Appunti di microbiologia

DESCRIZIONE DELLA CRESCITA MICROBICA

In microbiologia lo studio della crescita può essere rivolto sia ai singoli individui che compongono una popolazione, sia alla popolazione microbica nella sua interezza, soprattutto in considerazione delle grandi differenze riscontrabili tra i microrganismi.

Scissione binaria

Le cellule batteriche si moltiplicano secondo la modalità di "scissione binaria", detta anche schizogonia. Questo è il processo in cui da una cellula madre, come si definisce una cellula in divisione, si ottengono due cellule figlie.

La scissione binaria dei procarioti è un meccanismo più semplice della mitosi degli eucarioti, in quanto un batterio non possiede un'organizzazione nucleare del materiale genetico. Durante la divisione cellulare, l'intero genoma della cellula madre viene replicato e un setto comincia a formarsi al centro del lume cellulare. La cellula comincia quindi ad allungarsi e i due cromosomi si separano.

Ogniuno costituirà il materiale genetico delle due cellule figlie che si otterranno grazie alla completa formazione del setto di divisione. Il tempo necessario perché un batterio possa svolgere un ciclo completo di divisione, definito tempo generazionale, dipende sia da fattori genetici quindi intrinseci all'individuo, sia da fattori ambientali. In condizioni ambientali ottimali il tempo generazionale può andare da pochi minuti ad alcune ore. Curva della crescita La crescita microbica riguarda popolazioni in sistemi chiusi, ossia sistemi in cui vi è sostituzione del substrato nutritivo e quindi, durante la crescita si assiste alla riduzione dei nutrienti e all'accumulo dei prodotti metabolici. Questo tipo di sistema viene anche definito coltura in batch. Essa è distinta in quattro fasi e si può rappresentare graficamente con un sistema di assi cartesiani il log del numero di 10 cellule vitali componenti la popolazione in funzione del tempo. 1) Fase di

1. Fase di latenza

Durante la fase di latenza le cellule, pur non dividendosi, svolgono un'intensa attività metabolica volta principalmente alla sintesi di enzimi e molecole necessari per la crescita esponenziale, fase comportante anche un incremento del volume della nuova cellula. Le cellule impiegano un certo tempo. Definito impropriamente tempo di latenza, ad adattarsi al substrato in cui devono moltiplicarsi. Il tempo necessario a tale adattamento può variare in funzione dello stato fisiologico delle cellule al tempo zero, ossia delle cellule utilizzate per inoculare il terreno colturale.

2. Fase esponenziale

Durante questa fase le cellule esprimono, in relazione alle condizioni ambientali, la massima capacità di accrescimento. Tutte le cellule della popolazione impiegheranno avranno lo stesso tempo generazionale. Nelle condizioni

3. Fase stazionaria

La fase stazionaria è caratterizzata da un equilibrio tra la crescita e la morte delle cellule. In questa fase, il tasso di divisione cellulare è uguale al tasso di morte cellulare, quindi la popolazione di cellule rimane costante nel tempo. Durante questa fase, le cellule possono entrare in uno stato di quiescenza o di dormienza, in cui rallentano la loro attività metabolica.

4. Fase di morte

Nella fase di morte, il tasso di morte cellulare supera il tasso di divisione cellulare, portando alla diminuzione della popolazione di cellule nel tempo. Questa fase può essere causata da esaurimento delle risorse, accumulo di scarti metabolici o condizioni ambientali sfavorevoli.

ottimali dicrescita questo corrisponderà al tempo più breve necessario a quella cellula per dividersi. In considerazioni del fatto che in questa fase tutte le cellule si dividono nello stesso tempo, dopo ogni tempo generazionale la popolazione risulta esattamente raddoppiata. Quando nel substrato di crescita si verifica una forte riduzione del contenuto di nutrienti e il contemporaneo accumulo di metaboliti, le cellule cominciano a perdere la capacità di dividersi, in conseguenza proprio delle sfavorevoli condizioni ambientali. Fase stazionaria Dopo un certo numero di generazioni, la popolazione non si accresce più e apparentemente tutte le cellule smettono di dividersi. In altre parole, non aumenta più il numero di cellule che compongono la popolazione e la curva di crescita assume un andamento orizzontale, in quanto il numero delle cellule che muoiono e quello delle nuove cellule che si formano è più o meno lo stesso. In realtà, ciò chesuccede è che un certo numero di cellule va incontro a morte, alcune smettono di dividersi e altre ancora continuano a dividersi, anche se non tutte con la stessa velocità. La conseguenza netta è, dunque, che durante la fase stazionaria il numero di individui vitali che compongono la popolazione non si modifica, o meglio non si modifica in maniera apprezzabile con i comuni metodi di conteggio. La fase stazionaria di crescita può essere più o meno breve in funzione della capacità dei microrganismi di sopravvivere alle avverse condizioni ambientali. La fase di morte Dopo un certo tempo di permanenza a condizioni ambientali avverse, purché il microrganismo non sia capace di produrre spore, le cellule cominciano a perdere vitalità, cioè la capacità di moltiplicarsi anche se poste in un mezzo di crescita fresco. In questa fase si assiste alla riduzione del numero di individui della popolazione. È giusto precisare le condizionibiologiche in cui una cellula microbica può trovarsi: una cellula viene definita viva e vitale quando è in grado di dare origine a una progenie, viva ma non vitale quando trascrive il proprio DNA in mRNA, ma non è in grado di dare origine a una progenie, morta quando non trascrive il proprio DNA in mRNA. Inoltre, è nota ai microbiologi l'esistenza di microrganismi vivi ma non coltivabili, cioè microrganismi capaci di dare progenie solo nell'ambiente naturale in cui vivono. Velocità della crescita microbica Di fronte alla necessità di rappresentare numericamente l'entità di una popolazione e in considerazione dell'oggettiva difficoltà a manipolare numeri grandi, comunemente il numero di individui che compone una popolazione microbica viene riportato come numero di potenza in base 10, o in alternativa, come logaritmo in base 10 di tale numero. Quindi, la curva di crescita di un microrganismo è meglio rappresentata su

