Appunti di strutture e interazioni molecolari

Strutture e interazioni molecolari

Relazione tra struttura e funzione

Il cuore di tutto ciò è il metodo computazionale, per fare analisi tra la struttura e le funzioni. Struttura delle biomolecole: sappiamo prevedere la funzione se sappiamo la struttura? Le molecole che troviamo nei sistemi viventi sono molto complesse e organizzate, questa particolarità è apparentemente in contraddizione con il secondo principio della termodinamica: i sistemi isolati (come il nostro universo) tendono spontaneamente per motivi statistici a stati più omogenei. Il sistema vivente, però, è tutt’altro che omogeneo. Com’è possibile che si siano creati dei sistemi così disomogenei come gli esseri viventi? Questo può far riflettere sul significato di sistema vivente.

La vita è fatta da oggetti molto organizzati, un esempio spettacolare sono le proteine: le biomolecole sono l’unica classe di molecole che hanno una funzione. La CO ha una funzione? Noi sappiamo perché esiste. Le proteine rispecchiano tutte le leggi della fisica e della chimica, ma hanno anche una funzione; per questo vengono chiamate dispositivi, in quanto hanno una funzione, sono dei nanodispositivi, delle nanomacchine. Il progettista è un processo: la selezione naturale. L’approccio con cui si studiano queste molecole è l’ingegneria inversa. Un ingegnere, in generale, pensa a una funzione e progetta qualcosa per realizzarla. Noi dobbiamo fare il lavoro inverso: la macchina esiste già, noi dobbiamo capire la sua funzione. L’ingegneria inversa è un processo che nell’industria si usa comunemente. È importante anche capire le funzioni delle varie componenti di una biomolecola. Per fare tutto questo si devono usare dei metodi sperimentali e computazionali (informatici).

Proteine

Le proteine sono polimeri, sono tanti amminoacidi legati tra di loro, così come gli acidi nucleici. Le proteine hanno un albero genealogico: le proteine che incontriamo negli esseri viventi derivano dalle proteine ancestrali di esseri viventi che vivevano prima. La vita è molto robusta, si adatta ai cambiamenti ambientali. Il sistema vita è basato sulla medesima chimica. Il vantaggio di un polimero è la variabilità. Si conta che con 100 amminoacidi si possono ottenere 10¹³⁰ sequenze di proteine.

La funzione di una proteina è un concetto relativo: dipende dall’ecosistema in cui si trova, può non avere nessuna funzione solo perché non c’è nessun organismo che la sfrutta. Gli ancestori possono aiutarci a determinare la funzione di proteine. Se si mantiene nel tempo una determinata caratteristica significa che è fondamentale. La comparazione di dispositivi che sono collegati dal punto di vista filogenetico può far emergere un’informazione. Esempio: l’emoglobina si trova in diverse specie, hanno delle differenze, ma hanno le medesime funzioni: trasportare ossigeno. Confrontando le varie emoglobine, si vedranno delle sequenze conservate nelle varie specie. Proteine omologhe = derivano dallo stesso ancestore comune. La comparazione di proteine omologhe può aiutare a trovare un’informazione.

Com’è nata la vita sulla terra? È un processo graduale.

Enzimi

Le idrogenasi sono delle classi di enzimi che catalizzano la reazione di conversione reversibile di protoni ed elettroni in H₂ molecolare. Una fonte energetica sulla terra è il Sole. Il petrolio, invece, non è una fonte energetica, ma un vettore di energia. L’energia che è racchiusa dal petrolio deriva dal Sole. I combustibili fossili sono molto usati dagli esseri umani, hanno scoperto come fare la respirazione al di fuori degli esseri viventi. I combustibili fossili non sono infiniti, per questo si devono trovare altri carrier. Bruciando i combustibili fossili si libera CO₂ e questo provoca il cambiamento climatico. L’idrogeno contiene molta energia, può essere un buon trasportatore di energia. Le aziende vogliono spaccare l’acqua in O₂ e H₂, perché è molto abbondante sulla terra, per fare ciò si vuole sfruttare l’energia solare. Le automobili che vanno a idrogeno hanno una cella combustibile dove reagiscono O₂ e H₂. È un’ossidoriduzione. Quando si brucia la benzina si forma la CO₂, se, invece di bruciare C, bruciamo H₂, si crea H₂O che ha un impatto ambientale nullo. Produrre H₂ è complicato perché è una reazione lenta. Alcuni organismi, però, sanno catalizzare questa reazione (i fotosistemi delle piante).

