Appunti di lezione Biochimica alimentare

Biochimica alimentare: lezione 1

La qualità di una proteina

La qualità di una proteina dipende dalla sua struttura tridimensionale, che a sua volta è influenzata da:

• Modificazioni strutturali:
  • Proteine strutturali degli alimenti (actina/miosina): La trasformazione alimentare comporta una modifica strutturale di una proteina come la conversione del muscolo in carne.
  • Proteine di riserva (semi, uovo): Gli impasti, la meringa e la maionese comportano una modifica della struttura tridimensionale di una proteina, che porta ad organizzarsi in maniera diversa.
  • Secreti proteici (latte): Le proteine del latte sono presenti come componenti solubili.
• Modificazioni funzionali: Ci sono alcune proteine (enzimi) che sono dei catalizzatori e hanno un ruolo importante nel catalizzare il prodotto in una trasformazione. Sono utilizzate nei metodi di conservazione, in specifici processi e a scopo analitico per determinare un composto.

Lezione 2: La solubilità delle proteine

La solubilità di una proteina è influenzata dalla modifica della sua struttura nativa (nella maggior parte dei casi). Ma ci sono alcuni casi come il ruolo di ioni e del pH che modificano la solubilità di una proteina senza modificare la sua struttura nativa. Anche i fenomeni di salting in o salt out (forza ionica) modificano la solubilità delle proteine mantenendone la sua struttura nativa. Nello specifico esistono alcuni sali o trattamenti tecnologici che possono fare acquisire alle proteine una struttura denaturata caratterizzata da una diminuzione di solubilità rispetto alla proteina nativa.

Classificazione dei sali

• Sali strutturanti ("Structuring"): Stabilizzano la struttura di una proteina. Si tratta di sali che hanno una sfera di solfatazione molto estesa, che va a schermare le cariche superficiali delle proteine con effetto stabilizzante. Questi sali vengono definiti sali liofilici (es. Cs⁺; SO₄^2-; HPO₄^2-).
• Sali destrutturanti ("De-structuring"): Sono in grado di modificare la struttura nativa di una proteina, facendogli assumere una struttura denaturata. Questi sali sono caratterizzati da una modesta solvatazione e conseguentemente possono penetrare nella struttura proteica andando a interferire sulle interazioni elettrostatiche tra due residui amminoacidici carichi. Questo comporta quindi una denaturazione della proteina. Questi sali sono definiti sali lipofilici (es. Li⁺; ClO₄^-; SCN^-).

Esempi

• Esempio 1: Il ruolo dei sali che comportano variazioni di solubilità della proteina senza modifica della struttura nativa. Siamo in presenza di fenomeni di salting in (aumento della solubilità) o di salting out (decremento della solubilità).
• Esempio 2: Il ruolo di sali che comportano una modifica della struttura nativa della proteina, la proteina assume una struttura denaturata. Questa struttura denaturata, in dipendenza della forza ionica, può essere solubile o insolubile.
• Alimenti:
  • pH: Una variazione di pH è alla base della produzione di yogurt, dove la proteina interessata da una modifica di solubilità è la caseina.
  • Calore: Una variazione della struttura nativa a struttura denaturata di sieroproteine (beta-lattoglobulina e alfa-lattoalbumina) molto meno solubile indotta dal calore, è alla base della produzione della ricotta.
  • Ioni metallici: Una variazione di solubilità indotta da ioni bivalenti è alla base della produzione di un alimento quale il tofu.

L'azione dell'enzima-enzimi: chimosina su K-caseina comporta una variazione della struttura della micella che a sua volta comporta una variazione della solubilità della caseina con formazione di una struttura macroscopica che è alla base della produzione di formaggio.

Classificazione delle proteine dei cereali

Le albumine e globuline (proteine citoplasmatiche, prevalentemente enzimi) sono solubili in soluzioni acquose in assenza/presenza di sali. Le proteine di riserva dei cereali sono le prolamine (gliadine) che sono solubili in soluzioni alcoliche (70% alcool) e le gluteline (glutenine) che sono solubili in soluzioni alcaline o acide. Le gliadine e le glutenine costituiscono il complesso proteico del glutine.

