Appunti di Applicazioni Ingegneristiche in Ambito Biomedico, prof. A. Remuzzi

Applicazioni ingegneristiche in ambito biomedico

Prof. Andrea Remuzzi

A.A. 2017/2018

Programma del corso

Introduzione

Sviluppo della medicina moderna, approcci terapeutici, utilizzo delle tecnologie.

Biocompatibilità

Definizione del problema, sistema della coagulazione, attivazione del complemento; Interazione del sangue con i materiali artificiali; Interazione dei materiali con le proteine plasmatiche; Metodiche quantitative.

Sostituzione della funzione renale

• Meccanismi fisiopatologici dell’insufficienza renale terminale
• Il trattamento emodialitico
• Organizzazione della macchina per emodialisi
• Accessi vascolari
• Pompe peristaltiche
• Filtro dializzatore
• Fenomeni di trasporto attraverso le membrane dialitiche
• Permeabilità, ultrafiltrazione, selettività delle membrane
• Osmosi inversa per liquido di dialisi
• Valutazione dell'efficacia del trattamento
• Tecniche di emofiltrazione
• La dialisi peritoneale
• Trasporti di membrana nella dialisi peritoneale
• Sviluppi futuri del trattamento dialitico

Sistemi per trattamento del sangue

• Plasmaferesi
• Aferesi
• Sistemi di adsorbimento
• Sistemi per la perfusione di organi per il trapianto

Sostituzione/assistenza della funzione cardiaca

• Patofisiologia dell'insufficienza cardiaca
• Circolazione extracorporea per bypass cardio-polmonare
• Sistemi per l’assistenza ventricolare
• Pompe volumetriche
• Pompe rotative (assiali, centrifughe)
• Sistemi di regolazione
• Trasmissione di energia
• Impianto dei dispositivi e monitoraggio
• Il cuore artificiale totale
• Risultati clinici e prospettive future

Sostituzione/assistenza della funzione polmonare

• Ventilatori
• Ventilazione liquida
• Ossigenazione extracorporea (ECMO)

Sostituzione/assistenza del controllo glicemico

• Terapia insulinica e controllo glicemico
• Infusori per l’insulina
• Controllo glicemico estemporaneo e continuo
• Controllo glicemico mediante circuito chiuso

Biocompatibilità

La limitazione principale della medicina era che non esisteva l’anestesia, quindi le operazioni avvenivano in condizioni di coscienza del paziente. Inoltre, era presente una limitazione relativa alle infezioni. La possibilità di anestetizzare i pazienti e di tenere sotto controllo le infezioni con farmaci antibiotici ha reso possibile, con la chirurgia ricostruttiva, l’accesso agli organi interni.

All’inizio del '900 si riusciva a risolvere patologie come ustioni prelevando un tessuto sano dal corpo stesso del paziente, ma questi sistemi artigianali, anche se erano in grado di bloccare la situazione patologica, non riuscivano a sostituire l’organo danneggiato.

La chimica dei polimeri ha cambiato lo scenario degli organi artificiali. Lo sviluppo di organi artificiali è andato di pari passo con lo studio dei trapianti d’organo (negli anni ’60 c’è stato il primo trapianto di cuore). Il trapianto poteva avvenire solo in presenza di una certa compatibilità, poiché in assenza di questa si verificava un rigetto molto forte. Le operazioni di trapianto hanno iniziato realmente ad essere effettuate con l’avvento dei farmaci antirigetto (ciclospodrina).

Tuttavia, il trapianto ha dei limiti che non possono essere sottovalutati: limite della disponibilità, i pazienti hanno spesso bisogno di un trapianto immediato e il numero dei donatori è limitato. Inoltre, i farmaci antirigetto non risolvono completamente il problema del rigetto, la vita media dei trapiantati è di 14/15 anni, c’è una curva gaussiana. I farmaci antirigetto hanno effetti indesiderati, insorgenza di neoplasie a 20 anni dal trapianto, quindi è ancora aperta la necessità di organi artificiali.

