Appunti istologia Icaro

La sostanza vivente e i livelli di organizzazione

La sostanza vivente esiste in diversi livelli di organizzazione: la cellula è l'unità morfologica e fisiologica fondamentale degli organismi viventi, più cellule insieme formano i tessuti, più tessuti formano gli organi, e più organi formano gli apparati.

Istologia: lo studio dei tessuti

L'istologia è una materia morfologica che si occupa dei tessuti, ovvero delle associazioni di cellule che lavorano in cooperazione (tessuto). L'istologia ha il compito di studiare e conoscere l'organismo sotto il profilo morfologico. Infatti, Ruffini diceva: "La forma è l'immagine plastica della funzione"; cioè l'analisi della forma fornisce informazioni riguardo alla funzione.

Misure di lunghezza in biologia

In biologia vengono usate misure di lunghezza come il micrometro µm (1/1000 mm) e il nanometro nm (1/1000 µm). Queste sono misure molto piccole e gli organismi che hanno dimensioni con queste unità di misura non sono visibili ad occhio nudo, in quanto il suo potere risolutivo è di 0.1 d.

Microscopio ottico e elettronico

Il potere risolutivo o limite di risoluzione (d) è la distanza minima tra due punti vicini percepiti come distanti. Per questo motivo viene impiegato l'uso del microscopio luce o ottico che ha un potere risolutivo di 0,2 µm. Il microscopio luce funziona grazie a un fascio di luce che attraversa la struttura da studiare, e l'immagine, passando per una serie di lenti, giunge ingrandita all'occhio dell'osservatore.

Anche il microscopio luce, come l'occhio umano, tuttavia ha un limite di risoluzione definito dalla formula di Abbe. Lo strumento più importante per lo studio della morfologia ultrastrutturale o submicroscopica dei tessuti è il microscopio elettronico, dove il fascio di luce è sostituito da un fascio di elettroni accelerati sottovuoto. Il microscopio elettronico proietta un cono d'ombra e si vede quindi un'immagine in bianco e nero, dove i punti più scuri corrispondono ai punti del preparato più densi ed ha un limite di risoluzione pari a 0,4 nm.

Esistono due tipi di microscopio elettronico: quello a trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM). La differenza tra i due microscopi consiste nel fatto che quello a trasmissione fornisce un'immagine che deriva dall'attraversamento delle strutture biologiche da parte degli elettroni e da un'immagine superficiale tridimensionale, mentre quello a scansione forma un'immagine riflessa derivante dal rimbalzare degli elettroni sulla superficie del campione in osservazione.

Esiste anche un microscopio luce confocale che ricostruisce l'immagine rendendola nitida.

Scoperte e premi Nobel

Nel 2017, il premio Nobel venne dato agli inventori della microscopia crioelettronica (Dubochet, Frank e Handerson) che rende possibile visualizzare biomolecole dopo averle vetrificate. In questo modo viene preservata la loro forma naturale. Quest'anno il premio Nobel è stato dato a due studiose che hanno scoperto il cosiddetto CRISPR che corregge il genoma punto per punto.

Preparazione dei campioni per il microscopio

Il campione per essere visibile al microscopio deve essere molto sottile da essere attraversato dai fasci di luce. Inoltre, le cellule dei tessuti non possono sopravvivere a lungo al di fuori dell'organismo da cui sono state prelevate sia perché non sussistono le corrette condizioni ambientali, sia perché i tessuti vengono invasi da microrganismi presenti nell'ambiente. Si instaura quindi un processo di progressiva alterazione e degenerazione che si conclude con la decomposizione, dunque in questo modo si creano degli artefatti, cioè qualcosa di non vero.

Sono state pertanto messe a punto una serie di procedure, definite con il termine di fissazione, che tendono a conservare, fissare appunto, la struttura di campioni biologici mantenendo inalterata la loro organizzazione originaria. La fissazione deve essere effettuata immediatamente dopo il prelievo dell'organismo o comunque il più precocemente possibile e prima di qualsiasi altro trattamento. Questo processo implica necessariamente la morte della cellula in maniera rapida e la denaturazione delle proteine.

