Appunti di Istologia

Appunti di istologia, embriologia e anatomia funzionale

Introduzione

La Terra è formata da tre grandi gruppi di esseri viventi:

• Eucarioti (hanno un nucleo)
• Batteri (sprovvisti di nucleo)
• Archei (sono organismi rarissimi, con caratteristiche simili e intermedie tra eucarioti e batteri, contengono proteine che possono resistere in condizioni estreme)

Batteri e Archei appartengono ad un unico grande gruppo che è quello dei Protozoi.

Il dogma centrale della biologia

Il flusso biologico è organizzato in:

DNA → mRNA → Proteina

Trascrizione → Traduzione

Il DNA è formato da quattro nucleotidi:

• Adenina
• Citosina
• Timina
• Guanina

Prima della divisione cellulare, il DNA deve essere duplicato e la duplicazione è fondamentale perché è il momento in cui avvengono delle mutazioni che portano al cancro. Il DNA si assembla in cromosomi; l’uomo ha 23 coppie di cromosomi e la scienza che studia i cromosomi è la genetica. I cromosomi hanno dei bandeggi e sono identici in tutti gli esseri della stessa specie; a determinate variazioni dei bandeggi corrispondono determinate malattie. I cromosomi contengono i geni, porzioni di DNA specifico, essi sono codificati da un RNA messaggero che darà origine a una proteina. Il DNA si misura in megabasi (mB). I geni sono sparsi e tra un gene e l’altro c’è uno spazio di DNA che non viene trascritto. Tra gli eucarioti sono stati trascritti sei specie, ovvero quelli che vengono utilizzati nella ricerca. Nell’uomo vengono codificati 40.000 geni. I geni agiscono in famiglie e per la duplicazione cellulare servono gruppi di geni con la stessa funzione.

I virus

I virus sono grandi circa 1 nm e sono capaci di duplicarsi ma incapaci di vivere una vita propria. Spesso la cellula virale viene uccisa dal gran numero di particelle virali presenti al suo interno. Molte volte, invece, può restare come ospite e capita che virus raccolgano parte del DNA della cellula dell’ospite e portarlo in un’altra. Questi trasferimenti avvengono nei procarioti ma possono avvenire anche negli eucarioti.

I batteri

I batteri sono molto piccoli e sono capaci di duplicarsi in pochissimo tempo. Essi sono formati da una parete cellulare che è un rivestimento spesso e resistente, da una membrana plasmatica all’interno della quale sono immersi i ribosomi e il DNA. Infine, hanno un flagello che usano per muoversi. La cellula batterica più semplice è quella del lievito e i suoi geni sono presenti in tutti i mammiferi: Caenorhabditis Elegans (verme trasparente); Drosophila (moscerino della frutta); uomo e topo.

Il microscopio

Le parti più importanti di un microscopio sono:

• L’oculare
• L’obiettivo
• La sorgente di luce

La lente dell’obiettivo raccoglie un cono di raggi per creare l’immagine. La lente del condensatore focalizza un fascio di raggi di luce su ogni punto del campione.

Risoluzione

È una proprietà intrinseca della luce e per calcolarla si usa la formula:

0.61R= metà della larghezza angolare del cono di raggi raccolti dall’obiettivo del campione

n: indice di rifrazione del mezzo che separa il campione dall’obiettivo e dalle lenti condensatrici.

λ: la lunghezza d’onda della luce utilizzata.

Le dimensioni delle cellule e dei loro componenti sono riportate su una scala logaritmica indicando la gamma di oggetti che possono essere risolti facilmente ad occhio nudo, con il microscopio ottico e quello elettronico.

• -6μmetro (micrometro) = 10 m
• -9nmetro (nanometro) = 10 m
• -10Å (unità Ånström) = 10 m

Ad occhio nudo: da 1mm in su

Microscopio ottico: da 100nm a 1mm

Microscopio elettronico: 0,1nm (1Å) a 1mm

Cellula vegetale/animale: tra 100μm e 10μm al microscopio ottico-elettronico

Batterio: 1μm al microscopio ottico-elettronico

Virus/ribosoma: tra 100nm e 10nm al microscopio elettronico

Proteina globulare: tra 10nm e 1nm al microscopio elettronico

Piccola molecola/atomo: tra 1nm e 0,1nm (1Å) al microscopio elettronico

La colorazione

La colorazione è un procedimento che rende colorate determinate porzioni dei preparati microscopici. Il fine è quello di aumentare il contrasto dei componenti morfologici cellulari affinché ne risulti una migliore analisi microscopica, oppure quello di identificare e localizzare specifiche sostanze chimiche all’interno di una cellula. Per fare ciò vengono usati i coloranti che si dividono in:

