Appunti di Bioinformatica

DISPENSE DI

BIOINFORMATICA

BANCHE DATI

Le banche dati sono collezioni strutturate di dati messe in tabelle e gestite da un sistema

detto DBMS (database management system) e servono a capire le relazioni che

intercorrono tra i dati presenti. Le caratteristiche base di una banca dati sono:

• inserire tantissimi dati in poco spazio (una scatola grande ne contiene altre più

piccole)

• facilità di accesso;

• possibilità di combinarle con strumenti informatici.

STRUTTURA

Una BD è costituita da ENTRIES che contengono le informazioni sull'oggetto principale e

altre info; l'accesso alle entries deve essere rapido e facile per estrarre i dati di interesse.

Le ricerche vanno fatte solo per campi utilizzando delle parole-chiave (descritte da un

HEADERS) per evitare di introdurre nella ricerca risultati non richiesti, NON bisogna mai

effettuare ricerche generali.

I dati presenti nelle banche dati quali ad esempio delle sequenze sono tutti associati ad un

ACCESSION NUMBER ma una stessa sequenza può essere associata a più accession

number di cui però è importante solo il primo numero che viene detto numero primario. I

file sono tutti depositati come flat-file per occupare meno spazio e poterli visualizzare più

semplicemente.

Le informazioni aggiuntive sono dette features.

NCBI -> banca dati americana di sequenze nucleotidiche.

È importante che tra le banche dati ci siano delle relazioni (cross-references) che

rendono possibili scambi di dati tra diverse banche dati.

OPERATORI BOOLEANI

Permettono di combinare più concetti nella stessa ricerca. I principali sono:

• AND ->prodotto logico, intersezione tra due insiemi;

• OR -> somma logica quindi indica che deve essere presente almeno uno dei due

concetti cercati;

• NOT ->differenza logica, esclusione di un concetto usato per limitare la ricerca.

Per dare sequenzialità di ricerca si usano le parentesi.

Si considerano banche dati PRIMARIE quelle che trattano gli acidi nucleici, le principali

sono EMBL (europea), GenBank (americana) e DDBJ (giapponese).

Da ricordare è la banca dati PubMed che contiene bibliografia scientifica.

BANCHE DATI DI SEQUENZE PROTEICHE

Contengono dati ottenuti sia da sequenze proteiche che dalla traduzione di sequenze

geniche. La principale banca dati proteica è UniProt divisa in:

-Swiss-Prot --> contiene sequenze risolte a mano da biologi;

-TrEMBL --> sistema di traduzione della sequenza proteica che riconduce al data base

EMBL.

Un'utile banca dati è anche RefSeq che tratta sia sequenze nucleotidiche che proteiche, è

inoltre una raccolta di sequenze di riferimento per geni, proteine, trascritti e genomi e la

sua caratteristica è data dall'associare ogni entry ad uno status che la definisce

qualitativamente.

ELEMENTI DI INFORMATICA

SISTEMA OPERATIVO

Insieme di componenti software che consente l'utilizzo di varie apparecchiature

informatiche, costituisce la piattaforma del sistema di elaborazione insieme al processore.

I principali sono WINDOWS, MACINTOSH, LINUX.

Linux risulta il più stabile in quanto gratuito e non attaccabile da virus.

FILE ---> contenitore di informazioni in formato digitale

DIRECTORY --> indirizzo del file system in cui sono presenti altri file o directory

PROGRAMMA --> oggetto informatico in cui si introducono dati (input) che il programma

elabora e restituisce modificati (output)

OPEN SOURCE --> indica un software i cui autori ne permettono il libero studio e apporto

di modifiche

ALLINEAMENTI SEMPLICI

Un allineamento di sequenze permette:

• identificazione di associazioni funzionali

• Costruzione di alberi filogenetici

• Identificazione di domini funzionali

• Costruzione di modelli 3D per similarità di sequenze

SIMILARITA' è da non confondere con OMOLOGIA in quanto due sequenze omologhe

condividono una stressa origine filogenetica mentre in due sequenze definite simili questa

caratteristica non è richiesta ma può occorrere per caso o per convergenza adattativa

Strutture o sequenze ORTOLOGHE --> si definisce per geni presenti in specie differenti

che mostrano una omologia di sequenza. Questi derivano da un antenato comune e

hanno subito evoluzione divergente

Strutture o sequenze PARALOGHE --> si definisce per sequenze omologhe la cui

evoluzione riflette casi di duplicazione genica

Un allineamento è quindi il confronto tra due sequenze note in modo da quantificare il

grado di similarità, può essere applicato a coppie di sequenze nucleotidiche o proteiche.

