Appunti Farmacologia applicata

Farmacologia applicata

È un esame orale, due domande per i due macroargomenti, colloquio basato su esempi con proposte, non mero studio. Il corso si articola in due macro argomenti: la farmacogenetica e la terapia genica con le nanotecnologie applicate alla delivery dei farmaci.

Farmacogenetica

È una disciplina recente, ampliata dal sequenziamento completo del genoma umano. La definizione proposta dall'organo europeo di valutazione delle terapie farmacologiche è la seguente: “è lo studio delle variazioni inter-individuali nella sequenza del DNA in relazione alla risposta ai farmaci, cerca di correlare l'assetto genetico di un individuo con la risposta a uno specifico trattamento farmacologico. È lo studio di variazioni tra individui. La necessità di correlare l'assetto genetico e l'effetto farmacologico è nata da delle evidenze: esiste un’estesa variabilità individuale nella risposta ai farmaci, in termini di efficacia e di tollerabilità → individui diversi rispondono in modo diverso allo stesso farmaco somministrato alla stessa dose (= stessa quantità) e con la stessa posologia (= durata del trattamento).

A parità di diagnosi, c'è un'enorme variabilità di efficacia ossia l'intensità dell'effetto è diversa in soggetti differenti, quanto è intensa la risposta a questa dose e a questa posologia: si prende un analgesico, a un individuo la soglia del dolore scende, a seguito del trattamento, dell'80%, a un altro solo del 20%. Per quanto riguarda la tollerabilità, significa che nessun farmaco è esente dagli effetti collaterali, perciò, la dose e la posologia sono scelte in base all'efficacia e alla tollerabilità dell'organismo, ossia la natura che la loro intensità degli effetti collaterali è tollerabile dall'organismo, per questo, non si parla di effetti tossici, ma collaterali, ossia che sono tollerabili dall'organismo, producendo degli effetti non desiderati.

Gli effetti collaterali sono molteplici, ci sono quelli molto frequenti, rari etc. Quando si parla di variabilità individuale, significa che questi individui non tollerano l'effetto collaterale, che normalmente dovrebbe essere tollerato, e diventa un effetto tossico. Essendo esacerbati gli effetti collaterali, l'effetto tossico può diventare letale. Variabilità individuale con tollerabilità che diminuisce. La variabilità nella tollerabilità si parla anche di manifestazione di effetti non collaterali normalmente non collegati a quel farmaco.

I fattori che influenzano la risposta individuale ai farmaci sono quelli fisiologici (età, genere, peso corporeo → la risposta a uno stesso trattamento farmacologico può variare in base al genere femminile piuttosto che maschile oppure se il soggetto è in età adulta, pediatrica…), patologici (malattie concomitanti a quella per cui si sta effettuando il trattamento farmacologico causano variabilità, soprattutto malattie ai reni e al fegato, i quali sono organi importanti nell'eliminazione dei farmaci), ambientali (dieta, alcool, tabacco o altri farmaci → interazioni farmacologiche, oppure l'assunzione di determinati alimenti) e genetico (è stato considerato sempre in maniera minoritaria).

In realtà, i fattori genetici incidono maggiormente rispetto agli altri fattori, nella variabilità individuale alla risposta della terapia farmacologica. Incidono in modo preponderante non perché i fattori genetici sono alla base più frequentemente della variabilità individuale, ma sono le conseguenze, le quali sono più gravi rispetto agli altri fattori. Questi fattori genetici contribuiscono a variare la risposta di un individuo rispetto a un altro, ma le conseguenze di queste variabilità sono più gravi.

Se un individuo ha una patologia epatica, sicuramente c'è un'alterazione della risposta, ma l'entità non è così grave. L'impatto di questi fattori (gli altri non genetici) è meno grave, in quanto sicuramente contribuiscono a variarne l'effetto, ma ha un impatto minore, poco rilevante in termini di gravità. I fattori genetici implicano variazioni nell'efficacia e nella tollerabilità molto più ampie. Se è coinvolto nella variazione individuale nella risposta farmacologica il gene che codifica per una proteina che è deputata al metabolismo del farmaco in questione, la variante allelica nell'individuo determina la non funzionalità → grossa variabilità.

