Appunti di lezione Biochimica alimentare

LIPASI

PROVENIENZA:

• A. niger / oryzae
• Humicola sp.
• Rhizopus

Esse hanno un meccanismo normale d'azione: idrolisi di TG per formare MG e DG. Questi enzimi agiscono all'interfaccia, comportando un aumento del tempo di rafferimento.

ENZIMI OSSIDASICI

Il GLUCOSO OSSIDASI è un enzima che utilizza l'ossigeno (O2) per ossidare il glucosio in glucono-lattone con formazione di acqua ossigenata (H2O2), la presenza di acqua ossigenata porta alla formazione di legami -SH.

LEZIONE 13

FOOD SENSITIVES: sono quegli alimenti dedicati solo ad alcune persone. Che possono essere:

• Allergici: Le allergie alimentari sono reazioni in cui il sistema immunitario riconosce proteine o peptidi che determinano allergie. La quantità di allergene, per essere allergici ad un determinato alimento, varia da persona a persona. L'allergene è una proteina/peptide che deriva da un componente naturale dell'alimento; ingrediente della formulazione o cross

SHOCK ANAFILATTICO (frutti a guscio) è una patologia che si determina da un allergene, con conseguenza che il cuore non riesce più a pompare il sangue, conseguenze:

• difficoltà respiratoria
• produzione di istamina (aumento della pressione arteriosa)

Nel sistema immunitario sono presenti delle cellule di memoria in grado di riconoscere l'allergene, in modo tale che la seconda volta che si ripresenta questa proteina o peptide, la risposta del sistema immunitario sarà immediata.

L'anticorpo (IGE o IGG) sono proteine formate da due catene uguali, associate tramite ponti disolfuro (interazioni intra-proteina). Essendo delle proteine, gli anticorpi possono andare incontro a modificazioni strutturali.

L'anticorpo riconosce di un antigene delle zone particolari, chiamati EPITOPI. Una proteina ha diverse zone (epitopi), nella produzione di un alimento anallergico non devo necessariamente eliminare tutta la proteina, ma posso eliminare solo gli epitopi. Esistono

2 tipi di EPITOPI:

• EPITOPI CONFORMAZIONALI: regioni riconoscibili da anticorpi legate alla struttura tridimensionale.
• EPITOPI SEQUENZIALI: il sistema immunitario produce degli anticorpi in grado di riconoscere delle SEQUENZE SPECIFICHE DI AA su proteine o peptidi.

L'utilizzo di un enzima può eliminare entrambi i tipi di EPITOPI (sequenziali e conformazionali). Un EPITOPO CONFORMAZIONALE può essere eliminato da un trattamento fisico.

EFFETTI DEI PROCESSI (la quantità massima di un allergene che deve essere presente in un alimento in modo che non faccia male, dipende anche dal trattamento che viene effettuato):

1. I processi tradizionali
• TERMICO (cottura, UHT, pastorizzazione). Se nella struttura denaturata si ha la scomparsa di alcuni epitopi conformazionali si verifica una DIMINUIZIONE, se no in caso contrario si verifica un AUMENTO. Un trattamento termico può portare alla FORMAZIONE DI POLIMERI (aumenta) e anche a MODIFICAZIONI COVALENTI, ad esempio la

glicosilazione (aumenta). Il fenomeno diglicosilazione prevede l'attaccamento di uno zucchero ad un AA. Se questo AA è un EPITOPOSEQUENZIALE, si ha un aumento di allergenicità, perché sarà più immunoreattivo (tostatura arachidi).

-MECCANICI (pelatura, impastamento, omogenizzazione)

-MICROBIOLOGICI ED ENZIMATICI (fenomeni idrolitici)

Esempio. TOSTATURA ARACHIDE (fenomeno di glicosilazione)

È stato dimostrato che la TOSTATURA delle arachidi comporta una glicosilazione su particolari AA che sono parte di EPITOPI SEQUENZIALI. È stato visto che la capacità di legare anticorpi (IGE), causando una risposta immunitaria, 100 volte maggiore in un'arachide tostato invece che in un'arachide non tostato.

(slide 11) risposta nei confronti di BLG. La foto di sinistra è una SDS che mi dice quante proteine del siero del latte sono state trattate in diverse condizioni. Nella foto di destra sono stati utilizzati degli anticorpi (IGE)

Per vedere la immunoreattività è noto che la proteina è riconosciuta da questo anticorpo (IGE). La colorazione nella foto di destra è molto più marcata, determinando una maggiore immuno-reattività.

EFFETTI MATRICE

La formulazione: la presenza di una proteina in una certa forma fisica (ad esempio una EMULSIONE) può variare la sua digeribilità o la sua capacità di valicare le barriere fisiologiche. Ad esempio, l'OVOALBUMINA è più immunoreattiva se è presente in EMULSIONE.

