Appunti di microbiologia

ATP).

Nei sistemi chiusi (colture di batch) le risorse alimentari sono limitate e la crescita

esponenziale si ferma quando queste si esauriscono o quando si accumulano i

prodotti di scarto, perciò la resa di crescita è molto bassa. Per ovviare a questo

problema si utilizzano le colture continue (in grossi volumi): una coltura continua è

un sistema aperto in cui i nutrienti vengono aggiunti a tasso costante nel recipiente di

coltura. Per mantenere costante anche il volume, il

sovrabbondante è allontanato con lo stesso ritmo,

rimuovendo anche i prodotti di scarto e le cellule in

eccesso. In queste condizioni la popolazione batterica

crescerà all’inizio in modo esponenziale e al massimo

tasso di crescita, successivamente la sua velocità di

crescita sarà influenzata dalla velocità con cui verranno

aggiunti i nutrienti sotto forma di terreno fresco. Una volta

aggiunti i nutrienti l’intero volume dovrà essere agitato per

garantire la giusta distribuzione di essi ed evitare che le

cellule vadano sul fondo causando sovrapposizione e

aumento di pressione, che potrebbe causare la morte delle cellule. Un tipo di sistema

per la coltura continua è il chemostato.

La velocità di diluizione D del terreno fresco immesso nel volume è data dal

rapporto tra F/V x h^-1. D = ( Fxh)/V

F = quantità di terreno immesso per ora.

V= volume totale .

Esempio : F = 30 mL per ora, V= 100 mL, D = 0,3 / h

Il reciproco di D invece, ci dice il tempo di residenza R del terreno fresco all’interno

del volume.

Nel chemostato la coltura è influenzata dalla concentrazione del substrato.

All’aumentare della concentrazione del nutriente limitante, e con la velocità di

diluizione che rimane costante, anche la concentrazione delle cellule aumenterà,

mentre la velocità di crescita rimarrà invariata. Quando la concentrazione

complessiva delle cellule e il rifornimento dei nutrienti sono bilanciati e hanno

raggiunto l’equilibrio, allora il sistema ha raggiunto lo steady state (stato di

equilibrio). I sistemi aperti diventano importanti anche per il controllo del ceppo : si

controlla il ceppo prima e dopo essere stato sottoposto alla coltura aperta per

verificare se il ceppo ha subito delle mutazioni nel corso del procedimento.

Fermentatori industriali

I vantaggi della fermentazione continua:

 La produzione della biomassa e degli altri prodotti avviene in condizioni

costanti e ottimali

 La produttività di un impianto continuo è superiore a quella di un

discontinuo perché non ci sono tempi morti

 Il tasso di crescita specifico può essere variato

 Si può studiare la cinetica del processo e valutarne le rese al variare dei

parametri principali

In una fermentazione continua però bisogna:

 mantenere costante la sterilità per lunghi periodi

 evitare la degenerazione dei ceppi, soprattutto per mutazione spontanea

 recuperare il prodotto da grossi volumi di brodo in cui è presente in

concentrazione molto bassa

 limitarsi a ottenere prodotti associati allo sviluppo dei microrganismi

(metaboliti primari) e mai formantisi durante lo stato stazionario di

crescita (metaboliti secondari)

La produzione può essere in : larga scala (etanolo e polisaccaridi), media scala

(antibiotici ed enzimi) e in piccola scala (vaccini, vitamine). Per le produzioni in

media e piccola scala l’importante è il prodotto e non la quantità (anche se il costo è

eccessivo) perché si ha la necessità di produrlo, per la larga scala invece è anche

importante considerare i costi del processo.

Fermentazioni di primo tipo : sono quelle in cui il prodotto principale è il risultato

diretto del metabolismo energetico primario con correlazione ponderale (e in genere

anche stechiometrica) tra substrato e prodotto come: fermentazione alcolica dei

lieviti, fermentazione batterica omolattica, la biomassa stessa.

Fermentazioni di secondo tipo : pur derivando il prodotto principale dal metabolismo

energetico, la velocità di formazione del prodotto non è sovrapponibile e quella di

consumo del substrato in quanto la fermentazione si svolge in due stadi; prima cresce

la biomassa con scarsa formazione di prodotto poi la situazione si inverte con stasi

della biomassa e formazione del prodotto. Succede nella produzione di: acido citrico

e acido itaconico.

Fermentazioni di terzo tipo : il prodotto non proviene da biosintesi del metabolismo

primario per cui, dopo una prima fase con grande consumo del substrato produzione

di biomassa e nessuna formazione di prodotto, segue un periodo in cui avviene il

contrario: il prodotto è formato dal metabolismo collaterale (secondario) dei batteri

che avviene quasi all’inizio della fase stazionaria. E’ una situazione che si verifica

per: antibiotici ed enzimi esocellulari.