Esistono tre famiglie filogeneticamente distinte (non hanno nessun collegamento evolutivo) di idrogenasi. 1. Il Ferro-Ferro deidrogenasi sito attivo è estremamente inusuale, un biochimico ha dedotto la struttura tramite la diffrazione dei raggi X. Ha due atomi di ferro, atomo abbastanza disponibile. Il primo atomo di ferro è legato alla proteina mediante l’atomo di zolfo di una cisteina. Uno ione cianuro e una molecola di CO sono molecole inusuali, essendo molto reattive e di conseguenza tossiche. Il secondo atomo di ferro è simile al primo, i due atomi di ferro sono così legati S-CH₂-X-CH₂-S. Questi enzimi sono presenti in molti batteri, in alcuni eucarioti e in microalghe. Per fare la reazione serviranno CO e CN. La X nella catena è un azoto di un’ammina, l’enzima a riposo è caratteristico perché ha due ferri in stato di ossidazione +1. Tenere del ferro nello stato +1 non è facile, devo modulare, per questo lì ci sono CO e N, per mantenere il ferro in uno stato redox inusuale. Il CO si è spostato. Fe¹⁺-Fe¹⁺: ammina ha 2 protoni; un protone di NH, se va su Fe, H è vicinissimo a Fe. Il Fe non legherebbe H, serve un elettron-ricco per legare H.

Per determinare il numero di ossidazione si fa finta che tutti i legami siano ionici, per l’ammina, tra H e N, l’atomo più elettronegativo è N. L’atomo di ferro attrae H, che è più elettronegativo. H ha valenza +1, legato al ferro vale -1, se H si è ridotto, prendendo gli elettroni da 2 atomi di Fe. H è ione idruro come in NADH. In ambiente polare, l’ammina si protona e si aggancia a un altro protone. H^- e H^- vicini si attraggono e si forma H₂. Per questo enzima si usa la molecola piegata, in modo da mettere vicini i due H. Nei passaggi intermedi arriva altro H^-, l’atomo di ferro diventa Fe³⁺ e così riesce ad attrarre H. I 2 ioni Fe ci sono perché servono 2 elettroni (ciascuno un elettrone), perciò, il ferro rimane +1 perché così può prendere protoni, l’ammina sopra serve per unire i 2 H, la presenza di CO e CN rende stabile Fe¹⁺.

In laboratorio si vuole creare enzimi tolleranti all’O₂, perché a livello industriale, per lavorare a basso costo, si deve lavorare in aerobiosi, però, così gli enzimi sono inattivati dall’O₂, che si diffonde nel sito attivo, incontra Fe¹⁺ e lo ossida.

Lezione 2

Meccanismo catalitico usato da ferro-ferro idrogenasi per produrre velocemente H₂: l’idrogeno è un carrier/vettore energetico molto promettente e tutti gli enzimi che producono idrogeno a basso costo e velocemente sono molto interessanti. Se si pensa a tutti sistemi in cui c’è un processo di redox, si nota che il trasferimento di elettrone è sempre accoppiato al trasferimento di protone. Si parla, infatti, di trasferimento accoppiato elettrone-protone = sistemi di trasferimento elettronico/protonico; quando si trasferisce un elettrone, l’affinità protonica di una molecola, dopo che l’elettrone è arrivato, aumenta, in quanto gli elettroni aumentano, quindi, la molecola vuole legare più facilmente dei protoni; se si trasferisce un protone su una molecola, questa vuole ancora di più prendere elettroni; questo sistema fa sì che uno promuova l’altro. Il legame di protone, infatti, rende la riduzione più facile, perché qualsiasi sia la molecola, se lega un protone, la sua carica positiva diventa ancora più positiva, quindi, ha più affinità per gli elettroni: è il motivo per cui il trasferimento di protoni ed elettroni è sempre accoppiato.

