Appunti di microbiologia

Microbiologia

I microrganismi sono molto più evoluti rispetto agli organismi superiori nei meccanismi di adattamento a tutti gli ambienti e alle variazioni ambientali. La microbiologia studia i microrganismi che sono visibili tramite microscopio ottico e/o elettronico. Si tratta di una disciplina molto antica che ha esercitato una grande influenza su tutti i campi della biologia. Tali microrganismi sono i: batteri, funghi, i protisti e i virus. Ogni organismo studiato ha la sua branca, infatti si parla di batteriologia per i batteri, virologia per i virus e così via.

Batteri e adattamento ambientale

I batteri sono piccoli, estremamente efficienti e hanno una versatilità metabolica estrema, essi riescono a metabolizzare tutto, qualsiasi substrato che sia organico o inorganico. Vivono in ambienti estremi (pH 1, temperatura di 60°). La versatilità metabolica gli permette di adattarsi a tutti gli ambienti e di essere utili a tali ambienti. La capacità di adattarsi a tutte le variazioni ambientali è data dal fatto che si dividono molto velocemente attraverso scissione binaria. La cellula procariota è caratterizzata dai ribosomi (grande necessità di sintetizzare proteine) e DNA privo di membrana.

I microrganismi si dividono in: organismi viventi e agenti infettivi (che non sono delle vere e proprie cellule). Gli organismi viventi si dividono in: Procarioti (Eubatteri e Archea) ed Eucarioti (Alghe, Funghi e Protozoi). Gli agenti infettivi sono delle strutture come i virus. I virus sono i più piccoli: 0.01-0.25 micron e sono acellulari. Normalmente i batteri sono associati alle malattie, ma in realtà solo il 5% dei batteri può essere dannoso per gli organismi viventi mentre il restante 95% non è assolutamente patogeno.

I microrganismi sono presenti in tutti gli ambienti, soprattutto nell’intestino (es. E. Coli) dove essi svolgono funzioni essenziali per la vita. Gli uomini non differiscono tra loro solo dal DNA, ma anche dal microbiota (l’insieme dei microrganismi simbionti). Ogni uomo ha nell’apparato intestinale una diversità di microbiota, connesso, oltre che al sesso e all’età, anche con lo stile di vita. Per questo motivo lo si studia in modo da capire come intervenire su alcune patologie variando lo stile di vita.

I microrganismi sono utilizzati inoltre per creare gli antibiotici (Penicillina) e molti alimenti sono prodotti usando il metabolismo batterico (birra, pane, yogurt). I microrganismi presenti sugli alimenti possono dare origine a patologie alimentari date dalla cattiva conservazione dell’alimento. I microrganismi sono presenti nel nostro organismo e la loro presenza è molto importante in quanto producono varie vitamine necessarie all’organismo, la loro assenza determina delle patologie. Quando si abbassa il numero di microrganismi nell’intestino si hanno varie patologie ed anche quando si allontanano dai loro distretti. La possibilità di utilizzare i microrganismi nei “nostri interessi” è vasta. Negli ultimi tempi, si è anche vista la presenza di microrganismi capaci di risolvere l’eccessiva presenza di plastica nell’ambiente. Si ha l’utilizzo di microrganismi anche nell’agricoltura affiancati agli ibridi (OGM).

Storia e sviluppi della microbiologia

Intorno al 1610 è stato costruito il primo microscopio grazie a Jansen. Tramite il microscopio, van Leeuwenhoeck, scopre gli Animalcules, paragonati a piccoli animali. Van Leeuwenhoeck osservò su campioni di acqua e di saliva gli Animalcules che segnalò alla royal society di Londra. Tali animalecules visti in movimento, non erano ancora pensabili come “organismi” perché di minuscole dimensioni. La religione ha influito per molti secoli sullo sviluppo della scienza, infatti, per affermare la teoria della biogenesi è stato necessario tanto tempo. La teoria della generazione spontanea, presente già nel 300 a.C e sostenuta da Aristotele, secondo cui la materia inanimata potesse trasformarsi in vivente, si è diffusa per secoli, dal 1665 al 1858.