I fattori genetici sono considerati più rilevanti non tanto per la frequenza, ma per la variabilità. Quando si fa un trattamento farmacologico, sono previste le interazioni tra i fattori ambientali, patologici e fisiologici e nel foglietto illustrativo sono riportate le indicazioni. La variabilità dell'intensità nei fattori non genetici non è così rilevante, in aggiunta a ciò, poiché le interazioni sono ampiamente studiate e note, anche la tollerabilità non ne risente fortemente. Sono già contemplati nella parte clinica, invece, i fattori genetici solo recentemente sono emersi come componente rilevante nella variabilità individuale.

Le prime evidenze di una relazione stretta e significativa tra varianti polimorfiche a carico di qualche gene coinvolto nel metabolismo del farmaco e nella risposta al farmaco ha fatto nascere la necessità di avere una disciplina che si occupasse di studiare questi elementi. La variabilità in termini di efficacia e di tollerabilità nell'assetto genetico dell'individuo nella risposta farmacologica è stata riscontrata in diversi farmaci contro patologie cardiovascolari, quelli usati contro la depressione e i farmaci broncodilatatori e gli ACE inibitori.

La variabilità nell'efficacia terapeutica sarà tanto maggiore quanto maggiore è la popolazione che assume il farmaco, al numero di individui che possono assumere quel farmaco. Il dato farmacologico assume significatività in base alla frequenza della variante polimorfica nella popolazione e insieme al numero di individui che per patologia possono assumere quel farmaco. Se la variazione allelica è rara, se il farmaco è usato per trattare una patologia molto rara, la farmacogenetica non sarà molto interessata.

Esempi: ACE inibitori 10-25% di pazienti non rispondono in modo atteso, in termini di intensità di effetto, fino ad arrivare agli agonisti β₂ adrenergici (broncodilatatori) i pazienti che non rispondono alla terapia è del 40-70%. È una variabilità enorme. Se si associa questo dato dei non responders, al fatto che si espone al paziente a una non cura, se si ha una malattia letale, io non lo sto curando, possono esistere anche non terapie alternative: questo è un problema medico enorme. Se si ha un individuo non responder e c'è un'alternativa terapeutica il problema è accorgersi del non funzionamento della terapia in tempi brevi. Se non c'è un'altra classe di farmaci che posso usare la gestione del paziente diventa davvero difficile, questa non responsività di tale livello arriva soltanto con i fattori genetici, non con quelli ambientali.

Un individuo può diventare meno tollerabile a un trattamento (effetti collaterali noti esacerbati o nuovi effetti collaterali, non previsti), l'impatto di questa variabilità nella tollerabilità si riscontra in dati importanti: il circa 5-20% dei pazienti ammessi in ospedale soffrono di reazioni avverse, la gravità è notevole. Gli effetti avversi dei farmaci maggiori di quelli attesi. La mortalità per la variabilità nella tollerabilità è la quarta causa di morte, questo è imputabile soltanto ai fattori genetici, in quanto l'intensità della variabilità degli altri fattori è meno rilevante, anche perché sono noti e sono contemplati.

L'obiettivo della farmacogenetica è di predire e di prevenire reazioni avverse e fallimenti terapeutici, ma anche di favorire l'identificazione del farmaco idoneo e del suo corretto dosaggio per ogni singolo individuo al posto della terapia convenzionale (= stesso farmaco stessa dose e stessa posologia). È un cambiamento radicale di fare terapia farmacologica. Tutte queste correlazioni che sono state fatte sono servite per cambiare la terapia. Il fine ultimo è che se c'è una determinata variante nel mio paziente so già come risponderà, se la terapia fallirà.

Questa nuova linea di pensiero ha comportato la nascita della medicina personalizzata, che significa seguire la regola delle 5 R (=right) → dare la giusta dose, il giusto farmaco, la giusta indicazione, al giusto paziente, al momento giusto. È importante conoscere se l'individuo ha una specifica variante, in quanto si mette a rischio che il paziente non è curato o di esporlo a effetti tossici che possono essere letali → genotipizzazione del paziente.

Si vuole passare a una terapia personalizzata dalla strategia empirica ossia la terapia odierna, con un certo quadro sintomatologico, il dottore fa una diagnosi e sceglie il trattamento (scelta del farmaco, dose e posologia), soltanto in base alla diagnosi. Se si va da dieci medici, con gli stessi sintomi, si dovrebbe ricevere lo stesso trattamento. È la diagnosi a guidare la scelta farmacologica. Se il paziente non risponde alla terapia o ha degli effetti avversi, allora, il medico cambia trattamento, ma non considerando il paziente.