MISURA DI SIMILARITA': numero di caratteri delle due sequenze che si appaiano

esattamente.

Definiamo la similarità di sequenza tra due sequenze come il punteggio più alto dei

punteggi ottenuti che identifica l'allineamento migliore.

Data una sequenza n ed una m, il numero di allineamenti possibili si calcola: (n)+(m-1)

mentre il numero di confronti effettuati si calcola : n x m.

Utilizzando gli allineamenti è possibile fare ricerche per similarità all'interno delle banche

dati.

Per calcolare la similarità in sequenze che contengono indels, associamo una penalità

(GAP PENALTY) più grave della seconda penalità (GAP EXTENSION PENALTY).

N.B. nel calcolo della similarità le identità saranno sommate ed i gap sottratti.

CALCOLO DELLE SIMILARITA' TRA DUE SEQUENZE

Per visualizzare graficamente un allineamento di seq si può utilizzare una DOT MATRIX

che risulta una matrice rettangolare n x m che descrive l'allineamento tra una seq n ed una

m.

Le matrici di punti quindi possono essere utilizzate per:

• Evidenziare ripetizioni interne a singole sequenze;

• Identificare similarità in posizioni diverse in 2 sequenze;

• Valutare la similarità tra due sequenze diverse.

In ogni punto in cui le due seq coincidono inseriamo un asterisco ma considerare ogni

singolo nucleotide o residuo aa si creerebbe un eccessivo rumore di fondo, quindi, per

evitarlo si usa una determinata finestra (ad es 5 residui o nucleotidi) e si decide di

introdurre un punto nel grafico solo se l'identità tra le due seq prese in quella finestra è

superiore o uguale al 60%.

Otterremo così un grafico in cui gli allineamenti migliori sono visualizzati come segmenti

diagonali paralleli tra loro presenti nella matrice, i gap sono visualizzati come salti di

diagonali.

Il rumore di fondo che si ottiene invece compilando una matrice per punti è in genere dato

da tutte quelle similitudini presenti in modo sistemico quindi può ad esempio essere

dovuto al fatto che alcuni amminoacidi che compongono le diverse sequenze sono molto

presenti come nel caso dell'arginina che risulta un amminoacido molto presente a livello

generale nelle sequenze proteiche.

Ovviamente valutare un allineamento soltanto dal numero di residui identici appaiati non è

corretto in quanto risulterebbe più corretto assegnare un punteggio in base al grado di

identità dei residui ( ad esempio assegnare un punteggio molto elevato a due residui

identici ed un punteggio alto ma inferiore al primo per due residui chimicamente simili). Per

assegnare dei valori si usa una MATRICE DI SOSTITUZIONE.

MATRICE DI SOSTITUZIONE (DA NON CONFONDERE CON LA MATRICE DI PUNTI

DOT-MATRIX)

È una tabella che associa un valore per ogni coppia di residui, risulta quindi una matrice

quadrata 20x20 con 400 valori. Una delle matrici più usate è la PAM (percent accepted

mutation) che rappresenta la divergenza di 2 sequenze.

La differenza tra le matrici di punti e quelle di sostituzione è che le prime consentono di

mettere in evidenza zone di identità tra sequenze diverse ( m x n), mentre le seconde

associano un punteggio ad ogni coppia di residui e sono quadrate e simmetriche.

Le PAM più utilizzate sono la PAM 120 e la 250 che quindi rappresentano sequenze che

hanno rispettivamente il 50 o il 20 % di identità di sequenza.

Programmi che sfruttano algoritmi che esplorano tutto il piano della matrice di confronto tra

due sequenze sono detti esaustivi.

PROGRAMMAZIONE DINAMICA

È una tecnica di progettazione di algoritmi basata sulla divisione del problema in sotto-

problemi e sull'utilizzo di sottostrutture ottimali. Per confrontare 2 sequenze e ottenere il

migliore allineamento necessitiamo di un algoritmo che tenga conto delle possibili

inserzioni o delezioni ma è ovviamente impossibile tenere conto di ogni singola posizione

e per questo è stato sviluppato un algoritmo esaustivo che cerca le similarità globali di

tutte le sequenze e si basa sulla programmazione dinamica.

