Appunti di Microbiologia

Storia della microbiologia

La microbiologia è una disciplina scientifica che studia la vita di “piccoli” organismi. L’esistenza di questi organismi non visibili ad occhio nudo fu ipotizzata già dagli antichi greci, che però, non avendo a disposizione i mezzi necessari per vederli, non ne poterono mai verificare l’effettiva esistenza. Questa disciplina nasce, sicuramente, con l’invenzione degli strumenti necessari per osservarli.

Il contributo di Leuwenhock

Nel 1700 Leuwenhock inventò il microscopio. Egli era un benestante mercante olandese, che avendo curiosità di scoprire se ci fosse vita in una goccia d’acqua iniziò ad utilizzare dei sistemi di piastre metalliche, lenti e viti per osservare dei campioni che dovevano essere posizionati nello strumento stesso. Ogni strumento, però, doveva essere costruito in base al campione che doveva essere osservato. Alcuni suoi appunti sono ancora conservati e ritraggono le forme che egli riuscì ad intravedere nei campioni osservati.

Spallanzani e Redi contro la generazione spontanea

Andando avanti nel tempo, Spallanzani e Redi misero in dubbio la teoria della generazione spontanea, che sosteneva che la vita nascesse direttamente dalla sostanza organica. Come esempio veniva presa la carne in decomposizione, in cui nascevano larve e poi mosche. Redi nel suo esperimento, ricoprì la carne con una retina e dopo pochi giorni notò che su di essa non nascevano le larve, dimostrando che le mosche, per nascere, dovevano necessariamente deporre le uova nella carne, che poi sarebbero diventate larve ed in seguito, mosche.

I sostenitori della teoria, però, continuavano a sostenere la sua validità, poiché se questa non era più valida per le mosche, o gli insetti in generale, per i batteri (con l’invenzione del microscopio si conoscevano) non era possibile ancora dire il contrario, poiché, dopo qualche giorno, la carne si decomponeva lo stesso anche in assenza di mosche. A questo punto Spallanzani, utilizzò un brodo di carne, che chiuse in un contenitore ermetico e lo scaldò. Dopo alcuni giorni, ancora il brodo non si era intorbidito e questo dimostrava che i batteri non si erano formati al suo interno (cosa che invece accadeva se si lasciava normalmente all’esterno).

I sostenitori ribatterono, visto che il contenitore era stato chiuso ermeticamente e questo non permetteva alle forme di vita di essere rifornite di ossigeno. L’esperimento di Spallanzani, anche se non confutò definitivamente la teoria della generazione spontanea, fornì l’idea generale ad Appert, che introdusse per la prima volta i cibi in scatola (Era Napoleonica).

Pasteur e la confutazione della generazione spontanea

Uno dei padri della microbiologia è sicuramente Pasteur. Egli confutò definitivamente la teoria della generazione spontanea utilizzando dei palloni in cui versò del brodo di carne. I palloni avevano un collo stretto e lungo e tramite l’utilizzo di una fiamma lo rimodellò piegandolo a forma di “collo di cigno” (il collo del pallone rimaneva comunque aperto e connesso con l’ambiente esterno). Conseguentemente scaldò il brodo e lo fece riposare. Pur essendo connesso con l’ambiente esterno, il brodo rimase limpido per giorni. Da questo constatò che i microrganismi nel brodo erano stati uccisi e nonostante questo fosse a contatto con l’aria, non si intorbidiva e non si aveva generazione spontanea di batteri.

Egli notò anche che nella curva del collo, nel bordo, si poteva osservare una parte appannata dovuta alla polvere trascinata dall’aria e che poteva sicuramente trasportare anche batteri. Per capire se la sua seconda constatazione fosse corretta, inclinò il pallone mettendo in contatto il brodo con la parte del collo appannata. Dopo poco tempo notò che il brodo si era intorbidito. Questo, oltre che confutare definitivamente la teoria, ha permesso di trarre una seconda conclusione, ossia che, effettivamente, erano presenti organismi nell’aria.

Con la seconda conclusione, Pasteur, individuò l’importanza dei microrganismi nelle malattie infettive e nei processi industriali. La correlazione fra batteri e malattie infettive non era al tempo scontata. Questa consapevolezza permise di tenere sotto controllo un’epidemia di tifo a Londra, che era causata dall’approvvigionamento da un pozzo contenente acqua contaminata.