Hooke parla di “scatole” che componevano gli organismi viventi, ossia le cellule. Nacque successivamente la teoria cellulare secondo cui gli organismi viventi sono caratterizzati da cellule che derivano da cellule preesistenti. Francesco Redi osservò che mettendo un pezzo di carne in un contenitore aperto dopo alcuni giorni si sviluppavano delle larve, mentre se il contenitore restava chiuso ciò non accadeva. Nel 1745 Needham cominciò a lavorare su questo, utilizzando il metodo adoperato nella sterilizzazione, cioè bollì un brodo in alcuni recipienti chiusi, osservando anche dopo la procedura, la presenza di organismi. Nel 1765 Lazzaro Spallanzani, padre della microbiologia italiana (studiò la tubercolosi), bollì il brodo in una fiasca. Diversamente da ciò che era stato fatto in precedenza, cioè il brodo bollito veniva chiuso, egli fece bollire il brodo nella fiasca, osservando nessuna crescita microbica. Questo significa che portando ad ebollizione la miscela, si distrugge tutto ciò che è presente.

Louis Pasteur, microbiologo per eccellenza, ha condotto vari esperimenti, mettendo un punto fermo sulla teoria della biogenesi. Egli prese il lavoro condotto da Spallanzani e utilizzò il cilindro di Pasteur. Si tratta di un normale cilindro in cui versa il brodo, esso viene messo sulla fiamma e viene tirato il collo. Il liquido viene sterilizzato e messo a bollire. Egli fa la stessa cosa di Spallanzani però, invece di mettere il tappo, costruisce un cilindro in cui è presente un collo che permette all’aria di uscire ma non le permette di entrare. Ancora oggi nella casa di Pasteur, è presente il cilindro dell’esperimento con il brodo dentro, con nessun organismo al suo interno. Pasteur prova che se si fa entrare dell’aria nel liquido (Redi, Needham) si fanno entrare anche i microrganismi. La crescita quindi, non è dovuta al brodo, ma i microrganismi sono immessi dall’esterno tramite l’aria. “Tirando il collo” l’aria rimane intrappolata e non ha possibilità di contaminare il liquido. Questa è stata la prova della biogenesi, in cui i microrganismi non si generano spontaneamente ma attraverso altri organismi viventi.

Dal 1857 al 1914, si sviluppano tutti i campi della microbiologia, questo è avvenuto soprattutto grazie a Pasteur che non ha solo studiato i microrganismi, ma iniziò ad associarli alle malattie ed anche a delle terapie per poter risolvere le malattie. Pasteur fu molto importante anche per la replicazione dei microrganismi negli alimenti che sono prodotti da microrganismi per fermentazione: vino, birra. Nel 1862 Pasteur venne chiamato da un’industria che produceva lieviti di birra (industrie a quel tempo più avanzate). Egli venne chiamato in quanto, la quantità di birra prodotta, era insufficiente. Pasteur si accorse che oltre ai lieviti responsabili della produzione della birra, c’erano anche altri microrganismi che abbassavano il livello di produttività o rovinavano la fermentazione. Parlò per la prima volta di coltura mista, ossia vari microrganismi presenti. Se il responsabile di una catena metabolica è solo un microrganismo, per poter avere il prodotto bisogna avere solo quel tipo di microrganismo, tutti gli altri non devono essere presenti in quanto entrano in competizione. Pasteur capì che bisognava isolare il microrganismo responsabile del prodotto, facendo una coltura pura di un solo microrganismo, rimetterlo nella produzione ed evitare che altri microrganismi potessero inquinarlo. Si parla di cloni di un’unica cellula che si è divisa per dare origine a cellule che sono tutte geneticamente uguali tra loro. La coltura pura è molto importante per studiare un singolo microrganismo, se si vuole associare un microrganismo a una determinata patologia.

Molto importante fu anche Hans Christian Gram, che ha diviso il mondo dei microrganismi in due parti: una che è positiva alla sua colorazione, una che è negativa. Si parla dunque di batteri Gram positivi (colore viola) e Gram negativi (colore rosa). La prima cosa che viene fatta per classificare un batterio è appunto la colorazione di Gram. Visto il periodo, di peste, tubercolosi, si associano alle malattie i microrganismi. Robert Koch fu molto importante per l’associazione di un agente infettivo a una malattia, egli studiava l’antrace, un batterio che dà origine al carbonchio, una malattia degli animali, esso è un batterio sporigino che diventa poi spora. Si è parlato anche di “guerra biologica”, armi contenenti polveri di antrace, utilizzate dalle grandi potenze. Koch fu il primo a riuscire ad isolare da una malattia infettiva, l’agente infettivo, ossia il batterio del carbonchio. Per poter isolare i microrganismi, bisogna avere un terreno solido: per poterlo ottenere egli mise la gelatina nel terreno di coltura. Attualmente la gelatina non viene utilizzata, perché attaccata da alcuni microrganismi ma viene utilizzata l’agar. Per studiare i microrganismi egli utilizzò nuove tecniche di colorazione e coltura. Dopo il carbonchio egli si è dedicato al tubercolare, la cui struttura non reagisce con la colorazione di Gram, quindi, è stata utilizzata una colorazione che ha permesso di studiare il tubercolare e ha permesso a Koch di dare i quattro postulati che sono alla base dell’associazione causa-effetto che lega un agente a una malattia. Egli, come prima cosa, ha isolato da un animale l’agente infettivo. Ma il microrganismo che deve essere isolato, deve essere fatto crescere in coltura pura. Per essere sicuri che sia il responsabile della malattia, Koch l’introduce in un topo, in modo che si verifichi la stessa patologia. Siccome i microrganismi hanno una variabilità enorme, si deve essere sicuri che il microrganismo introdotto, sia uguale a quello isolato, per cui deve essere nuovamente isolato in modo da essere uguali. Proprio perché le malattie sono multifattoriali, non c’è un’associazione registrata, per questo bisogna rispettare i quattro postulati.