Con la terapia personalizzata, invece, con gli stessi sintomi, diagnosi corretta, si fa il test genetico del paziente, alla ricerca di quelle varianti che sono correlate alla variabilità individuale al farmaco x: si fa una terapia alternativa. In questo modo si mette il paziente al centro. Tuttavia, questa pratica è molto costosa e si deve avere una risposta veloce, non può richiedere tanto tempo per stabilire la diagnosi. Negli Stati Uniti, per molte patologie si sta facendo medicina personalizzata, creando anche dei fogli illustrativi opportuni (dose in funzione del tuo genotipo).

Si deve, perciò, cambiare anche le modalità di sviluppo di un farmaco per la terapia personalizzata. Negli studi di fase I, si studia la tollerabilità su poche persone sane, non si studia l'efficacia, invece, nella fase II si determina l'efficacia, in cui si reclutano pazienti, individui affetti dalla patologia in esame, infine, nella fase III, si allarga il numero di pazienti, si confronta il farmaco con altre terapie e si valuta il farmaco nel suo complesso. L'assetto genetico si dovrebbe inserire anche nei trials clinici, già nella fase I si dovrebbero suddividere i pazienti in base alla variabilità genetica e gli effetti collaterali, per studiare la tollerabilità del farmaco, studiando gli effetti avversi sui pazienti.

Dalla fase I si devono cercare già delle correlazioni tra varianti nel DNA e la presenza di un determinato effetto collaterale: se solo 5 pazienti manifestano uno specifico effetto collaterale (non presente negli altri) si ricerca una correlazione della minor tollerabilità nell'assetto genomico. Si devono fare tutti i profili negli studi successivi, gli studi di fase II e III devono essere completamente cambiati: si deve fare a priori la genotipizzazione del paziente, suddividerli in gruppi per genotipi e in sottogruppi per chi riceve il farmaco, il placebo…, per cercare in maniera corretta e in maniera statisticamente rilevante delle correlazioni significative.

Anche nella fase preclinica, si potrebbe supporre delle correlazioni: si identifica un bersaglio molecolare della patologia, si testano un tot di molecole, l'obiettivo è stabilire già all'inizio se il gene che codifica per quel bersaglio esiste nella popolazione in varianti polimorfiche e con che frequenza, che conseguenze comportano sulle proteine, così già a priori in ricerca si può dare peso alla presenza di certe varianti.

Terapia genica

Anche questo caso è una disciplina recente, che è già arrivata sull'uomo, non si intendono tutte le modalità che si fanno in laboratorio. Il primo trials clinico che ha previsto l'uso della terapia genica è avvenuto nel 1991, la sperimentazione fu fatta su pazienti affetti da SCID ossia un'immunodeficienza combinata severa, pazienti che presentano una mutazione a carico di un gene che codifica per un enzima, la cui mancanza determina la non produzione di linfociti B e T, quindi, devono vivere in ambiente sterile, altrimenti non sopravvivono nemmeno a un'infezione lieve. Una delle due ha vissuto normale, fuori dagli ambienti sterili, fu sottoposta alle vaccinazioni → ripristino del sistema immunitario.

Per terapia genica, si intende un protocollo terapeutico che prevede l'uso degli acidi nucleici come farmaci, quindi, non piccole molecole di sintesi, che erano i farmaci iniziali. Fare terapia genica significa usare il potenziale che ha l'acido nucleico, che non nessun’altra molecola può avere, per curare una malattia, il termine farmaco implica che si deve avere una formulazione adatta. L'obiettivo è andare in farmacia e poter comprare un farmaco che ha come principio attivo un acido nucleico. Da questo punto di vista, la scelta degli acidi nucleici in funzione delle proprie potenzialità costituirà il gene terapeutico: può essere un cDNA, quindi, un gene preciso, e acidi nucleici non codificanti, oligonucleotidi di DNA/RNA modificato chimicamente, ribozimi (RNA dotati di attività catalitica) e siRNA, RNA o DNA con funzione decoy (=funzione esca, bloccano la trascrizione di un gene), aptameri (RNA che permettono di avere una conformazione tale per cui è possibile il ripiegamento di una proteina), tutte questi elementi costituiscono nel protocollo ciò che è definito in maniera generica il gene terapeutico.