Un altro esempio riguarda un metodo analitico per la distinzione di latte pastorizzato da latte UHT basato su variazione della solubilità delle proteine presenti nel latte. Le proteine del latte sono costituite da due frazioni principali: le sieroproteine e le caseine. Le caseine hanno un punto isoelettrico pari a pH 4,6. A pH pari a 4,6 le caseine sono insolubili (precipitano) mentre le sieroproteine che hanno un punto isoelettrico diverso sono solubili.

La legge per differenziare il latte pastorizzato e UHT è basata sulla determinazione della quantità di sieroproteine solubili al punto isoelettrico delle caseine (pH 4,6). Il trattamento termico comporta l’assunzione di una struttura denaturata delle sieroproteine che non è solubile a pH 4,6. Maggiore è la denaturazione delle sieroproteine e minore è la quantità di sieroproteine solubili a pH 4,6. Su questo principio è stata realizzata la legge per distinguere latte pastorizzato da UHT, o formaggi fatti con latte pastorizzato rispetto all’impiego di latte in polvere.

Gels proteici

Un gel è un sistema solido dove sono presenti grandi quantità di solvente. La formazione di gels proteici a livello molecolare è determinata da una variazione della solubilità delle proteine, indotta da diversi agenti. Nello specifico, la base di partenza sono gli arrangiamenti spaziali degli aggregati che hanno un impatto sulle proprietà reologiche, sensoriali e sulla capacità di trattenere acqua.

Gelatina proteina collagene

• Questo gel è l’unico gel reversibile (stabilizzato da interazioni ad idrogeno)
• Riscaldamento: le proteine si solubilizzano in acqua e si ha la rottura dei legami H, mentre i legami covalenti del collagene permangono.
• Raffreddamento: si formano i legami a H intermolecolari che generano una struttura reticolare con l’acqua intrappolata.

Il numero di legami covalenti tra i filamenti di tropocollagene serve a dare rigidità e il peso del soggetto.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche

È un gel irreversibile (proteine di soia ricche in AA acidi). Alimento: Tofu. Le proteine della soia come tali non hanno texture, ma hanno interessanti proprietà nutrizionali. Allo scopo di migliorare la texture ed il consumo, gli isolati proteici sono trattati con soluzioni di idrossido di calcio. In questo modo, i residui carichi di due proteine interagiscono con gli ioni calcio e formano una rete proteica all’interno della quale è trattenuta l’acqua. Si forma così un alimento con una texture che ne favorisce il consumo. Si utilizzano ioni bivalenti in quanto solo in questi ioni possono generare un reticolo proteico.

Gel stabilizzato da interazioni S-S intercatena

È un gel irreversibile (proteine ricche in CYS). Questi gels sono stabilizzati da interazioni covalenti inter-proteina tipo S-S dovuti all’interazione tra i residui SH dell’amminoacido cisteina. Questi gels sono possibili solo con proteine ricche in residui di cisteina e in seguito a denaturazione delle stesse. Queste interazioni S-S inter-proteina si generano in seguito a fenomeni di scambio di disolfuri o disulphide exchange. La proteina assume una struttura denaturata (inseguito ad un trattamento) che comporta l’esposizione di un residuo SH- una struttura denaturata che nella struttura nativa era all’interno cioè non esposto al solvente. Questo residuo può ora interagire con un gruppo cisteinico coinvolto in un legame S-S intracatena: si verifica quindi uno scambio di disolfuri cioè si forma un legame S-S inter-proteina (sono coinvolti il gruppo SH esposto e uno dei gruppi SH coinvolti nel precedente legame intra-proteina) e un gruppo SH libero (l’altro residuo cisteinico precedentemente coinvolto nel legame intraproteina). Il numero di residui SH liberi e di interazioni S-S non cambiano, cambia solo la loro posizione spaziale.

Esempio: ovoalbumina come gel stabilizzato da interazioni disolfuro

L’albume attraverso una denaturazione termica (cottura), passa dalla forma liquida alla forma di un gel solido. L’ovoalbumina è un monomero di massa pari a 45000 dalton. In ogni monomero sono rappresentati in colore i residui di cisteina, 16.