Ultimamente sono stati sviluppati sistemi di trapianto cellulare: le cellule vengono messe in coltura, fatte crescere con fattori di crescita. All’inizio del 2000 è nata l’ingegneria dei tessuti. È difficile far crescere in laboratorio colture di cellule differenziate, perché hanno bisogno di nutrimento, ad esempio nutrimento sanguigno. L’ingegneria dei tessuti verso il 2010 si è spostata verso lo studio delle cellule staminali, queste però devono appartenere al paziente stesso, non ad un’altra persona. Solamente 4 anni fa si è riusciti ad indurre uno stato di pluripotenza in cellule della pelle e del sangue, successivamente si riesce a far differenziare tali cellule. Tuttavia, queste cellule pluripotenti continuano a proliferare in maniera incontrollata, quindi si possono sviluppare tumori teratomi.

Il materiale impiantato non è isolato, reagisce con gli elementi del corpo umano, allora dobbiamo essere in grado di controllare tali reazioni, dobbiamo gestire la risposta ed in qualche modo guidarla.

Composizione del sangue

Le piastrine derivano dalla frammentazione dei megacariociti, sono corpuscoli di forma lenticolare. Sono circa 150-400×10³/µl, di cui due terzi circolano nel sangue, mentre un terzo risiede nella milza o in sedi extravasali. I leucociti sono circa 6,5×10³/µl. Svolgono la funzione di difesa da agenti patogeni (virus, batteri e tossine) al di fuori del torrente sanguigno. In caso di necessità, i globuli bianchi, attratti da specifici stimoli chimici (chemiotassi) sono in grado di fuoriuscire dal circolo sanguigno (diapedesi) e migrare nel tessuto connettivo e grazie al movimento ameboide raggiungono il sito da difendere. I globuli bianchi si dividono in granulociti (neutrofili, eosinofili e basofili) e agranulociti (monociti e linfociti).

Principalmente l’interazione del dispositivo avviene col sangue. I sistemi dovrebbero mantenersi integri mantenendo inalterate le funzioni meccaniche. Ma il corpo umano mette in atto dei sistemi di reazione per far sopravvivere l’organismo: meccanismi fisiologici. Il nostro tentativo è quello di gestire la risposta in modo da guidarla.

Emostasi

Il processo emostatico è un meccanismo di difesa del nostro organismo per evitare di perdere sangue. L’emostasi consiste in una serie di reazioni biochimiche e cellulari che hanno lo scopo di riparare le lesioni vasali e arrestare l’emorragia. Caratteristica importante dell’emostasi è la rapidità dell’intervento, localizzato sul sito della lesione vascolare.

Vasocostrizione

Avviene in seguito al danno vascolare, cui segue l’attivazione di un segnale nervoso innescato dalla serotonina e da altri composti liberati dalle piastrine nel punto in cui l’endotelio è danneggiato. La vasocostrizione determina:

• Il rallentamento del flusso di sangue
• Il rilascio delle endoteline, che inducono il restringimento del vaso a livello della lesione
• La stimolazione dell’endotelio a produrre il Fattore Tissutale, che insieme al fattore VIII avvia la coagulazione, e il Fattore di von Willebrand (vWF) che fa aderire le piastrine

Attivazione piastrinica

L’attivazione della fosfolipasi C idrolizza il PIP₂ in DAG e IP₃. Il DAG attiva la PKC che favorisce la secrezione dei granuli. Invece, l’IP₃ viene fosforilato in IP₃. L’IP₃ favorisce l’aumento del calcio intracellulare, che si lega alla calmodulina e determina la fosforilazione della miosina. Si attiva il sistema actina-miosina piastrinico, che fa cambiare forma alle piastrine e fa legare il complesso glicoproteico GPIIb-IIIa a integrina, fibrinogeno, fibronectina e vitronectina. Inoltre, l’aumento del calcio intracellulare attiva la fosfolipasi A2 (PLA2) che rilascia acido arachidonico. Questo acido, ossidato dalla COX, forma la prostaglandina G2 (PGG2), ridotta poi in PGH2, precursore del trombossano A2, induttore dell’aggregazione piastrinica.