Funzioni principali di un bioreattore:

- mantenere la sterilità : in particolare si deve fare attenzioni all’apertura del

reattore per introdurre sonde di controllo o altri tipi di sonde;

- mantenere l’omogeneità attraverso la costante agitazione;

- permettere gli scambi gassosi (soprattutto O2)

- termostatazione

Caratteristiche generali :

- capienza : da 20 L a 200-300 m^3

- la maggior parte utilizzano colture sommerse

- materiale: acciaio inox, vetro, rame, alluminio, legno

- deve resistere alla corrosione

- forma cilindrica : permette un miglior scambio di materia e sono più facili da

sterilizzare

- viene riempito per ¾

- massima pressione tollerata: 3,8 – 4,1 bar

- massima temperatura tollerata : 150 – 180 °C, di solito si sterilizza a 120°C

- deve tenere il vuoto per evitare le implosioni ( depressione durante la fase di

raffreddamento )

- non devono essere presenti delle zone difficili da sterilizzare

- rivestito da una camicia isolante esterna

Schema di un processo fermentativo

Qualunque processo biotecnologico può essere suddiviso in tre parti:

1) Operazioni che precedono la fermentazione, ovvero tutti gli stadi di

preparazione del substrato, dell’inoculo e, per i processi aerobi, dell’aria

2) La fermentazione vera e propria

3) Stadi successivi alla fermentazione, ossia tutte le operazioni di separazione dei

prodotti di reazione dal substrato residuo (brodo di fermentazione esausto) e

dalle cellule (biomassa)

Materie prime

Non possono usati gli stessi ingredienti usati per costituire i terreni in laboratorio:

solitamente vengono usati gli scarti dell’industria alimentare o dell’agricoltura

(cereali, frutta, latte scaduto). Anche l’acqua usata per il lavaggio dei suini vengono

utilizzare in quanto sono ricche di azoto.

Sterilizzazione

Sono utilizzate alte temperature per brevi periodi: si immette vapore acqueo sotto

pressione in un flusso costante di terreno freddo; dopo un determinato arco di tempo

si assicura la sterilità. Un sensore rileva la temperatura raggiunta nel terreno e di

conseguenza il flusso della pressione. Vanno comunque tenuti in considerazione la

massa del terreno da sterilizzare e gli effetti del riscaldamento su alcune componenti

del terreno.

Antischiuma

Nei processi fermentativi condotti in aerobiosi, la natura stessa dei terreni colturali e

il continuo mescolamento danno luogo alla formazione di schiume elevate e

persistenti che, se non controllate, possono influire negativamente sull'intero processo

in quanto :

- riducono l'ossigenazione della coltura,

- trascinano in superficie parte delle cellule e dei costituenti del terreno colturale

stesso, abbassando le rese in prodotto.

- tendendo a fuoriuscire dal fermentatore, diventano facilmente veicoli di

inquinamento.

Il controllo delle schiuma, indispensabile per la buona riuscita di un processo, viene

in genere ottenuto aggiungendo alla coltura tensioattivi opportunamente scelti. Come

tensioattivi si usano in genere, oli animali o vegetali provenienti sempre dai prodotti

di scarto, siliconi, alcoli a lunga catena, polieteri.

Nelle scelte della sostanza da usare vanno tenuti presenti i seguenti criteri:

1) deve essere poco solubile nel terreno colturale, disperdersi rapidamente in esso ed

agire a basse concentrazioni;

2) non deve essere tossico per il microrganismo e non deve influire negativamente

sulla via biosintetica interessata nella formazione prodotto;

3) deve essere sterilizzabile;

4) non deve conferire odori e sapori particolari al terreno colturale stesso. Ciò è

particolarmente importante quando i prodotti ottenuti sono destinati alla

alimentazione umana o animale. In questo caso, inoltre, il tensioattivo non deve

essere tossico nemmeno a basse dosi;

5) non deve interferire nei processi di estrazione del prodotto.

Inoculo

Solitamente viene inserito all’interno del reattore un volume di coltura pari a 1/20 del

volume totale del bioreattore. L’inoculo viene preparato in un germinatoio, recipiente

simile al fermentatore ma di dimensioni più piccole, e poi pompato nel fermentatore.

All’interno del germinatore le cellule si sviluppano in modo da essere inoculate già

sviluppate all’interno del reattore (per abbreviare i tempi).

Estrazione

Non tutti i prodotti sono presenti in grosse quantità perciò esistono diverse tecniche di

estrazione (solitamente è una estrazione chimica). In generali i passaggi

dell’estrazione sono :si ha prima l’eliminazione dei materiali insolubili (come i

microrganismi), poi l’ estrazione di altri soluti che non servono ,successivamente il

prodotto diluito viene concentrato e infine purificato.

Classificazione dei bioreattori :

Tra i tanti sistemi prodotti nel tempo, il più utilizzato è il criterio che classifica i

bioreattori in base al tipo di agitazione che viene impiegato. Si distinguono così

almeno quattro categorie di reattori:

- con agitazione meccanica interna;

- con mescolamento per immissione di gas a pressione (agitazione pneumatica);

- con pompa esterna per il ricircolo del liquido (agitazione idraulica);

- a letto fisso impaccato e a letto fluido (meno possibilità di inquinamento):

presenta un substrato fisso sulla quale viene in seguito fatta passare la coltura.

Controllo dei microrganismi

Attività antimicrobica

- Sterilizzazione : è l’eliminazione di ogni forma di vita (comprese le spore e i

virus);

- Disinfezione : distruzione mirata dei patogeni con agenti fisici o chimici. Con i

disinfettanti ordinari possono non essere eliminate spore, batteri resistenti,

virus più resistenti. (Bacillo di Kock). I disinfettanti sono applicabili solo su

superfici inanimate e la loro l’azione è di tipo microbicida. Per ottenere

l’effetto desiderato deve essere usato alla più alt