Con il termine di caseina si intende una famiglia di proteine quali: αs1-caseina, αs2-caseina, beta-caseina e k-caseina. La sequenza delle diverse caseine, sono caratterizzate dalla presenza di numerosi residui di prolina, residui idrofobici, e presentano alcuni residui (serina o treonina) fosforilati. Solo la k-caseina presenta due residui di cisteina coinvolti in un legame S-S intra-catena (tra l’AA 32 e AA 109). Queste proteine si associano in una super struttura quaternaria: micella. La struttura della micella non è completamente definita, ma vengono proposti alcuni modelli. Il modello più accreditato prevede che la micella sia costituita da sub-micelle associate tra di loro da interazioni idrofobiche ma soprattutto elettrostatiche, tra cui alcuni residui fosforilati della proteina e lo ione calcio. Ogni sub-micella è costituita dall’associazione idrofobica delle diverse caseine in modo da minimizzare l’esposizione delle zone idrofobiche. In particolare, la k-caseina si associa nella sum-micella in modo a esporre al solvente la zona idrofilica C-terminale.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche (esempio formaggio fuso)

Il formaggio fuso viene prodotto in presenza dei sali di fusione. Il riscaldamento comporta una denaturazione complessiva della micella che si traduce in una maggiore fluidità della micella di caseina. I sali di fusione, caratterizzati da una elevata capacità di trattenere l’acqua, condizionano l’associazione tra le micelle quando vengono raffreddate. Nello specifico si forma una struttura molto disordinata, lassa che trattiene molta acqua.

“Sali di fusione” utilizzati per la produzione di formaggi fusi sono composti in grado di sequestrare il calcio che fa da ponte tra le proteine, consentendo di risolubilizzarle a temperature relativamente basse e senza decomporle.

Gel stabilizzato da interazioni elettrostatiche ed idrofobiche (gel irreversibile, caseina idrolizzata)

Il formaggio viene prodotto per idrolisi dell’enzima chimosina che agisce sul residuo 105-106 (PHE, MET) della k-caseina. Questa azione enzimatica comporta una destabilizzazione della micella in quanto viene rilasciato per idrolisi le parti idrofiliche c-terminali della K-caseina (Glico Macro Peptide). La micella si trova quindi con zone idrofobiche esposte al solvente e cerca quindi di raggiungere la stabilità termodinamica associandosi idrofobicamente tra micelle in modo ordinato formando quindi un reticolo proteico ordinato che trattiene acqua e lipidi (coagulo).

La ricotta è costituita da un gel di sieroproteine (beta-lattoglobulina e alfa-lattoalbumina) generato per trattamento termico. Nello specifico, le sieroproteine assumono una struttura denaturata in seguito ad un trattamento termico. Questa struttura denaturata comporta un’associazione sieroproteine, stabilizzata da interazioni elettrostatiche ed idrofobiche. Si forma così una rete proteica ordinata al cui interno viene inglobata l’acqua.

Lezione 3: Proprietà delle proteine in un alimento

• Interazioni acqua/proteina: Solubilità
• Interazioni con micromolecole: Legame e rilascio controllato di aromi e nutrienti
• Interazioni interfacciali: Formazione e stabilizzazione di schiume e formazione e stabilizzazione di emulsioni
• Interazioni macromolecolari: Formazione e stabilizzazione di gels

Legame tra proteine e micromolecole

Tra numerosi esempi, possiamo considerare l’interazione tra proteine e piccole molecole quali aromi, vitamine e polifenoli. Nella definizione di queste interazioni, un ruolo fondamentale è svolto dalla struttura tridimensionale della proteina. Infatti, modificazioni della struttura tridimensionale possono facilitare o precludere tali interazioni.

L’interazione tra proteine e micro-molecole è stabilizzata da legami deboli, in particolare interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche. L’interazione proteine/micro-molecole è sfruttata in diversi processi dell’industria alimentare quali: legame/rilascio controllato di aromi; chiarifica di bevande. L’interazione proteina/micro-molecole condiziona anche la biodisponibilità di piccole molecole, esempio le vitamine. L’interazione proteina/micro-molecole condiziona anche la biodisponibilità della proteina coinvolta nell’interazione (esempio proteine/polifenoli).