Bisogna capire come mai i vari reagenti entrano in gioco in vari momenti e non in altri: stato Fe¹⁺-Fe¹⁺ evolve in un isomero che differisce per promozione di atomo di H (rosso in figura), è il protone che si trasferisce sul ferro e diventa così un idruro, perché attaccandosi al ferro strappa un elettrone a ciascun atomo di ferro; se un H⁺ va sul ferro, essendo più elettronegativo del ferro, gli elettroni di legame vanno tutti e due su H. Se H^- diventa H₂, si prende 2 elettroni, quindi, il Fe³⁺ diventa transitoriamente Fe³⁺, ma lo ione Fe³⁺ è vicino allo ione Fe¹⁺, allora, succede che lo ione Fe³⁺ ha un’alta affinità di elettroni, quindi, trova elettroni dal Fe¹⁺ che è molto ricco di elettroni, quindi, da Fe³⁺ a Fe²⁺ diventa Fe²⁺; in realtà, il protone e l’elettrone arrivano insieme e arrivano in questo momento perché ci deve essere qualche porzione di catalizzatore che ha un’elevata avidità per H⁺, perché si è in ambiente acquoso, perciò, è già lì H⁺; in questa struttura c’è un’elevata avidità dovuta a N di ammina che ha 4 legami, quindi, non ha altri doppietti elettronici liberi; appena H⁺ (rosso) si è trasferito, però, compare una coppia di elettroni che è la coppia di elettroni dell’ammina secondaria, che è una base relativamente forte, di conseguenza, in un ambiente protonico, ossia l’acqua che è una base debole può prendersi un protone; appena prende il protone, la carica elettrica globale diventa di un’unità più positiva, l’ammina secondaria che lega H⁺, sarà una carica di un’unità più positiva; ha un’affinità elettronica maggiore la seconda perché ha una carica positiva in più e così attrae di più un elettrone; l’arrivo di un protone ha reso la riduzione più favorevole.

L’elettrone deriva dal NADH e porta a una riduzione: se si riduce significa che da Fe²⁺-Fe²⁺ passa a Fe¹⁺-Fe¹⁺; si riduce Fe¹⁺ e non qualcos’altro tipo N (è utile saperlo per progettare enzimi; proteine sono fatte di C, N, O e H e non di Fe, V (= vanadio), Cu…) ci sono tanti motivi, soprattutto uno ossia N ha intorno 8 elettroni, quindi, non può legare il 9° elettrone. Il C ha 8 elettroni, perciò, non si può ridurre; gli unici atomi che possono ridursi sono quelli metallici. I cavi elettrici che usano le proteine per far passare gli elettroni sono gli atomi metallici. Le catene di trasferimento elettronico coinvolgono ioni metallici che si ossidano e si riducono facilmente perché non hanno raggiunto l’ottetto. L’H₂ si forma lì, solo dopo l’arrivo di elettroni, dopo che Fe¹⁺-Fe¹⁺ e gli atomi di H si uniscono formando H₂. Questo avviene solo dopo arrivo dell’elettrone, perché l’atomo di H è formalmente H^- e per formare H₂, quindi, il doppietto elettronico di H²⁺ va a prendersi il protone. Il doppietto elettronico è più disponibile a legare protoni, quando l’idruro è su Fe¹⁺ (attrae di più elettroni rispetto a Fe²⁺) e ciò implica che elettroni di idruro sono spostati verso il Fe, perciò, sono meno disponibili ad andare a prendersi il protone sopra. Lo ione idruro è H²⁺ con 2 elettroni, di conseguenza, la coppia di elettroni per essere basica deve essere disponibile: se c’è Fe²⁺ che li attrae verso di sé, reagisce di meno. Appena, però, diventa Fe¹⁺ si forma H₂: H₂ si stacca, ma i 2 atomi di H rossi fanno 2 legami? Non esiste perché raggiunge l’ottetto quando ha solo 2 elettroni di valenza, ciò, allora, significa che appena si forma H₂, esso si stacca, perché diminuisce l’affinità.

Per progettare un catalizzatore di ricerca

Un catalizzatore non deve avere affinità troppo alta, perché altrimenti quella molecola diventa un inibitore, la cosa difficile di progettazione è che il substrato e il prodotto non devono avere un’affinità troppo elevata, altrimenti non si staccano più. Appena H₂ si forma, si deve staccare. Il catalizzatore aumenta la velocità di reazione e abbassa l’energia di attivazione, quindi, un catalizzatore rende più veloce sia la reazione diretta che quella inversa, ma non favorisce una delle due; questo ciclo catalitico può andare in entrambe le direzioni, se va in un senso o nell’altro, dipende dalla concentrazione, perché è questa che sposta il ΔG di reazione. È importante avere un catalizzatore che vada in entrambe le direzioni, poiché bisogna trasformare H₂ con O₂ per avere il calore, ma se il catalizzatore va anche in direzione inversa, l’atomo di Fe deve avere una certa attività, altrimenti come fa ad andare in senso inverso? H₂, quindi, non si lega mai al Fe se si usa la reazione inversa. Ma come fa Fe a legare H₂ se questo ha già raggiunto ottetto? È stato scoperto che il legame chimico è in condivisione di coppie elettroniche; Fe¹⁺ ha una carica positività, su H₂ non ci sono doppietti elettronici liberi. Il legame tra i 2 H è del tipo σ e fra 2 atomi c’è una certa densità di elettroni: si possono formare dei legami molto deboli tra i 2, ma molto trascurabili, ossia nuvole elettroniche tra orbitali σ e gli ioni con carica positiva. Non si forma nessun legame covalente, ma gli elettroni che stanno in mezzo sono attratti dal metallo, quindi, si ha solo un’interazione debole elettrostatica, sufficiente a far sì che se c’è H in concentrazioni adeguate, H₂ si lega a Fe.