Ci sono molteplici fissativi tra i quali i più usati sono gli alcoli etilico e metilico e le aldeidi (formaldeide in particolare per microscopio ottico e gluteraldeide per la microscopia elettronica). Quest'ultima forma legami crociati tra catene proteiche adiacenti così immobilizzandole e fissando in un reticolo le posizioni reciproche delle molecole stesse. Gli alcoli, invece, entrano nella cellula e si sostituiscono all'acqua. Il congelamento rappresenta un sistema alternativo per la conservazione del materiale biologico. Il vantaggio rispetto ai fissativi chimici consiste nella rapidità e nel maggiore rispetto dell'integrità delle singole molecole, lo svantaggio principale è invece rappresentato dal danneggiamento dell'organizzazione complessiva; infatti, il passaggio dallo stato liquido a quello solido produce un aumento di volume dell'acqua attraverso la formazione di cristalli.

Il campione per essere visibile al microscopio deve essere tagliato in fette sottilissime e ciò viene fatto impiegando uno strumento costosissimo chiamato microtomo, affettatrici che sezionano in modo uniforme il preparato (M. O. 4-10 µm e M. E. Circa 10 µm).

Prima di sezionare il campione bisogna indurirlo attraverso l'inclusione. Il metodo più utilizzato è quello della paraffina liquida che è liquida a partire dai 55° e solidifica a temperatura ambiente. Infatti, in laboratorio ci sono delle stufette che mantengono liquida la paraffina. Si fissa il vetrino e si include la paraffina in stufa e si lascia solidificare a temperatura ambiente. Per fare l'inclusione è necessario disidratare il campione immergendolo in soluzioni etanolo-acqua. La paraffina però non è abbastanza dura per fette abbastanza sottili da vedere al microscopio elettronico, dunque si usa una resina particolare epossidica che si solidifica a caldo a circa 60°.

Nel caso in cui viene utilizzato come metodo di fissazione il congelamento, si usa una particolare affettatrice chiamata criostato che mantiene la temperatura fredda.

Colorazione dei tessuti

I tessuti sono normalmente privi di colore in quanto sono costituiti dal 70% di acqua che è trasparente ed attraversabile dai raggi di luce e dunque invisibili al microscopio. Per questo motivo sono stati individuati una serie di sostanze in grado di colorare i tessuti.

Il sistema di colorazione più usato è quello dell'ematossilina, colorante blu basico (che colora le sostanze basofile), mentre l'eosina è un colorante acido rosso (che colora le sostanze acidofile). Risultano basofile le sostanze che di per sé sono acide, mentre risultano acidofile le sostanze che sono basiche.

Alcune sostanze come i glucidi e i lipidi invece non si colorano né di rosso né di blu. Esistono delle colorazioni specifiche per lipidi (rosso Congo, Sudan Nero), glucidi (PAS), proteine (Millon) e DNA (Feulgen). La PAS, Periodic Acid-shift, è utilizzata per gli zuccheri o glucidi; l'acido periodico ossida formando aldeidi che si colorano di magenta grazie al reattivo di shift.

Esiste anche l'immunoistochimica che consente l'identificazione dei cellulari e tissutali come antigeni utilizzando gli anticorpi, cioè marcando gli anticorpi si vede il legame tra l'anticorpo specifico per un antigene attraverso dei fluorocromi o morfologica di enzimi.

La cellula: definizione e teoria cellulare

Il termine "cellula" fu introdotto nel 1670 da Hooke, che grazie allo studio di una fetta sottile di sughero osservò che questa era costituita da delle "cellette". La definizione ultima di cellula è stata attribuita da Theodor Schwann, un biologo tedesco che nel 1839 sviluppò la teoria cellulare: "la cellula è l'unità strutturale e funzionale di ogni organismo vivente: ogni cellula ha origine da un'altra cellula. La cellula è la più piccola struttura capace di vita autonoma."

Differenziazione cellulare

Le cellule acquisiscono la forma quando acquisiscono anche la loro funzione e dunque si differenziano. Infatti, il differenziamento è definito come un'attivazione di geni specifici. Le cellule embrionali, ovvero i blastomeri, inizialmente sono tutte uguali e sono dette cellule totipotenti, cioè possono diventare qualsiasi tipo di cellule attivando geni specifici, in quanto non sono per niente differenziate. Più una cellula è differenziata meno tende a dividersi, ovvero ad andare incontro a mitosi. Ad esempio, il neurone è una cellula molto differenziata e non va incontro a mitosi, o gli eritrociti che non possono nemmeno dividersi poiché non hanno nucleo. Essa è costituita da tre importanti compartimenti: membrana plasmatica, citoplasma e nucleo.

Struttura e funzione della membrana cellulare

La membrana plasmatica è anche detta membrana cellulare o plasmalemma e costituisce l'involucro della cellula. Per studiare la membrana cellulare, gli studiosi si sono avvalsi degli eritrociti. Se queste cellule vengono inserite in soluzioni ipotoniche, l'acqua entra nella cellula che si gonfia fino ad esplodere, e l'emoglobina precipita sul fondo, mentre le membrane più leggere trasparenti tendono a galleggiare sulla superficie della cellula e per questo vengono chiamate "ghost".