Vaccini e antibiotici

I vaccini hanno avuto un enorme impatto nel ridurre la malattie infettive e la morte ad esse associate. Storicamente, la vaccinazione è iniziata circa 2000 anni fa in Cina e in India contro il vaiolo, una malattia infettiva che ha decimando la popolazione mondiale. Anni dopo, ovvero nel 1796, il medico inglese Jenner riprese questa antica procedura: utilizzò del materiale proveniente da una pustola infetta da vaiolo bovino per poi inocularlo in un bimbo di 8 anni, che risultò essere poi immune alla malattia. Il processo prese il nome di vaiolizzazione. Grazie al vaccino contro il vaiolo oggi possiamo dire di aver estinto questa malattia. Nel 1942 il microbiologo Fleming scoprì per caso la Penicillina, il più largamente usato tra gli antibiotici. Fleming si scordò di alcune piastre lasciate sotto incubazione. Quando le andò a riprendere per buttarle si accorse della presenza di una cosa anomala: sulla piastra era cresciuta una muffa che impediva la crescita microbica. Fleming la studiò e scoprì che questa muffa era capace di uccidere i batteri.

Virologia

Nel 1899 Beijerink scoprì il virus che causava il mosaicismo nelle piante di tabacco. Egli prese delle foglie di tabacco malate e le filtrò: il filtrato era privo di batteri in quanto troppo grandi per passare attraverso il tessuto usato per il filtraggio, quindi il filtrato avrebbe dovuto contenere solo acqua. Egli poi mise il filtrato a contatto con altre piante di tabacco però sane che dopo un po’ di tempo contraevano anch’esse la malattia. Da qui capì che doveva esserci qualcosa, che lui chiamò ultrafiltrato, che causava la malattia. Successivamente Reed capì che questi organismi piccolissimi erano dannosi per la salute. Nel 1915 vengono scoperti i virus dei batteri anche chiamati batteriofagi o solo fagi.

Microbiologia moderna

Nel 1928 esperimento di Griffith con il Pneumococcus pneumoniae. Egli fece delle piastre con agar e sangue. Su queste piastre mise questo batterio e notò una cosa strana: da una parte era cresciuta una colonia con i bordi ruvidi (ceppo R) e una colonia con i margini lisci (ceppo S).

• Per prima cosa inoculò il ceppo R in un topo (cavia) ma il topo restava vivo, quindi la malattia non si presentava;
• Poi inoculò il ceppo S nel topo e dopo un po’ il topo moriva;
• Poi mise il ceppo S a bollire in modo da uccidere il batterio per poi inocularlo nel topo che viveva, quindi non manifestava la malattia;
• Infine mise insieme il ceppo S morto e il ceppo R vivo e lo inoculò nel topo, l’atteso era che il topo restasse vivo poiché il ceppo S che causava la malattia era stato ucciso e il ceppo R non era capace di infettare, invece il topo moriva.

Allora Griffith capì che c’era qualcosa, che chiamò prima pabulum e poi trasformato in principio trasformante, che passava dal ceppo S morto al ceppo R vivo rendendolo infettante, cioè capace di provocare la malattia. Tuttavia, siccome all’epoca si pensava che il mondo fosse fatto solo di proteine e che fossero proprio le proteine a portare le informazioni, egli non venne creduto in quanto le proteine, in seguito al calore, venivano distrutte e quindi non poteva esserci nient’altro capace di essere trasferito da una cellula all’altra. In contemporanea Avery stava studiando altre molecole attraverso la quale capì che a essere trasferite non erano le proteine ma bensì il DNA.