EFFETTI SINERGICI

La sinergia con altri allergeni: L'allergene può aumentare la sua immuno-reattività perché potenziato dalla co-presenza di un'altra proteina che stimola il sistema immunitario. Se nell'alimento è presente l'allergene insieme a delle proteine batteriche, anche se il batterio è stato inattivato da un trattamento termico, può succedere che la sinergia che la reazione

Allergica verso quel determinato allergene sia molto maggiore se non ci fosse quella proteina batterica. Questo diventa importante in una persona che è IMMUNO-DEPRESSA. In questo caso occorre controllare molto bene la contaminazione microbica di partenza negli alimenti. Un altro caso può essere nei neonati in cui il sistema immunitario si sta formando. Negli ultimi anni sono morti molti bambini consumando latte artificiale, con presenza di un quantitativo elevato di proteine batteriche.

Un'analisi molto importante è la determinazione di D-AA, perché i D-AA non esistono nelle proteine normali degli alimenti perché sono tutti in forma L-AA. La presenza di D-AA è indice di una trasformazione microbica, sotto una certa quantità in un determinato alimento può andare bene, caso contrario no.

SICUREZZA D'USO

Gestione "rischio"

• Definizione limite
• Metodi analitici appropriati
• Standard affidabili

Definizione limite: 2 ASPETTI: spesso c'è confusione tra alimento, proteine e allergene. Su slide sono riportati i valori-Molto presenti nella scienza come limite di alcuni alimenti (sono molto confusi).- Diversa sensibilità individuale. Ad esempio, la LTP (proteina principale della pesca) è stata smontata in piccoli peptidi, dove gli EPITOTI di alcuni peptidi determinano una risposta su alcune persone. La zona H(74-91) è riconosciuta da tutti gli individui. La persona 5 ha bisogno di una quantità maggiore rispetto all'individuo 8.

CERCANDO DI DEFINIRE UN LIMITE: Studi clinici hanno evidenziato che normalmente individui sensibili reagiscono a quantità di allergene dell'ordine dei microgrammi. Studi complessivi fatti da FAARP hanno indicato che una quantità residua di allergene in un alimento compresa tra 1-10 pm è sufficiente a proteggere il 90% degli individui (test su almeno 29 individui). Ad oggi non ci sono

Legislazioni di limiti univoci, macambia da nazione a nazione. In Italia per limite si intende lo "zero analitico", ma non è detto che il metodo più sensibile sia il migliore (in genere non deve superare i 2 ppm).

INFORMAZIONI sul limite:

• Curva standard
• Applicazioni su matrici alimentari

2. Metodi analitici appropriati: 2 METODI:

1. Il metodo PCR-per allergene DNA si basa sulla presenza del DNA per identificare la specie, questo metodo non viene utilizzato perché un DNA (innocuo) è diverso da ALLERGENE (tossico).
2. ELISA (Enzyme Linked Immune Sorbent Assay, metodo attualmente utilizzato) è un metodo immuno-enzimatico, quantitativo formato: all'interno di ogni pozzetto viene legato l'anticorpo per-NON COMPETITIVO (Sandwich): l'ovoalbumina (antigene) in quantità nota, interazioni non covalenti (idrofobiche) che riconosce formando un complesso ANTICORPO-ANTIGENE (prima parte della reazione). Per far diventare più giallo,

ovvero più evidente il complesso, ho due possibilità (seconda parte della reazione):

- Una possibilità che è quella più semplice ma meno usata: si aggiunge un altro anticorpo con attaccato un enzima, che si lega su un'altra zona EPITOPICA dell'ANTIGENE (per questo viene chiamato SANDWICH). Questo anticorpo che ha legato a se l'enzima, in presenza di un determinato substrato (di solito non colorato), viene trasformato in un prodotto colorato. Più è complesso l'ANTIGENE-ANTICORPO e maggiore sarà la colorazione.

- Molto spesso si preferisce aggiungere un anticorpo, che sempre il classico sandwich, e poi un altro anticorpo SECONDARIO legato all'enzima, il quale riconosce la specie che ha generato l'anticorpo. Esempio, ho degli anticorpi prodotti in coniglio, per riconoscere l'ovoalbumina, l'altro anticorpo fatto sempre in coniglio, aggiungo un anticorpo secondario che riconosce tutte le

Immunoglobuline in coniglio. Questa è la via più utilizzata perché gli anticorpi secondari vengono già venduti così. Più è presente l'allergene (quantità di antigene) e maggiore sarà l'assorbanza, perché maggiore sarà il complesso che si forma (è una curva, e si calcola l'equazione di tale curva).

Competitivo: può essere sempre l'anticorpo legato al pozzetto,

Diretto (normalmente utilizzato): si ha e si chiama competitivo perché in contemporanea si aggiunge una quantità nota dell'antigene (allergene) con se nel mio campione non c'è l'antigene, l'anticorpo attaccato qualcosa (un certo composto). L'allergene (o antigene) con attaccato il composto (viola). Se nel mio campione c'è riconoscerà solo l'antigene, succede una competizione per il legame con l'anticorpo. Si legherà di più,