Adesione piastrinica

L’endotelio integro e la superficie piastrinica si respingono a causa delle cariche negative, con la lesione endoteliale il collagene sottoendoteliale viene esposto e si lega alla GPIa presente sulla superficie piastrinica, invece la GPIb si lega al vWF, a sua volta adeso al collagene.

Aggregazione piastrinica

L’aggregazione si verifica grazie al fibrinogeno, che fa da ponte tra il complesso GPIIb-IIIa di più piastrine. Successivamente, il cross-linking della trombospondina stabilizza il legame.

Coagulazione

La coagulazione costituisce la fase attraverso cui avviene l’arresto dell’emorragia. L’attivazione della cascata coagulativa avviene attraverso due vie, intrinseca ed estrinseca, che differiscono principalmente per l’agente che le attiva e per il numero di fattori coinvolti. Il sistema intrinseco è più lento ed è innescato dall’attivazione del Fattore XII che avviene quando il sangue entra in contatto con il collagene della matrice extracellulare. Invece, il sistema estrinseco è più rapido per il minor numero di fattori coinvolti, viene attivato quando la lesione produce la liberazione di fosfolipidi e Fattore Tissutale da parte delle cellule danneggiate.

Una modalità per bloccare la cascata della coagulazione è bloccare il calcio, la vitamina K o il vWF.

Coagulazione, fibrinolisi e sistema del complemento

Il fibrinogeno è una proteina abbastanza estesa, con peso molecolare molto elevato, è costituito da eliche che danno luogo ad una struttura allungata. Le parti carbossiterminali della proteina presentano la terminazione gamma attraverso cui passa l'interazione con le piastrine. È normalmente circolante nel plasma in forma inattiva, senza attivare le piastrine, diventa attiva quando vengono rimossi le porzioni carbossiterminali, è la trombina (enzima) mediante l’azione di clivaggio ad attivare il fibrinogeno. L’azione della trombina è quella di legarsi nel legame tra due amminoacidi rimuovendo il legame peptidico e permettendo alla molecola di legarsi ad altre. Eliminando questi amminoacidi, la molecola si può aggregare con altre. Si può quindi formare il reticolo di fibrina che stabilizza il trombo e fa precipitare all’interno del reticolo i globuli rossi. Si crea quindi un’ostruzione che occlude la lesione passando da una scala molecolare ad una scala millimetrica. Si arriva a formare del materiale completamente diverso. Per un vaso normale, se è danneggiato si innesca la coagulazione in modo da occluderlo e far cessare il sanguinamento. Una volta che il tessuto è stato riparato, il processo di rimodellamento va avanti con la dissoluzione del trombo, trombo che non può rimanere in un tessuto sano.

Si riesce a rimuovere il materiale che ha costituito il trombo con la fibrinolisi. I due fenomeni devono avere delle dinamiche diverse, la prima è un processo veloce mentre la seconda avviene lentamente. Per disfare il trombo serve una reazione enzimatica che permettere di rompere la fibrina, ovvero la fibrinolisi. La plasmina, enzima presente nel sangue e precursore inattivo del plasminogeno (FXII), permette di eliminare la presenza del trombo.

Quindi, se si ha la formazione di trombi possiamo usare la fibrinolisi per disfarlo, però non possiamo usarla sui biomateriali (si può usare in clinica su pazienti con trombi a rischio). Se il trombo è talmente ingrossato da aver occluso il vaso, allora l'iniezione di fattori che inducano la fibrinolisi non va a buon fine, perché appunto il vaso è occluso, allora dovremo usare altri sistemi.

Le soluzioni artificiali riescono a funzionare se riproducono la situazione fisiologica dell'endotelio, lo strato cellulare è polarizzato, ci sono proteine diverse esposte nelle diverse superfici di queste cellule, le proteine sulla membrana basale sono le proteine che creano contatti focali e quindi l'adesione delle cellule, infatti è importante che le cellule siano adese e che ci sia una continuità tra di esse, le cellule tendono ad occupare tutta la superficie continuando a proliferare crescendo come monostrato di 10 micron. Oltre alle proteine della membrana basale ci sono proteine transmembrana e acido ialuronico, che sono cariche negativamente, quindi respingono proteine con cariche negativa, come fibrinogeno e albumina. La situazione ideale sarebbe avere una superficie che mantiene le proteine distanti da essa e farvi arrivare a contatto le molecole dell’acqua. L’interazione dipende dall’energia, che può essere modificata facendo in modo che ci sia un’affinità chimica. Altrimenti c’è il rischio che queste possano andare ad aderire direttamente sul materiale.