Aspetti positivi:

• L'algoritmo trova il migliore allineamento possibile

Aspetti negativi:

• Nell'output spesso si trovano più allineamenti con il massimo punteggio

2

Il tempo di risposta del programma è dell'ordine n

Abbiamo 2 tipi di allineamento: locale o globale

Il locale è più interessante dal punto di vista biologico in quanto permette di identificare

proteine che contengono lo stesso dominio funzionale mentre il globale confronta le intere

sequenze. # Per distinguere un allineamento globale da uno locale bisogna ricordarsi che,

la matrice di sostituzione usata per gli allineamenti locali contiene anche valori negativi

(associati ad uno 0 poi nel calcolo della somma) e quindi permette di avere il valore

massimo all'interno della matrice stessa e non per forza nell'ultima riga o colonna

dell'allineamento invece in quello globale la matrice di sostituzione ha solo valori positivi e

il valore massimo è sempre in ultima riga o colonna.

CREAZIONE DI UNA MATRICE A PROGRAMMAZIONE DINAMICA

Per completare un allineamento con una matrice di sostituzione andando a fare già le

somme bisogna tener conto di alcune regole per il completamento dei vari quadrati. Da

notare che i valori sost1, sost2 e sost3 sono semplicemente i valori presi dalla PAM di

riferimento (N.B. in caso di valori negativi si scrive il valore negativo come sost1, sost2 o

sost3 ma se anche il valore della somma dovesse essere negativo si riporta uno 0 al posto

di m1, m2 o m3).

A completare quindi il valore in m4 sarà il valore più alto tra quelli calcolati tra v1, v2 e v3.

Una volta completata la matrice a programmazione dinamica bisogna poi cercare di

ricostruire l'allineamento migliore semplicemente partendo dal punteggio massimo

ottenuto e andando poi a ritroso. Ovviamente il percorso che ricostruiremo sarà quello più

interessante nel confronto tra le due sequenze, per definire se si tratta di un percorso che

descrive un allineamento globale o locale bisogna far riferimento alle regole indicate al

paragrafo sopra. (vedi #)

METODI EURISTICI

Sono algoritmi sviluppati per effettuare ricerche più rapide in banche dati sempre più

grandi, la ricerca è resa più rapida a scapito della certezza di avere trovato il risultato

ottimale.

FASTA E BLAST

I principali programmi euristici sono FASTA e BLAST. FASTA si basa su identità di

sequenza mentre BLAST utilizza una matrice di sostituzione sin dalle prime fasi di utilizzo

dell'algoritmo. FASTA considera la possibilità di gap fin dalle prime fasi del programma

mentre BLAST poiché costretto da un parametro ( Word ) può non identificare sequenze

con bassa similarità. Quindi generalizzando si preferisce Fasta per sequenze di acidi

nucleici e allineamenti globali, mentre si usa BLAST per sequenze proteiche e allineamenti

locali.

FASTA ( sviluppato nel 1985 da Liepman e Person )

Per utilizzare fasta bisogna impostare dei parametri:

• K-TUP, la lunghezza della parola con cui si effettua il primo passo dell'algoritmo

( quella ottimale per sequenze nucleotidiche è 6, per sequenze proteiche è invece

2 ). Aumentando la K-TUP aumenta il rischio di non identificare sequenze omologhe

evolutivamente distanti ma si velocizza il programma.

• Soglia, definisce la qualità minima degli allineamenti in output sotto la quale i

risultati non sono considerati statisticamente rilevanti.

Una volta impostati tali parametri il programma selezionerà le sequenze con i punteggi di

sostituzione più alti; utilizzando i migliori dieci risultati, si identifica un core match a

punteggio massimo. Si deve considerare che i frammenti possono essere uniti solo entro

una soglia di accettabilità ( 32 residui intorno al match ottimale ).

Un problema che è opportuno risolvere nella ricerca delle BD è la RIDONDANZA, infatti

molte BD contengono sequenze e frammenti di sequenze in diverse copie tutte uguali tra

loro, dunque fare confronti non è molto utile ed eliminare la ridondanza renderebbe le

ricerche più veloci. Di conseguenza le sequenze che hanno una percentuale di identità

uguale o superiore a una certa soglia vengono raggruppati in Cluster ognuno dei quali è

rappresentato da un'unica sequenza. In UniProt sono disponibili diversi Clusters a diversi

livelli di ridondanza e diverse soglie di identità. In un UniProt 90% e 50% non ci sono

coppie di sequenze che abbiano rispettivamente più del 90% o 50% di identità. In UniProt

100% sono presenti solo sequenze identiche (si calcola la quantità di sacchi e non la loro

pienezza quindi avremo più sacchi al 100% ma più vuoti e meno sacchi al 50% o 90% ma

più pieni).