• Coloranti naturali derivati da animali o vegetali
• Coloranti artificiali

I coloranti sono in genere composti organici formati da:

• Cromoforo nel quale si trovano sempre raggruppamenti atomici dai quali dipende il colore
• Auxocromo contenuto nel cromoforo ed è un gruppo chimico ionizzabile. È responsabile della solubilità in acqua del colorante, della sua ionizzabilità, della capacità di contrarre legami stabili con le proteine. Si distinguono in acidi e basici. Gli auxocromi acidi sono i gruppi: solfonico-SO₃H, carbossilico-COOH, idrossilico-OH. Gli auxocromi basici sono: il gruppo aminico (NH₂) e i suoi derivati e i metalli. Tra le lacche (metalli) più usate è l’ematossilina (estratta dal legno di un albero), essa è incolore e di conseguenza incapace di colorare, viene ossidata ad emateina e fatta reagire con l’allume potassico.

Modalità di esecuzione delle colorazioni

• Colorazione in blocco: colorazione di frammenti di tessuto prima che siano sezionati
• Colorazione di sezioni: può essere fatta sia con sezioni su vetrino sia con fette libere
• Colorazione diretta: il preparato non richiede trattamenti particolari
• Colorazione indiretta: l’immersione nel bagno di colorazione deve essere preceduta da una mordenzatura
• Colorazione progressiva: il processo viene interrotto quando il preparato raggiunge il colore desiderato.
• Colorazione regressiva: il preparato è sovra colorato e poi decolorato
• Colorazione semplice: si usa solo un colorante
• Colorazione complessa: si usa più di un colorante
• Colorazione vitale: applicate ad elementi viventi (vitale quando il colorante è somministrato ad un animale vivo, sopravitale quando il colorante viene usato per trattare tessuti vivi allontanati dall’animale)

Esecuzione colorazioni su sezioni

• I coloranti sono solubili in acqua
• Per la colorazione è necessario che le sezioni siano idratate
• Se il tessuto era stato incluso in paraffina, questa viene rimossa immergendo le sezioni in un solvente intermediario
• Vengono poi trasferite in etanolo assoluto, per allontanare l’intermediario, in etanolo a titolo decrescente, in acqua distillata
• La colorazione avviene per immersione nel bagno colorante
• In genere segue un lavaggio in acqua o soluzioni speciali, dipende dal colorante usato

Microscopio elettronico

Fasci di elettroni scagliati su un tessuto. Ci sono due tipi di microscopia elettronica:

• SEM (scansione): dà un’immagine tridimensionale a bassa risoluzione
• TEM (trasmissione): dà un’immagine non tridimensionale ad alta risoluzione

Immunoistochimica: utilizza anticorpi marcati con una sostanza fluorescente, questi vengono avvicinati ad una proteina a cui si attaccano in modo irreversibile. Nel 2008 sono stati scoperti pesci fluorescenti ovvero contenevano GFP (proteina verde fluorescente) che fu abbinata alla capacità di modificare gli organismi.

Il microscopio a fluorescenza è formato da due filtri a barriera, il primo lascia passare solo luce blu con lunghezza d’onda tra 450 e 490 nm, il secondo lascia passare solo emissione specifica verde della fluoresceina tra 520 e 560 nm; e da uno specchio dicroico che riflette la luce sotto i 510 nm ma la trasmette sopra questo valore. Esistono due tipi di microscopia a fluorescenza: quella convenzionale che risulta sfocata per la presenza di strutture fluorescenti sopra e sotto il piano del fuoco, e quella confocale che è molto più nitida perché queste strutture fluorescenti fuori fuoco vengono tolte.

FRET: variazione della fluorescenza che ci permette di osservare le proteine. Induce la fluorescenza solo quando due proteine si avvicinano una all’altra.

L’uso del radioattivo nella biologia nasce con Marie Curie per seguire le molecole negli organismi.