Nel 1953 Watson e Crick scoprirono il DNA a doppia elica che poi fu alla base della scienza della vita. Crick enunciò il Dogma Centrale Della Biologia: DNA => RNA => Proteine Tuttavia questo Dogma venne poi smentito da Baltimon e Temin in quanto scoprirono quell’enzima presente nei retrovirus, cioè la transcriptasi inversa, che lavora esattamente al contrario: RNA => DNA => RNA => Proteine.

Nel 1973 Cohen e Bayer condussero un esperimento con E. coli. Egli misero un gene all’interno di E. coli attraverso il plasmide creando DNA ricombinate, per poi avere tanti cloni di E. coli che produrranno antibiotici, ormoni ecc. Tuttavia con questa tecnica potrei teoricamente creare delle armi letali (biologiche) e questo ha creato delle barriere sociali ed etiche. Nonostante ciò loro mandarono avanti la ricerca data la sua importanza. Nel 1977 cominciano i primi sequenziamenti del DNA. Nel 1995 è stato sequenziato interamente il primo genoma batterico: Haemophylus influenzae. Il genoma dei batteri è un genoma in continua evoluzione, specialmente per quelli che vivono in ambienti in cui sono presenti altri microrganismi, in cui avviene l’aumento del numero delle base (ne perde alcune e ne aumenta altre) in modo da adattarsi ai vari cambiamenti ambientali. In questo modo acquisiscono dei geni che li rendono capaci di resistere alle varie alterazioni esterne (antibiotico resistenza).

Pan genome

Il genoma dei batteri è costituito da una piccola parte di geni essenziali per la vita (riproduzione, trascrizione, traduzione ecc) e da un’altra grossa parte in cui una parte di geni sono quelli che caratterizzano la specie, mentre l’altra parte, che è quella variabile, contraddistingue i vari ceppi all’interno di una specie. Questo permette ai singole ceppi di sopravvivere alle variazioni ambientali. Questa plasticità nel loro genoma è molto pericolosa perché può essere causa dell’insorgenza di altre malattie oppure di “vecchie” malattie che però sono provocate da altri agenti patogeni. Alcuni agenti patogeni possono contaminare anche gli alimenti. In particolare parliamo di E. coli: nel corso del tempo ha acquisito diversi geni dall’esterno che gli hanno permesso di arrivare ad avere da 4,8 milioni di basi ad averne molto di più (quasi 1 milione in più) diventando molto pericoloso per la salute. Superbugs: sono dei microrganismi che hanno acquisito una multiresistenza verso varie classi di antibiotici.

Origine dei microrganismi

Tutti i meccanismi biologici hanno un meccanismo comune e per questo motivo tutti gli organismi viventi possono essere ricondotti ad un'unica cellula ancestrale chiamata LUCA, da cui si sono poi originati i diversi organismi attraverso selezione naturale. La prima molecola a formarsi fu l’RNA da cui poi si sono formate le proteine e successivamente il DNA. Da questo si evolveranno poi i tre domini: Archea, Bacteria ed Eucarya. Da questo pool di proteine e di DNA si è formato LUCA (Last Universal Common Ancestor). Questo è stato possibile grazie al fatto che l’RNA è capace di autoreplicarsi e ad esso si sono legate varie molecole per la formazione di diverse proteine. Dalle proteine si sono formate delle vescicole fino alla formazione della cellula completa con all’interno il DNA. Dai domini si sono originati i 5 regni.

Inizialmente gli Archea e i Batteri erano considerati un unico phylum ma successivamente si è capito che gli Archea erano un phylum a parte. Questo è successo perché entrambi sono unicellulari con una struttura esterna simile ma tuttavia presentano delle differenze a livello dei ribosomi e inoltre gli Archea, come gli eucarioti, non sono sensibili agli antibiotici, a differenza dei batteri. I Batteri sono privi di nucleo, mitosi, mitocondri e altri organuli (tranne ribosomi), si riproducono per scissione binaria e sono presenti in tutti gli ambienti.

Classificazione batteri

• Analisi genetica: % di G + C (ibridazione del DNA);
• Analisi delle sequenze.

Il punto di riferimento per la tassonomia dei procarioti è il manuale di Bergey. Per i microrganismi parliamo di:

• Famiglia: gruppo di generi correlati;
• Genere: gruppo di specie correlate;
• Specie: gruppo di cellule correlate.