La membrana plasmatica è costituita da un modello a mosaico fluido e ha uno spessore di 8 nm e si vede solo al microscopio elettronico come un doppio strato elettrondenso di circa 2,5 nm, mentre lo strato chiaro interposto è di circa 3 nm. La membrana è glicolipoproteica, cioè costituita da una parte lipidica formata da fosfolipidi disposti in un doppio strato, con le teste polari disposte verso l'esterno e le code apolari o idrofobe disposte verso l'interno; da una parte proteica. Le proteine possono essere estrinseche o periferiche, se si trovano sul versante esterno, intrinseche o integrali se attraversano in parte la membrana, e proteine di transmembrana se attraversano da parte a parte la membrana; e infine da una parte glucidica che forma il cosiddetto "glicocalice".

I glucidi si trovano sul versante extracellulare ed hanno la funzione di comunicazione tra cellula e cellula e riconoscimento, cioè di recettori o trasmettitori di segnali, sono gli antigeni di superficie come quelli dei gruppi sanguigni presenti sulle membrane degli eritrociti. Alla temperatura di 37° i fosfolipidi sono fluidi e le proteine sono libere di muoversi all'interno di "zattere lipidiche", dove il doppio strato fosfolipidico è più denso dal resto della membrana e dove le proteine si possono muovere maggiormente.

Sul versante citoplasmatico ci sono delle strutture filamentose che sono delle proteine che costituiscono il cosiddetto feltro proteico che nei globuli rossi si chiama spettrina, presente sul versante citoplasmatico della membrana, sia in forma granulare che in forma filamentosa. La spettrina è responsabile della forma biconcava discoidale dei globuli rossi che comporta un aumento di superficie a parità di volume, che serve ovviamente al trasporto dei gas respiratori. La spettrina inoltre è responsabile della plasticità degli eritrociti che devono attraversare i capillari, che sono molto sottili.

Nel tessuto muscolare striato invece la proteina del feltro proteico è rappresentata dalla distrofina che aggancia i filamenti contrattili alla membrana stessa; nei distrofici manca la proteina e dopo svariate contrazioni la membrana si spacca e ciò comporta la morte della cellula muscolare che viene rimpiazzata da connettivo fibroso che è meno elastica. Il glicocalice protegge rispetto a sollecitazioni chimiche ed ha funzione di concentrare attorno alla cellula delle molecole così da esser facilmente fruibili alla cellula, mettendo in comunicazione le cellule e la matrice.

Ci sono molecole come l'acqua, gas respiratori (azoto, ossigeno e anidride carbonica) e sostanze liposolubili (alcool che ad alte concentrazioni altera l'equilibrio chimico della cellula o ormoni steroidi che sono lipidici e liposolubili o il colesterolo che inserendosi tra i fosfolipidi diminuisce la fluidità di membrana) che attraversano facilmente la membrana. La maggior parte dell'acqua passa attraverso delle proteine di canale che prendono il nome di acquaporine; per le altre sostanze intervengono le proteine di membrana che sono proteine transmembrana intrinseche, che formando un canale nella membrana mettono in comunicazione l'esterno con l'interno, e le sostanze si muovono secondo gradiente di concentrazione.

I canali possono essere sempre aperti o con un meccanismo di apertura che possono essere a voltaggio (ad esempio nelle sinapsi) oppure a controllo di ligando che si aprono quando una proteina si lega a una molecola oppure a controllo meccanico che si aprono in seguito a una stimolazione, o i trasportatori di membrana che sono detti carriers o permeasi. La molecola da trasportare si lega al trasportatore, che si apre su un versante della membrana dove si lega alle molecole e subisce una modificazione conformazionale e si apre sul versante opposto rilasciando la molecola (flip-flop).

Questi carriers possono agire secondo gradiente di concentrazione senza dispendio energetico o contro gradiente di concentrazione; in questo caso avviene l'idrolisi di ATP. Sono un esempio di carriers contro gradiente di concentrazione le pompe di membrana come la pompa sodio potassio che immette 2 ioni di potassio buttando fuori 3 ioni di sodio, negativizzando l'interno della cellula. Esistono altre pompe di membrana come la ABC (ATP-binding cassette) che sono alla base della resistenza di cellule tumorali ai farmaci dovuto a sovraespressione di queste pompe. L'iperstimolazione della pompa ABC causa il colera portando diarrea e disidratazione, mentre un'ipostimolazione porta alla formazione della fibrosi cistica, poiché in condizioni normali la pompa trasporta cloro nel lume delle vie aeree, richiamando acqua e sodio che fluidificano il muco; in questa patologia ciò non avviene e il muco rimane denso e non viene espulso diventando sede di infiammazioni.

