gram - con parete mureinica, tutti patogeni per l'uomo. Es: psittacosi, l'agente del tracoma, malattia dell'occhio. Una cellula piccola (200-300 nm) e densa, il corpo elementare è la forma infettante e resistente all'essiccamento. Il corpo reticolare, più grande (600-1000 nm), ha citosol denso ed è metabolicamente attivo. Sono trasmesse da insetti, per via aerea o per contatti diretti interpersonali. Ciclo dimorfico: ciclo vitale che richiede 48h per compiersi.

Biogenesi della membrana esterna

I sistemi responsabili della traslocazione delle proteine attraverso la membrana esterna sono due: traslocazione Sec e sistema Tat. Il primo trasporta proteine non ancora ripiegate in struttura terziaria, il secondo trasporta proteine già state ripiegate nel citoplasma. Tutte le proteine della membrana esterna trasportate da Sec, dopo essere state trasportate attraverso la membrana interna, devono attraversare lo spazio periplasmatico e le chaperonine assistono.

Trasporto di lipoproteine

Nella membrana esterna, oltre alle proteine, possono essere presenti lipoproteine. Esse possono trovarsi anche nella membrana citoplasmatica, dove vengono sintetizzate nel citoplasma della cellula, non vengono correttamente ripiegate perciò sono riconosciute dal sistema Sec che permette loro di attraversare la membrana citoplasmatica e arrivare nel periplasma. Il segnale che stabilisce se una lipoproteina deve rimanere nella membrana citoplasmatica oppure nella membrana esterna è un residuo aminoacido. Se nella porzione +2 della proteina è presente un residuo aspartico indica che è una lipoproteina di membrana interna, qualsiasi altro aminoacido deve andare in membrana esterna. Possiedono una sequenza segnale all'N-terminale. Nel primo caso, poiché una proteina deve rimanere nella membrana interna una volta che è stata trasportata nel periplasma, rimane legata alla membrana cellulare. Alle altre succede che questa proteina deve essere trasportata e inserita nella membrana esterna.

Sistema di trasporto LOL e LPS

Sono coinvolte una serie di proteine caratterizzate dalle 3 lettere LOL ABCDE. La prima proteina coinvolta è il complesso multiproteico LOLCDE. È coinvolto nell'idrolisi ATP. La lipoproteina interagisce con il complesso, idrolizza ATP e questo fa sì che la lipoproteina interagisca con un'altra proteina del complesso situata nel periplasma e si forma così il complesso LolA. La lipoproteina viene poi trasferita ad un'altra proteina del sistema, ancorata al lato interno, LolB della membrana esterna e successivamente la nostra lipoproteina viene trasferita a quello che è un canale che la inserisce nella sua posizione finale, cioè la membrana esterna. LolA e LolB aiutano il passaggio della lipoproteina nel periplasma. Quando LolA cede la lipoproteina al recettore localizzato nella membrana esterna, lavora in modo circolare.

Trasporto del lipopolisaccaride

I tre componenti del LPS sono sintetizzati nel citoplasma della cellula batterica: lipide A, core saccaridico, antigene 0. La via di biosintesi del LPS avviene in parte nel citoplasma e in parte nel foglietto interno della membrana citoplasmatica. L'antigene 0 è costituito da residui di peptidi; ogni residuo è trasportato attraverso un trasportatore, ma entra in gioco il bactoprenolo che ha la funzione di trasportare i precursori dell'antigene 0 dal citoplasma al periplasma. Il lipide A viene sintetizzato nel citoplasma e viene trasportato nel periplasma attraverso una proteina che appartiene alla cosiddetta famiglia dei trasportatori ABC = ATP Binding Cassette. Nel periplasma a questo punto troviamo antigene 0 e lipide A già legato al core-polisaccaridico, nel periplasma si formerà il lipopolisaccaride nella sua completezza e dopo raggiungerà la membrana esterna e anche in questo caso esiste un complesso multiproteico che è Lpt = trasporto del lipopolisaccaride. Lpt coinvolge diverse proteine, le prime coinvolte sono localizzate nella membrana citoplasmatica responsabili dell'idrolisi ATP, forniscono energia affinché il LPS venga trasportato attraverso l'intervento di tutta questa serie di proteine alla membrana esterna dei batteri gram -.

Altri tipi di parete nei Bacteria

Alcuni tipi di batteri appartenenti a G+ si colorano in modo diverso a seconda della fase di crescita. Es: Actinomyces, Mycobacterium. Gli ultimi sono costituiti da parete cellulare spessa insolitamente, ricca di componenti cerose e da una struttura costituita da due strati: strato basale e da una struttura più esterna costituita da uno strato di acidi micolici e uno di cere. La disposizione di acidi micolici e cere forma la membrana esterna. Lo strato basale è costituito da un polimero di peptidoglicano e arabinogalattano (polisaccaride complesso con residui di zucchero). Acidi micolici acidi grassi contribuiscono alla scarsa fluidità della membrana esterna micobatterica, situati nel foglietto interno della membrana esterna. Cere situate nel foglietto esterno con catene carboniose molto lunghe e ramificate, in membrana esterna sono presenti anche fosfolipidi.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

I coloranti tradizionali non oltrepassano la barriera impermeabile della loro parete cellulare. Verso la fine dell'800 Ziehl e Neelsen introducono un nuovo metodo di colorazione per i micobatteri. Prevede un trattamento a caldo dei batteri con una soluzione di fucsina e fenolo in etanolo. A temperature elevate il colorante è solubile nei lipidi di parete dei micobatteri e può penetrare nel citoplasma. In seguito, decolorazione con alcool acido a temperatura ambiente. Infine si effettua una colorazione di contrasto con blu di metilene, non assorbito dai micobatteri.

Micobatteri

I micobatteri sono cellule in determinate condizioni di crescita che hanno aspetto filamentoso simile a ife, senza formare veri e propri miceli. I micobatteri sono aerobi obbligati, immobili, sprovvisti da capsula e mesofili. Sono eterotrofi e in gran parte di origine ambientale. Non patogeni, capaci di degradare composti organici e crescere su terreni di coltura rapidamente. Micobatteri patogeni distinti in diverse categorie.