La BSA (albumina di siero), nella struttura nativa, presenta una tasca idrofobica nella quale si legano acidi grassi (funzione fisiologica della proteina nel sangue). In questa regione si possono legare piccole molecole idrofobiche (esempio aromi, che sono anche composti volatili) o lipidi. Queste interazioni proteina/molecole sono stabilizzate da legami deboli in particolare interazioni idrofobiche e/o elettrostatiche. La presenza di proteine, con capacità di legare questi composti volatili, è fondamentale per mantenere la loro presenza durante la conservazione del prodotto.

La beta latto-globulina (BLG), che è la proteina maggioritaria nelle siero-proteine nel latte, presenta un calice idrofobico dove si lega il retinolo (vitamina liposolubile) e una regione idrofobica dove si legano acidi grassi. In queste regioni possono quindi associarsi composti idrofobici. La BSA e le siero-proteine hanno questa proprietà solo se presentano la loro struttura nativa. L’acquisizione di una struttura denaturata modifica l’interazione tra proteine e micro-molecola.

Interazione proteine/polifenoli

I polifenoli possono associarsi a specifiche regioni delle proteine. Queste associazioni sono stabilizzate da interazioni non covalenti dipendenti dai gruppi coinvolti nell’interazione. Questa proprietà è legata alla struttura tridimensionale delle proteine e pertanto solo alcune proteine hanno questa proprietà.

Chiarifica di vino

• Migliorare le caratteristiche organolettiche (eliminare tannini astringenti).
• Aumentare stabilità vini bianchi (controllare imbrunimento e polimerizzazione polifenoli).
• Facilitare filtrabilità.

L’operazione di “chiarifica” è quindi possibile sfruttando l’associazione polifenoli/proteine. Questa pratica viene effettuata per rendere la bevanda più limpida e trasparente, con lo scopo di eliminare i detriti e sedimenti che lo rendono torbido. In passato si usavano come proteine l’albume o BSA. La caratteristica principale che devono avere le proteine per la chiarifica di un vino, è quella di associarsi preferibilmente con la componente poli-fenolica responsabile della torbidità e dell’astringenza (difetti), lasciando presente la componente fenolica responsabile dell’aroma. Attualmente si stanno selezionando proteine alternative di origine vegetale. Un criterio per un primo screening delle proteine adatte è rappresentato da una valutazione della loro capacità di legarsi ai polifenoli di interesse (catechine e proantocianidine).

L’interazione tra i polifenoli di interesse (catechine, proantocianidine) e proteina comporta un decremento dell’idrofobicità superficiale. Isolati proteici di soia e pisello sono quelli più interessati. Gli isolati di pisello e lenticchia sono quelli più efficaci (diminuzione di 3 volte della torbidità), mentre isolati di glutine e soia decrementano la torbidità del 50% rispetto a quella iniziale. Tutti isolati proteici sono efficaci e comportano una diminuzione di 5 volte della torbidità.

Nella scelta dell’isolato occorre tener presente l’effetto complessivo sulla componente aromatica. L’isolato scelto rappresenta un buon compromesso tra la sua capacità di rimuovere la componente responsabile dei “difetti” del vino e una modesta rimozione della componente poli-fenolica aromatica. Questo duplice aspetto dipende oltre che dalle proprietà dell’isolato proteico anche dalla matrice vino di interesse. In queste due diapositive abbiamo due esempi: vino bianco (sopra) e vino rosso (sotto). La perdita della componente aromatica nei vini trattati con isolati proteici è inferiore rispetto a quello non chiarificato.

Legame e rilascio controllato di aromi e legami di sostanze colorate con componenti idrofobici di alimenti

Caratteristiche delle proteine

Composizione bilanciata con abbondanza di siti idrofobici superficiali o con siti specifici ad alta affinità. Solubilità non strettamente necessaria. Denaturazione può variare caratteristiche di legame.

Ruolo delle proteine nella stabilizzazione di interazioni interfacciali

In questa slide sono descritte i diversi sistemi nei quali le proteine hanno un ruolo fondamentale nella stabilizzazione di due sistemi che non potrebbero co-esistere. Le proteine per le loro proprietà anfifiliche risultano particolarmente adatte per stabilizzare due fasi che non potrebbero interagire.

Schiuma

• Agente denaturante: Azione meccanica
• Proteine coinvolte: Ovo-albumina
• Processo/prodotto: Meringa

Nel caso di una schiuma per azione meccanica si verifica una denaturazione delle proteine presenti nella fase liquida che espongono le zone idr...