È difficile somministrare un acido nucleico senza modificarlo, un grosso aspetto rilevante è rendere l'acido nucleico farmacocineticamente disponibile nell'organismo. La terapia genica, ossia l'uso di acidi nucleici come farmaci, è quello che si vuole fare oggi, ma negli anni novanta, era proposta come nicchia per curare patologie gravi ereditarie monogeniche recessive, si era interessati alla gravità della patologia. Si dava il gene wild type come forma terapeutica, al posto del gene mutato. Nasce con un obiettivo preciso e particolare.

L'uso attuale del gene terapeutico ci si riferisce al gene replacement, che è la prima idea strategia: si somministra il gene wild type per rimpiazzare il gene mutato. Ciò ha cambiato la visione delle malattie ereditarie: prima si cerca di correggere il gene mutato. L'avvento della terapia genica ha rivoluzionato questo, non si corregge il difetto, si cerca di far esprimere il gene nella forma wild type. L'uso degli acidi nucleici come farmaci, con il miglioramento anche delle tecnologie, ha fatto capire che poteva essere ampliato, oggi, la maggior parte dei protocolli sono volti al trattamento delle neoplasie, malattie cardiovascolari, malattie infettive (HIV), patologie neurologiche (Alzheimer e Parkinson). Tutti questi esempi di strategie che hanno un potenziale applicabile all'uomo, sono già in fase clinica. Ci sono già due farmaci in commercio.

Dal gene replacement, l'idea iniziale della terapia genica, oggi si usano quattro protocolli. Gene replacement → l'acido nucleico è usato per rimpiazzare una funzione persa, il gene difettoso, la cui mancanza è responsabile della patologia. Gene addition → un gene terapeutico il cui prodotto non è direttamente correlabile alla patologia, ma la sua espressione aumentata, grazie al protocollo di terapia genica, aiuta il quadro sintomatologico. Il gene non è coinvolto nella patogenesi, ma aiuta a curare la patologia. È qualcosa in più. Gene editing → si cerca di correggere direttamente il gene nel paziente, somministrando un gene terapeutico, il cui prodotto è in grado di effettuare la correzione del gene. Gene knockdown → si usa un gene terapeutico il cui scopo è silenziare il prodotto di un gene, la cui sovraespressione è causa della malattia.

Queste sono le quattro strategie, i protocolli sono due: additivo o ablativo: il primo esprime una proteina che normalmente non esprime o espresso a basse quantità, invece, nel secondo il risultato finale è la riduzione di un gene, di una proteina, si silenzia o si riduce l'espressione di una proteina. Il protocollo ablativo non riguarda solo esclusivamente knockdown, come strategia, allo stesso modo un protocollo additivo può usare una strategia knockdown. Nella distrofia muscolare di Duchenne, un protocollo prevedeva il gene knockdown (silenziando una porzione del gene), che, però, è additivo, in quanto si ha espressione di una proteina che non ci sarebbe altrimenti. Si silenzia un esone particolare, per avere il corretto frame di lettura.

Per scegliere la patologia, ci sono delle caratteristiche che deve avere per essere oggetto di un protocollo, si deve anche scegliere un gene terapeutico, la scelta della modalità di somministrazione, in vivo e in ex vivo, infine, la scelta del trasferimento genico, che cosa usare per la delivery, i vettori virali, metodi chimici o fisici. Ci sono, tuttavia, dei problemi che limitano e che sono di difficile risoluzione: la sicurezza della procedura → i vettori virali per le loro caratteristiche sarebbero ideali.

Ci sono alcuni vettori virali, che hanno una latenza nelle cellule, ma la loro sicurezza non è stata ancora chiarita, motivo per cui le sperimentazioni cliniche che prevedono un trasferimento genico tramite vettori virali usano dei vettori retrovirali, vettori adenovirali e adenoassociati. Con questi la sicurezza c'è. Il secondo problema è l'efficienza del trasferimento, non esiste un protocollo di terapia genica ideale, dipende dal vettore e dalla scelta della strategia, però, in funzione della patologia che si vuole curare, il trasferimento genico, in termini sia di...