Appunti di fisiologia generale

PATCH CLAMP è sicuramente la tecnica più importante di elettrofisiologia.

L'idea alla base è studiare il funzionamento di un singolo canale ionico.

Il problema da superare era eliminare il rumore strumentale e nello stesso tempo amplificare il segnale prodotto dal singolo canale.

Si basarono sulla misura della corrente di seal (corrente misurata nel punto in cui la pipetta si attacca alla membrana).

Inoltre con questo metodo riesco anche a decidere quale canale studiare, questo perché nella pipetta posso aggiungere inibitori/reagenti/farmaci che vanno a bloccare i canali che non mi interessano.

Il patch clamp ha 4 configurazioni.

Sulla base degli studi fatti a patch clamp, possiamo affermare che i canali oscillano tra uno stato aperto ed uno chiuso e lo stimolo non fa altro che aumentare la probabilità che questi si aprano.

Inoltre ci può

permanenza in ciascun stato

3. Le velocità di transizione tra gli stati

IL POTENZIALE D'AZIONE

Il potenziale d'azione insorge quando la membrana viene depolarizzata fino ad un valore che si definisce soglia che nella maggior parte delle cellule eccitabili corrisponde ad una depolarizzazione di circa 15 mV

Abbiamo 2 tipi di potenziali, i locali e i propagati

Questi sono diversi ma complementari

La rappresentazione del potenziale avviene su un diagramma cartesiano V-T (la variazione di potenziale nel tempo)

Una delle cose più importanti del potenziale è che: è un fenomeno TRANSITORIO, che si manifesta sotto forma di una depolarizzazione

Il fenomeno si manifesta a seguito di uno stimolo liminare (o sovraliminare)

Le fasi sono: riposo - depolarizzazione - ripolarizzazione - iperpolarizzazione - riposo (Nelle cellule muscolari non abbiamo l'iperpolarizzazione)

Per avere il potenziale abbiamo detto che dobbiamo avere una depolarizzazione;

questa deve essere RAPIDA e soprattutto è uguale in tutti i potenziali

La durata totale dipende quindi dal tempo di ripolarizzazione (cioè dipende che abbiamo differenti metodi per la ripolarizzazione)

Legge del tutto o nulla Si dice che il potenziale d'azione è soggetto alla legge del tutto o nulla perché se adeguatamente stimolata avremo una risposta unica e massimale

L'incremento dell'intensità dello stimolo (gradino di corrente) produce una depolarizzazione il cui valore massimo dipende dallo stimolo stesso solo nel caso di stimoli sottoliminari (ossia sottosoglia).

Quando uno stimolo supera il valore soglia si genera un potenziale d'azione la cui ampiezza non cresce aumentando l'intensità dello stimolo oltre il livello limite.

Una variazione di intensità dello stimolo sovrasoglia può tuttavia regolare la frequenza dell'insorgenza dei potenziali di azione.

Ciò non è del tutto vero perché

refrattarietàE in questo periodo è come se la soglia valesse ∞Quando invece abbiamo la risposta submassimale in seguito a stimoli molto sovraliminari, siamo nel periodo direfrattarietà relativaQui è come se la soglia fosse innalzataOvvero la membrana risponde peggio a stimoli più altiÈ possibile distinguere due fasi successive del periodo refrattario:

1. il periodo refrattario assoluto durante il quale nessuno stimolo qualsiasi sia la sua intensità è in grado dievocare un nuovo potenziale di azione (il valore soglia è infinito).Esso dipende dalla durata del pda.
2. il periodo refrattario relativo nel quale è possibile evocare un potenziale di azione purché il secondo stimolo(stimolo test) abbia intensità superiore allo stimolo condizionante.(la soglia innalzata tende gradualmente a ritornare al valore di riposo).La durata della refrattarietà asssoluta è correlata con la durata del pda

pompa Na/K(Infatti il contenuto di energia dello stimolo è di norma migliaia di volte inferiore a quello del potenziale d'azione)

Nella risposta elettrotonica, al contrario, la risposta dipende dallo stimolo

Ma come si genera il PdA? A questo risposero Hodgkin e Huxley

Questi applicarono il voltage clamp ad un assone gigante di calamaro, un assone che misura alcuni mm di spessore e che sopravvive in soluzione fisiologica anche alcuni giorni

A questo assone applicarono una serie di gradini di potenziale via via più depolarizzanti e videro che la corrente registrata era costituita da 2 componenti

1. Corrente entrante molto rapida; questa raggiunge un picco per poi annullarsi
2. Corrente uscente; questa non mostra picchi ma raggiunge un valore al quale si stabilizza

Ma quali ioni si muovono? Chi produce le correnti?

Sulla base delle loro conoscenze videro che la 1° aveva un potenziale d'inversione intorno a +60 mV quindi poteva essere creata da una corrente di Na*

2° aveva potenziale d'inversione intorno a -60 mV quindi poteva essere creata da una corrente di K*

Queste ipotesi vennero confermate da un'altra serie di esperimenti

Praticamente diminuendo la concentrazione di Na* a quasi 0, la 1° corrente spariva

Anche la 2° spariva, facendo lo stesso con il K*

Esperimenti analoghi venero fatti con dei veleni specifici (inibitori)

Con la TTX (tetradotossina) inibisco i canali del Na*, con il TEA (tetraetilammonio) inibisco quelli del K*

Utilizzando il TTX, e quindi bloccando la corrente per il Na si misura solo una corrente tardiva diretta verso l'esterno che cresce progressivamente fino a raggiungere il suo livello massimo.

In presenza di tetraetilammonio viene annullata la componente tardiva mentre si registra solo una corrente precoce diretta verso l'interno che al permanere della depolarizzazione si riduce fino ad annullarsi entro 2 ms