Di un pianocosiddetto semi-logaritmico. Cioè, mentre il valore del tempo (asse delle ascisse) viene riportato su una scala aritmetica, il numero di individui (asse delle ordinate) viene riportato su una scala logaritmica.

Tale rappresentazione fa si che, sull'asse delle ordinate, l'intervallo unitario sia costituito dall'esponente della potenza in base 10, cioè il logaritmo della stessa potenza. Nella fase esponenziale di crescita, in cui la popolazione si raddoppia a intervalli regolari, la curva di crescita avrà un andamento rettilineo.

Infatti, la funzione esponenziale della crescita microbica è 2^n, dove 2 è il risultato della scissione binaria, due cellule da una, mentre n rappresenta il numero di volte che la popolazione si raddoppia in seguito alla divisione binaria di ogni cellula, cioè il numero di generazioni.

Tale eguaglianza però è veritiera solo se consideriamo che il numero iniziale di cellule è pari a 1;

vengono contate attraverso l'uso del microscopio e di speciali vetrini. Con i metodi indiretti, invece, il numero di cellule viene valutato senza l'ausilio del microscopio, sfruttando piuttosto la capacità delle cellule stesse di crescere. Infine, il metodo nefelometrico, volto alla misura della massa occupata dalle cellule in una sospensione, parametro correlabile alla numerosità della popolazione. Conta diretta Per tale metodo è necessario disporre di un microscopio e di speciali vetrini sulla cui superficie vi è una depressione quadrangolare di profondità nota, tale che se chiusa con un vetrino copriogetti diventa una microcella a volume noto. Questi speciali vetrini, frequentemente impiegati anche per il conteggio dei globuli del sangue, sono conosciuti come camere di conta. Per le sue dimensioni, la camera di Perroff-Hauser viene utilizzata tipicamente per il conteggio di batteri. Il metodo presenta alcuni limiti, tra cui i più importanti sono: - La necessità di un microscopio e di speciali vetrini - La possibilità di errore umano nel conteggio delle cellule - La limitata area di conteggio della camera di conta - La difficoltà nel distinguere tra cellule vive e morte - La possibilità di danneggiare le cellule durante la preparazione del campione Conta indiretta La conta indiretta delle cellule si basa su metodi che non richiedono l'uso del microscopio. Questi metodi sfruttano la capacità delle cellule di crescere e moltiplicarsi in determinate condizioni di coltura. Il numero di cellule viene quindi stimato in base alla quantità di biomassa prodotta o alla turbidità della sospensione cellulare. Questi metodi sono più rapidi e meno soggetti a errori umani rispetto alla conta diretta, ma possono essere influenzati da vari fattori come la presenza di sostanze interferenti o la variabilità nella crescita delle cellule. Metodo nefelometrico Il metodo nefelometrico è utilizzato per misurare la massa occupata dalle cellule in una sospensione. Questo parametro è correlato alla numerosità della popolazione cellulare. Il principio di base del metodo consiste nel misurare la quantità di luce diffusa dalla sospensione cellulare. Maggiore è la concentrazione di cellule, maggiore sarà la quantità di luce diffusa. Questo metodo è particolarmente utile per il monitoraggio della crescita cellulare in colture di grandi volumi, ma può essere influenzato da vari fattori come la presenza di particelle non cellulari o la presenza di sostanze che assorbono la luce.Non è possibile distinguere le cellule vive da quelle morte se non dopo opportuno trattamento e microscopia a fluorescenza; • Se la concentrazione cellulare non raggiunge almeno alcuni milioni di cellule per ml, risulteranno rari i campi microscopici in cui sono presenti cellule; in tali casi è necessaria una preventiva concentrazione del campione (ad esempio filtrazione o centrifugazione); • Il risultato del conteggio è influenzato da diverse fonti di errore, quali sovrapposizione di piani di fuoco, la soggettiva attribuzione della pertinenza di alcune cellule all'area considerata, la possibilità che sfuggano al conteggio cellule piccole o poco visibili. In conclusione si può considerare la conta diretta come un metodo da adottare in situazioni in cui si ha necessità di conoscere in maniera orientativa e soprattutto rapidamente la consistenza di una popolazione microbica matrice, presente in una qualsiasi sia essa solida che liquida. Allestimento.diluita. La diluizione del campione è necessariaper ottenere una concentrazione di cellule che siaadatta per la conta. La diluizione viene effettuatamischiando una quantità nota di campione con unquantitativo noto di soluzione diluente. Il rapporto tra il volume del campione e il volume totale della diluizione determina il fattore di diluizione. Ad esempio, se si miscela 1 ml di campione con 9 ml di soluzione diluente, il fattore di diluizione sarà 1:10. La diluizione viene ripetuta più volte, utilizzando diluizioni seriali, per ottenere una concentrazione finale adeguata per la conta.