Ci sono inoltre altri tipi di scambio, ad esempio l'endocitosi e l'esocitosi che fanno sì che la membrana sia in continuo riciclaggio. L'endocitosi avviene quando un corpo estraneo tocca la membrana e questa crea delle invaginazioni immettendo il corpo estraneo all'interno della cellula. Esistono 3 modalità di endocitosi: endocitosi mediata da recettore che di solito è la clatrina ed è specifiche per alcune molecole (LDL o transferrina); pinocitosi che non è specifica e permette l'ingresso di sostanze liquide, e la fagocitosi che riguarda sostanze solide piuttosto grandi e sono dotate di fagocitosi i macrofagi.

Il citoplasma e gli organuli cellulari

Il citoplasma è costituito da due componenti: una componente omogenea e amorfa chiamata matrice citoplasmatica o ialoplasma o citosol, e una componente morfologicamente definita che costituisce gli organuli cellulari indispensabili alla vita della cellula. Il citosol è una soluzione acquosa della consistenza di un gel e contiene una serie di enzimi che svolgono delle reazioni biosintetiche della cellula e intervengono nel metabolismo cellulare. Inoltre, sono presenti le proteine citoscheletriche e diverse classi di RNA responsabili della sintesi proteica. Immersi nel citosol ci sono vari organuli cellulari che sono:

• Reticolo endoplasmatico liscio (REL): al microscopio elettronico appare costituito da sezioni tubulari variamente anastomizzati, fatte da membrane simili alla membrana cellulare; infatti, il reticolo liscio non si colora nei comuni preparati perché costituito da lipidi. Esso è sede di sintesi dei lipidi, per questo è abbondante nella corticale del surrene in cui avviene la sintesi degli ormoni corticosteroidi. Inoltre, partecipa al metabolismo del glicogeno per dare molecole di glucosio con la glucosio 6 fosfatasi ed è particolarmente presente nel fegato, dove inoltre il REL svolge la funzione di detossificazione. Inoltre, è sede di immagazzinamento di ioni calcio, rilasciandolo al momento opportuno per la contrazione muscolare. Infatti, è particolarmente presente nel tessuto muscolare striato, dove prende il nome di reticolo sarcoplasmatico.
• Reticolo endoplasmatico granulare (REG): caratterizzato dalla presenza di RNA che lo rende basofilo in quanto l'RNA è un acido che si colora di rosso. L'RNA è presente nei ribosomi (20 nm di diametro) che caratterizzano la granulosità del reticolo endoplasmatico granulare. Queste possono essere liberi, che hanno un aspetto di spirale che sono tenute insieme per cui non sono isolati, ma sono poliribosomi legati da RNA messaggero; oppure possono essere legati al REG e si trovano sul versante esterno della membrana del reticolo disposte a spirale.
• I Ribosomi del REL e del RER: sede della sintesi proteica, mantenendo disteso il filamento di mRNA e forniscono gli enzimi affinché possa avvenire il legame peptidico. Le proteine che vengono prodotte nel RER vengono esocitate per gemmazione, mentre le proteine prodotte dal REL restano all'interno della cellula stessa per uso della cellula. Un esempio di proteine provenienti dal RER sono gli ormoni, quindi le ghiandole hanno un'abbondante presenza di RER, mentre le cellule che vanno incontro a divisione mitotica, come l'epidermide, vi è un'elevata presenza di REL che formano proteine che restano nella cellula e sono utili per la divisione.

Apparato del Golgi: nei normali preparati istologici non si colora né di rosso né di blu. Tuttavia, Camillo Golgi lo ha scoperto nel 1898, prima dell'avvento del microscopio ottico, utilizzando gli stessi principi dello sviluppo fotografico, applicando l'impregnazione cromoargentica. Al microscopio elettronico, l'apparato risulta costituito da cisterne appiattite, impilate l'una sull'altra. Inoltre, questo apparato mostra un'evidente polarità strutturale; infatti, vi è un polo convesso chiamato polo cis o polo formativo, contrassegnato da micro vescicole, mentre al polo opposto, ovvero il polo trans o polo maturativo, contrassegnato da macro vescicole.