Lister e l'introduzione dell'asepsi chirurgica

Nel 1867, Lister introdusse l’asepsi chirurgica con uno spray di fenolo. Questo rivoluzionò completamente il risultato di operazioni chirurgiche, le quali, anche se andavano a buon fine, nella maggior parte dei casi il paziente finiva comunque per morire di infezione.

Koch e la batteriologia medica

Koch istituì le basi della batteriologia medica (postulati di Koch dimostrano incontrovertibilmente che un determinato organismo è responsabile di una determinata patologia) e a lui è attribuita la scoperta del patogeno responsabile della tubercolosi.

Postulati di Koch:

• Il microrganismo deve essere presente in tutti gli individui malati, ma essere assente in tutti quelli sani. Per dimostrarlo sviluppò una colorazione che permette di individuare microrganismi nei tessuti di un individuo.
• Il microrganismo sospetto deve essere isolato e cresciuto in laboratorio in una coltura pura. Utilizzò del siero proveniente da sangue coagulato.
• Il microrganismo deve essere inoculato in un soggetto sano e la stessa malattia si deve presentare. Il batterio venne inoculato in dei porcellini d’India.
• Dal soggetto malato deve poter essere isolato lo stesso organismo. Dai porcellini d’India ricavò nuovamente il batterio tramite il siero del sangue coagulato.

Importanza della microbiologia

La microbiologia è basilare per diverse discipline scientifiche di tipo biologico, in particolare quelle applicative.

Caratteristiche dei microrganismi

• Sono all’origine di tutte le forme viventi.
• Hanno una diversità filogenetica superiore a quella delle piante e degli animali.
• Sono estremamente numerosi.
• Crescono in qualunque ambiente, basta che ci sia acqua allo stato liquido.
• Sono responsabili delle trasformazioni della materia necessarie per la vita.
• Trasformano la geosfera.
• Influenzano il clima.
• Sono coinvolti in simbiosi con piante, animali ed altri microrganismi.
• Causano malattie.
• Influenzano il comportamento delle piante e degli animali.

Uso dei microrganismi

• Sono utilizzati per svolgere reazioni chimiche di rilevante importanza industriale.
• Vengono modificati geneticamente per produrre proteine utili (es. vaccini).
• Possono migliorare la produzione e conservazione degli alimenti.
• Possono contribuire alla salute pubblica (es. impianti di depurazione delle acque).
• Biorisanamento di siti inquinati.
• Uso malevolo: armi biologiche, bioterrorismo.

Tecniche microbiologiche

Sterilizzazione

Consiste nell’uccisione o rimozione di tutti gli organismi viventi e dei loro virus presenti in un campione o in un terreno di coltura. Ce ne sono di diversi tipi:

• Sterilizzazione mediante calore: Si uccidono i microrganismi fornendo calore al campione in esame. La percentuale di microrganismi che vengono uccisi è costante nel tempo e, in generale, il tempo che ci vuole a portare la popolazione a soglie prossime allo zero è tanto minore quanto la temperatura è più alta. Un fattore importante per paragonare temperature diverse a cui sono esposti i microrganismi è il calcolo del tempo di riduzione decimale, che è il tempo necessario per uccidere il 90% delle cellule presenti (ovvero per far in modo che rimangano in vita soltanto il 10% delle cellule).
• Per esempio: se lavoriamo a 50°C abbiamo una sopravvivenza del 10% dopo 40 minuti, se lavoriamo a 60°C abbiamo una sopravvivenza del 10% dopo 12 minuti e se lavoriamo a 70°C dopo circa 4 minuti. Quindi il tempo di riduzione decimale diminuisce man mano che si aumenta la temperatura. Ci dice anche che, visto che il grafico è in scala logaritmica, non si otterrà mai una sterilizzazione completa dei microrganismi (non è possibile calcolare il logaritmo di 0). Quindi non si può parlare in modo effettivo di sterilizzazione, ma si può introdurre il concetto di probabilità statistica, calcolando la probabilità che rimanga qualche organismo vivo (ossia la probabilità che vi sia un organismo vivo in una quantità considerata di volume).
• Un altro concetto da tenere a mente è la relazione tra temperatura e tasso di letalità. Se ad esempio si prendono in considerazione due popolazioni batteriche, A e B, che se vengono esposte a calore, entrambe risentono del fattore di riduzione decimale, il cui tempo si abbassa con l’aumentare della temperatura. Se però la popolazione A ha tempo di riduzione decimale sempre minore a B per ogni valore di temperatura, allora si può concludere che A sia più sensibile alla stessa. Ogni microrganismo, infatti, ha una sua temperatura ottimale per la crescita e quindi bisognerà tenere presente la temperatura di sterilizzazione. Normalmente nei campioni sono presenti diverse popolazioni e se si vuole sterilizzare bisogna tener conto anche di quelle più resistenti alla temperatura.
• Per eliminare batteri, in laboratorio, ci si può servire di diversi strumenti:
• Fiamma: In laboratorio viene utilizzata la fiamma di un becco Bunsen per sterilizzare anse, aghi, bacchette di vetro. Su grande scala usato l’incenerimento. Potrebbe incenerire anche il campione, quindi non può essere utilizzata per selezionare popolazioni batteriche. La fiamma crea una corrente d’aria ascensionale che non permette ai microrganismi di ricadere negli oggetti circostanti, ma possono anche strappare gli organismi dal campione.
• Calore secco: In stufa a 160°C per almeno 2-3 ore; l’aria è un cattivo conduttore per cui sono necessari tempi lunghi. Utilizzato per vetreria ed altro materiale resistente al calore. Nella fase di aumento della temperatura la cellula perde acqua e diventa, però, anche più resistente al calore (in modo limitato comunque). Tutto ciò che deve essere mantenuto sterile deve essere, in ogni caso, sigillato, perché una volta aperta la stufa, microrganismi possono ricadere negli oggetti, contaminandoli nuovamente.
• Calore umido: Usata nell’autoclave. Nella camera dove viene inserito il campione, l’aria è sostituita dal vapore acqueo, generato dall’acqua presente all’interno, che evapora. La camera è chiusa per cui è possibile aumentare la pressione (+1 atm. = 120°C). Sono necessari circa 30 min. Utilizzata per sterilizzare soluzioni (es. terreni di coltura). Per ottenere la sterilizzazione il campione deve venire a contatto con il vapore. L’autoclave è in grado di uccidere anche i batteri più resistenti al calore (anche quelli che formano spore), facendolo in temperature e tempi minori (il calore viene trasportato dal vapore acqueo). In alcuni casi si fa uso del vapore fluente, in questo caso la valvola non viene chiusa e ci si ferma a 100°C, ma non si uccidono le spore con questo metodo. In autoclave i lieviti e le muffe sono i più sensibili, poi si hanno i batteri (quelli mesofili) ed infine i virus.
• Pastorizzazione: Scaldare a 60°- 65°C per 30 min. Uccide solo alcuni microrganismi (riduce la carica microbica). Il latte viene pastorizzato per eliminare i batteri patogeni. Nella pastorizzazione istantanea si scalda a 71°C per 15 secondi; questo consente di applicare il processo in continuo. Il processo non uccide i lattobacilli.
• Sterilizzazione mediante radiazioni:
• Raggi UV: I più efficaci sono quelli a 260 nm, perché agiscono sul DNA (dimeri di timina, mutazioni). Non penetrano, per cui sono usati principalmente per sterilizzare superfici (es. stanze, cappe, ecc.). Sono dannose anche per l’operatore. Nelle cappe da laboratorio sono spesso utilizzate per mantenere l’ambiente a bassa carica batterica.
• Raggi X e γ: Sono pericolosi perché molto penetranti. Richiedono particolari apparecchiature. Uccidono le cellule perché causano la formazione di ioni. I raggi γ sono usati per sterilizzare materiale plastico monouso (es. siringhe) già chiuso nelle confezioni. A livello industriale sono molto utilizzate. A livello alimentare si possono utilizzare basse dosi di radiazioni per sterilizzare frutta e verdura.
• Sterilizzazione mediante filtrazione: Metodo che non uccide i microrganismi, ma li rimuove dal campione liquido, che viene fatto passare in un imbuto alla cui estremità è presente una membrana filtrante (nitrocellulosa con pori di 0,45 o 0,22 micron). Le cellule batteriche (circa 1 micron) non riescono a passare oltre la membrana. Per velocizzare la filtrazione, la beuta codata su cui viene raccolto il liquido, viene collegata ad una pompa a vuoto, che lo aspira attraverso il filtro. È un sistema delicato per trattare il campione e non lo danneggia, d’altra parte i virus e le impurezze non possono essere filtrate. A livello industriale viene utilizzata nella produzione di vino e birra e mediante filtrazione si rimuovono i lieviti. Per volumi molto piccoli si possono utilizzare siringhe alla cui estremità viene collegato un filtro.