La linea cellulare

È il prodotto di una cellula immortale che si propaga in laboratorio e che rimane nel tempo. Le linee cellulari sono utilizzate per studiare fenomeni biologici in maniera efficiente e potendole modificare biologicamente. Esse sono affiancate da cellule primarie che hanno una durata limitata.

FACS: Fluorescent Activated Cell Sorting è un tipo specializzato di citometria a flusso. Esso fornisce un metodo per ordinare una miscela eterogenea di cellule biologiche in due o più contenitori, una cella per volta, sulla base della dispersione della luce e sulle caratteristiche fluorescenti di ogni cella. Si tratta di un utile strumento scientifico, in quanto fornisce la registrazione veloce, oggettiva e quantitativa di segnali fluorescenti da cellule individuali e separazione fisica delle cellule di particolare interesse.

La sospensione cellulare viene trascinata nel centro di uno stretto flusso di liquidi che scorre rapidamente. Il flusso è disposto in modo che ci sia una grande separazione tra le cellule relative al loro diametro. Un meccanismo vibrante causa il flusso di celle per far penetrare singole goccioline. Il sistema è regolato in modo che vi sia una bassa probabilità di più di una cella per singola gocciolina. Poco prima che il flusso si rompe in goccioline esso passa attraverso una stazione di misurazione di fluorescenza in cui viene misurata la caratteristica fluorescenza di ogni singola cella. Un anello di carica elettrica è posto proprio nel punto in cui il flusso si rompe in goccioline. Una carica viene posizionata sull’anello basandosi sulla misurazione immediatamente prima l’intensità di fluorescenza, mentre la carica opposta è intrappolata nel droplet come si rompe il flusso. Le goccioline cariche poi cadono attraverso un sistema di deflessione elettrostatica che le devia in contenitori in base alla loro carica. In alcuni sistemi, la carica viene applicata direttamente al flusso e viene mantenuta la carica dello stesso flusso.

La cellula

Nel corpo umano ci sono diversi tipi di cellule di forme diverse. Le cellule degli eucarioti sono caratterizzate da una complessa struttura interna e dalla suddivisione del protoplasma in due compartimenti.

La membrana plasmatica

La membrana plasmatica è una struttura idrofoba che separa l’interno della cellula dall’esterno. Essa è formata da un doppio strato lipidico, i lipidi presentano caratteristiche apolari o idrofobiche ma anche gruppi polari o idrofili, sono cioè molecole anfipatiche. I gruppi idrofili (teste polari) si orientano verso le superfici acquose, costituite all’esterno della membrana dalle sostanze extracellulari e all’interno dal citoplasma, mentre i gruppi idrofobici (code apolari) si orientano verso il lato opposto formando così un doppio strato fosfolipidico. Essi si muovono nella membrana perché è liquida e il loro movimento è solo lateralmente. Il numero di fosfolipidi all’interno della membrana plasmatica è notevole e ce ne sono alcuni che hanno una grande importanza. I fosfolipidi principali della maggior parte delle membrane cellulari animali sono i fosfogliceridi che hanno un’ossatura di glicerolo e tre atomi di carbonio. Nonostante tutte le cellule abbiano una membrana formata da un doppio strato fosfolipidico, può essere formata da molecole diverse e quindi avere una funzione diversa. La maggior parte delle cellule conserva un eccesso di lipidi in goccioline lipidiche da cui possono essere prese per sintesi delle membrane o fonte di cibo. Le cellule adipose sono specializzate per deposito di lipidi.

Il colesterolo è un lipido particolare caratterizzato da una coda non polare e quindi non idrofobica. Questo cambi la fluidità della membrana plasmatica.

Il doppio strato lipidico, essendo impermeabile, permette il passaggio solo di alcune sostanze come per esempio ossigeno, azoto, CO₂, ormoni e steroidi. Non passano invece gli ioni H⁺, Na⁺, HCO₃⁻, K⁺, Ca²⁺, Cl⁻, Mg²⁺.