BLAST

L'algoritmo che BLAST utilizza può essere suddiviso in 3 passaggi:

Ogni sequenza da analizzare viene suddivisa in parole di lunghezza W e per

1.

ogni parola si genera un elenco di parole affini dette anche W-mers ovviamente

considerate solo entro una determinata soglia

In ogni file della banca dati o della sequenza di confronto si cercano

2.

occorrenze identiche o con un valore superiore a quello soglia di W-mers

Una volta riconosciuti I W-mers si cerca di estendere la regione sia al 3' che

3.

al 5' generare degli HSP (highscoring Segment Pair) poi eventualmente uniti per

formare un allineamento finale

Nell'utilizzo di BLAST bisogna tener conto che il parametro W decide sia la velocità di

esecuzione del programma sia la sua sensibilità ed in genere per effettuare delle buone

ricerche si utilizza un valore di W=11

SIGNIFICATIVITA' STATISTICA

Poichè in output BLAST e FASTA generano degli allineamenti posti in ordine di punteggio

decrescente bisogna individuare un sistema per decidere se una certa similarità è

significativa oppure se quel punteggio di similarità potrebbe essere stato generato per

caso. Utilizzando la statistica è possibile affermare che un punteggio risulta più

significativo quanto più è lontano dal punteggio medio e ovviamente questa significatività

varia in base all'ampiezza della distribuzione. L'ampiezza di una distribuzione è descritta

come deviazione standard. A questo punto possiamo quindi definire lo Z-score che è una

grandezza proporzionale alla distanza di un punteggio dal punteggio medio e

inversamente proporzionale all'ampiezza della distribuzione stessa secondo la formula.

Nel caso in cui si confronti una sequenza con una banca dati di sequenze la significatività

di un allineamento è descritta dal suo Z-score, un punteggio si considera statisticamente

significativo se lo Z-score è maggiore di 5.

Un altro parametro usato per valutare la significatività statistica di un punteggio è l'E-value

(expectation value) che indica il numero di allineamenti con punteggi equivalenti o migliori

che ci si aspetta che compaiano per caso. Più è basso il valore dell'E-value e maggiore è

la significatività del punteggio preso in esame. In un output di BLAST una buona soglia

-5

limite di E-value è e oppure più bassa poichè altrimenti con un valore superiore facendo

un confronto ad esempio tra una sequenza ed un database di 1 milione di sequenze si

andrebbe a prendere in considerazione anche i 1000 allineamenti dovuti al caso.

ALLINEAMENTI MULTIPLI

Un allineamento multiplo di sequenze permette di confrontare tra loro più di due sequenze

alla volta permettendo di ottenere più informazioni rispetto al confronto con solo una

coppia di sequenze. Un allineamento multiplo di sequenze è detto anche MSA (Multiple

Sequence Alignment). Per poter generare un allineamento multiplo di proteine omologhe è

necessario utilizzare un algotimo di allineamento globale oppure in alternativa si può

costruire un allineamento locale nel quale siano considerate solo le regioni o i domini

comuni a proteine che possono anche non essere simili globalmente.

Un allineamento multiplo dà informazioni sulle relazioni funzionali ed evolutive tra le

proteine con cui è costruito, sui residui catalitici e sulla struttura 3D della famiglia. Oltre al

concetto di similarità negli allineamenti multipli si tiene conto anche del concetto di

distanza tra due sequenze che è data dalla percentuale di residui diversi nell'allineamento.

Il programma più usato per generare allineamenti multipli è ClustalW (ClustalOmega) che

tra le sue caratteristiche principali ha:

• Pesi individuali che vengono assegnati ad ogni sequenza per pesare meno le

sequenze quasi identiche e dare più peso a quelle più divergenti tra loro

• Le matrici di sostituzione vengono cambiate ai diversi stadi dell'allineamento in

dipendenza con la divergenza delle sequenze da allineare

• Le gap penalties sono residuo-specifiche e vengono ridotte localmente in

corrispondenza di regioni idrofiliche incoraggiando quindi l'apertura di gap in regioni

che potenzialmente codificano per dei loop

ClustalW inoltre permette anche la generazione di alberi filogenetici.

Un filogramma è un diagramma a rami in cui la lunghezza dei rami è proporzionale alla

divergenza mentre un cladogra