Questi enzimi che vengono a contatto con O₂ non catalizzano più la reazione perché l’O₂ che è un fortissimo ossidante, se si avvicina a ioni Fe¹⁺ o Fe²⁺, li ossida a Fe³⁺. Il sito catalitico di enzima è in mezzo; l’enzima deve avere il sito catalitico nel quale devono arrivare i protoni, elettroni e H₂ deve uscire o entrare. Servono 3 canali. I canali attraverso cui passano gli elettroni (sono dei tunnel piccoli). Serve un modo facile ossia servono degli ioni metallici vicini, ma gli unici cofattori redox di proteine sono i metalli? No, c’è il FAD e il NAD.

Il sito catalitico è collegato con l’esterno da 3 cluster 4Fe-4S; questi cluster sono orientati uno dietro l’altro e così elettroni fluiscono; i metalli possono ossidarsi e ridursi, quindi, possono prendere e cedere elettroni come nella catena respiratoria; anche chinoni sono molecole che si ossidano e si riducono facilmente; in una cellula può avvenire qualsiasi redox? Il mezzo più abbondante è H₂O; in una cellula possono avvenire tutte le redox con potenziale giusto per acqua; in cellula non è possibile produrre H₂ perché altrimenti acqua sarebbe sempre trasformata in H₂ e la cellula morirebbe. Tutte le riduzioni possono avvenire? No, perché se si va a potenziale di H₂, si riduce l’acqua, la finestra di potenziali redox non è infinita, perché, in generale, il solvente delle cellule non può reagire sempre, se non in casi particolari. I protoni passano in un canale piccolo, poiché i protoni, dopo gli elettroni, sono le particelle più piccole; canali protonici: problema di elettroni e protoni non possono passare in un buco grande perché si legano facilmente agli atomi della macromolecola. Per ovviare a ciò, si usano degli amminoacidi che hanno caratteristiche acido-base, ossia His, Glu e Asp, Tyr (His ha anello imidazolico e ha un N con doppietto elettronico libero, che può legare un protone e lo può poi cedere; Ala, invece, non va bene perché in catena laterale ha un metile CH₃ e questo gruppo non lega i protoni; Glu e Asp si protonano facilmente). Serve un amminoacido con atomo che ha caratteristiche acido-base, dipende dal contesto. La pK di His vale 6, quindi, significa che a pH 6 metà quantità di His è protonata e metà no; ciò significa che se il pH è 6,2, questo perde protoni, se, invece, è 5,9 acquista protoni. Servono amminoacidi con pK adeguate (pK dipende anche dall’intorno: con un intorno si può modulare pK e rendere così il canale protonico come si vuole). Per H₂ serve una galleria dato che è molecola apolare, ma qui c’è un problema industriale ossia che H₂ e O₂ hanno dimensioni molto simili: in condizioni aerobiche se diffonde H₂, può diffondere anche O₂, così O₂ può entrare nel canale e ossidare Fe¹⁺ a Fe³⁺.

In laboratorio si è voluto sostituire gli amminoacidi di canale che comunicano con l’esterno con degli amminoacidi leggermente più ingombranti, se è possibile, e di restringere leggermente il canale attraverso cui diffonde H₂ (pur avendo H₂ e O₂ dimensioni simili, O₂ è più grande); questa strategia è complicata, perché bisogna sostituire gli amminoacidi che devono essere non troppo grandi, altrimenti non passa neanche H₂, in modo da rendere canale giusto per H₂ e piccolo per O₂. Se si vuole progettare un mutante (= la proteina con amminoacidi diversi per avere funzionalità nuove), c’è il problema di quali amminoacidi sostituire? Bisogna fare tante considerazioni perché non bisogna toccare le parti mo...