Sostanze chimiche disinfettanti

• Fenolo e derivati: Primo agente disinfettante utilizzato. Attualmente il fenolo e i suoi derivati, come i cresoli, sono impiegati come disinfettanti nei laboratori ospedalieri. Agiscono denaturando le proteine e disgregando le membrane. Efficaci in presenza di materiale organico e sono attivi per lungo tempo sulle superfici su cui vengono applicati. Emanano un odore pungente e sgradevole e possono causare irritazioni cutanee.
• Alcoli: Sono tra i disinfettanti e antisettici più utilizzati. Non sono efficaci sulle spore. I più utilizzati sono l’etanolo e l’isopropanolo al 70-80%.
• Acqua ossigenata (H₂O₂): Normalmente utilizzata al 3%. Deve il suo effetto al fatto che rilascia ossigeno.
• Alogeni: Cloro (Cl₂) + H₂O → HCl + HClO) → (HClO → HCl + O): Il cloro è il disinfettante di scelta per le acque. Il cloro gassoso in acqua forma acido ipocloroso, che a sua volta libera ossigeno, svolgendo quindi una forte azione di ossidazione. Lo iodio viene usato come antisettico cutaneo e svolge la sua azione per iodinazione delle proteine cellulari.
• Sali dei metalli pesanti: I più usati sono argento e mercurio, che però sono piuttosto tossici. Un’eccezione è il nitrato d’argento che in soluzione all’1% viene instillato negli occhi dei neonati dopo il parto per prevenire infezioni provenienti dalla madre.
• Formaldeide (R-SH + HCHO → R-S-CH₂OH): Agisce legandosi ai gruppi solfidrilici. In soluzione acquosa al 37% è chiamata formalina ed è usata per la conservazione dei campioni biologici.
• Beta-propiolattone: Ha proprietà simili all’ossido di etilene. Agisce molto rapidamente e, in soluzione acquosa, è idrolizzato ad acido acrilico, che è una forma inattiva.
• Ossido di etilene: Bolle a 10,8°C per cui è gassoso a temperatura ambiente. Molto efficace e molto penetrante. Viene usato mescolato a CO₂, perché esplosivo. È estremamente volatile. Il trattamento con questa sostanza viene effettuato in speciali camere.

Uso dei disinfettanti nell’industria

I disinfettanti vengono utilizzati in diverse applicazioni industriali per garantire la sterilizzazione e la sicurezza dei prodotti e delle superfici.

Terreni di coltura

Sono le soluzioni nutrienti usate per far crescere i microrganismi in laboratorio. Ogni microrganismo ha richieste nutrizionali diverse, quindi a seconda dell’organismo preso in considerazione, dovremo utilizzare un terreno contenente nutrimenti differenti. Si possono dividere in due grandi gruppi in base alla composizione:

• Terreni minimi (chimicamente definiti): Sono preparati con precise quantità di sostanze organiche ed inorganiche, è nota l’esatta composizione chimica.
• Terreni massimi (o terreni complessi): Contengono sostanze altamente nutritive, ma chimicamente indefinite (non conosciamo né quali sono le sostanze presenti né la loro concentrazione).

I terreni di coltura solidi sono ottenuti inserendo all’interno della miscela una polvere, chiamata agar (polisaccaride ottenuto da alghe), che si scioglie ad alte temperature durante la sterilizzazione del terreno stesso, che generalmente avviene in autoclave. L’agar ha punto di fusione e solidificazione differenti (sciolta ad 85°C rimane liquida fino a che non raggiunge i 45°C, questo permette di aggiungere eventuali sostanze termolabili preparate a parte dopo la sterilizzazione e prima della solidificazione). Viene fatto solidificare in piastre Petri o provette, formando un gel che permette la diffusione di sostanze nutrizionali, fruibili alle colonie batteriche in superficie. L’agar è un substrato inerte poiché sono pochi i batteri in grado di degradarlo. Una volta deposto il batterio nel terreno, questo comincia a dividersi formando un ammasso di cellule chiamato colonia (si parla di colonie soltanto nei terreni solidi).

Ingredienti base dei terreni minimi

Acqua, 1 litro di K₂HPO₄, 1g di MgSO₄·7H₂O, 200 mg di FeSO₄·7H₂O, 10 mg di CaCl₂, 10 mg, Elementi in traccia (Mn, Mo, Cu, Co, Zn). Gli elementi indispensabili per la sopravvivenza dei microrganismi, sono carbonio e azoto. Questi possono essere reperiti dall’atmosfera, ma molte volte non bastano ai microrganismi, quindi è necessario effettuare delle aggiunte, come NH₄Cl, glucosio e altre. Altri elementi hanno la loro specifica funzione nel terreno.