Nel doppio strato lipidico sono sempre presenti proteine (prodotti dei geni) come le proteine estrinseche che sono situate esternamente al doppio strato sia sul versante extracellulare sia su quello citoplasmatico, le proteine intrinseche che sono una classe di proteine in grado di interagire fortemente con il doppio strato lipidico grazie all’elevato contenuto di amminoacidi idrofobici. In alcune proteine intrinseche esiste una porzione idrofilica che sporge sulla faccia citoplasmatica o sulla faccia extracellulare o su entrambe e in questo caso sono dette proteine transmembrana. Le glicoproteine transmembrana possono essere recettrici, cioè legarsi a molecole informative extracellulari e quindi trasmettere segnali intracellulari.

La membrana plasmatica ha la funzione di riconoscimento tra le cellule e di adesione tra quest’ultime. Il trasporto di sostanze attraverso la membrana plasmatica può svolgersi secondo due modalità fondamentali: trasporto passivo e trasporto attivo. Il trasporto passivo lungo un gradiente elettrochimico avviene spontaneamente, sia per diffusione attraverso il doppio strato lipidico sia per diffusione facilitata attraverso proteine canale e trasportatori passivi. Il trasporto attivo richiede invece un input di energia metabolica ed è sempre mediato da trasportatori che raccolgono energia metabolica per pompare il soluto contro il suo gradiente di concentrazione.

Il citoplasma

È formato da citosol, sito in cui avviene la sintesi e la degradazione delle proteine e di alcune piccole molecole, e di tutti gli altri organelli.

Il nucleo

Occupa circa il 20% della massa delle cellule e le sue dimensioni variano in base al tipo di cellula ma in genere sono di 2 micron. È composto da due membrane concentriche che sono penetrate da fori nucleari, la membrana interna contiene proteine specifiche per l’attacco della cromatina, quella esterna, invece, è in contatto con il reticolo endoplasmatico ed è costellata di ribosomi che sono impegnati nella sintesi proteica. All’interno del nucleo vengono prodotti tutti gli RNA della cellula (mRNA, rRNA, tRNA, snoRNA, snRNA, scaRNA, miRNA, siRNA) e ha inoltre il compito di mantenere e duplicare il DNA.

Il nucleolo è contenuto nel nucleo ed è la sede di produzione degli RNA ribosomiali e di assemblaggio delle subunità ribosomiali. È costituito da segmenti definiti del genoma, da prodotti genici, da 80 proteine ed da enzimi. È una struttura di dimensioni variabili, ogni cellula ha 40S e 60S. Il DNA viene trascritto in una molecola di rRNA ribosomiale (45S), questa viene tagliata in 4 segmenti, 3 dei quali costituiscono la 60S e la 40S. nel resto del nucleo avviene la trascrizione dei mRNA e ncRNA. La trascrizione usa un enzima RNA polimerasi che converte il DNA in RNA e coinvolge altre proteine: TF, che hanno la funzione di assemblare il processo di trascrizione in diversi punti del genoma. Negli eucarioti il DNA viene trascritto e dopo la trascrizione subisce un processo di maturazione, quando l’RNA è maturo viene esportato dal citoplasma. Il DNA esiste in due forme diverse:

• Eucromatina (aperta)
• Eterocromatina (chiusa)

Come si passa da DNA aperto a DNA chiuso? Il processo inizia dal DNA che viene chiuso attraverso il processo di compattazione, poi si ha la riduzione del volume del DNA e infine lo spegnimento dei geni compattati.

Istoni

Proteine associate al DNA nelle cellule. Il nucleo deve esportare RNA e ribosomi e deve importare i fattori di trascrizione. La superficie del nucleo è bucherellata e questi fori che vengono chiamati pori nucleari permettono il passaggio di sostanze che vanno dal nucleo al citoplasma. Le molecole entrano o per diffusione o per trasporto attivo (per molecole più grandi) e quest’ultimo richiede energia.

I mitocondri

I mitocondri sono organelli responsabili della respirazione cellulare che rappresenta la fonte di energia della cellula. Il numero di mitocondri è importante perché fornisce informazioni sul funzionamento energetico della cellula. È importante anche dove sono posizionati perché si trovano esattamente dove serve la respirazione. C’è una tecnica che permette di vedere i mitocondri vivi (Mitotracker).

Il mitocondrio è un organello di forma cilindrica, all’interno di esso c’è un’area chiamata matrice che è mista ad un sistema di membrane interne. La membrana interna è in continuità con la membrana esterna che è il confine con la cellula.