Quando il fibrinogeno è normalmente circolante nel plasma e il plasma entra in contatto con una superficie artificiale, il fibrinogeno aderisce al materiale ed espone dei siti di legame come la terminazione ed interagisce con i recettori GPIIb/IIIa e GPIb delle piastrine, quindi si ha l'attivazione delle piastrine e il rilascio dei granuli e quindi l'aggregazione; dovremmo riuscire ad interagire con il fibrinogeno per evitare che aderisca al materiale. Quando si impianta un materiale all’interno dell’organismo, oltre alla cascata coagulativa si attiva il sistema del complemento. Il sistema del complemento è parte attiva del meccanismo di riconoscimento ed eliminazione di materiale estraneo, soprattutto di eliminazione della membrana dei batteri. I batteri vengono uccisi se si riesce ad attivare il complemento che riesce a bucarne la membrana (con la membrana non più integra i batteri muoiono). Questo sistema è basato su un’altra cascata, con proteine che attivano altre proteine con un’azione enzimatica.

Attivazione del sistema del complemento

Ci sono due possibilità di attivare la cascata:

• Mediante la reazione tra anticorpi ed antigeni, se gli anticorpi sono in grado di riconoscere un antigene sulla membrana del batterio, si dispongono un certo numero di anticorpi. Essi sono macromolecole con un’estremità costante e due estremità variabili, che riescono a riconoscere un antigene, perché tra anticorpo e antigene c’è una corrispondenza molto precisa tra la conformazione spaziale e cariche presenti. La molecola del complemento ha dei recettori che si legano all’estremità costante dell’anticorpo quando ce ne sono un certo numero di anticorpi disposti a tappeto attorno all’antigene. Il sistema del complemento mediante azioni enzimatiche produce una serie di molecole che creano un complesso di attacco alla membrana. Il complesso si lega alla membrana del batterio creando un foro. A questo punto il batterio fa fatica a sopravvivere perché escono elementi dall’interno o ne entrano dall’esterno.
• La risposta è attivata anche dalle superfici artificiali che mettono in moto la cascata del complemento. In questo caso, la cascata del complemento attiva anche il sistema immunitario, vengono prodotte citochine e interleuchine, viene indotta quindi una situazione patologica, una perturbazione del sistema fisiologico. È necessario ridurre al minimo l’interazione tra la superficie artificiale e gli elementi del sistema del complemento.

Un’altra reazione che può avvenire, oltre alla coagulazione e al sistema del complemento, è la reazione dell’organismo al corpo estraneo, tale reazione consiste principalmente nell’attacco da parte di macrofagi e cellule giganti che aderiscono al materiale nel tentativo di separarlo dal tessuto sano. Il corpo cerca di eliminare i corpi estranei, ma se non ha successo in questa operazione allora cerca di mettere una separazione tra il tessuto sano e il tessuto malato, riuscendo a confinare il problema. Operando questa separazione, tutta la parte sana dell'organismo riesce a mantenere la propria omeostasi. I macrofagi cercano di creare un nuovo tessuto sul corpo estraneo, questo tessuto deve avere la capacità di non scambiare reazioni con l'esterno ed è un tessuto fibroso, quindi ci sono fibroblasti che creano la capsula fibrotica (costituita prevalentemente da collagene), si crea un tessuto aspecifico, costituito da poche cellule, poi la capsula fibrotica viene spostata verso l'esterno, in modo da rimuovere dal corpo il corpo estraneo. Questo meccanismo è possibile per corpi estranei molto piccoli, tuttavia, anche localmente, le cellule cercano di creare la capsula fibrotica, in modo da isolare il corpo estraneo.

Per capire se un materiale verrà accettato o meno dall’organismo, bisogna capire come interagisce con le proteine circolanti. Le proteine si attaccano al materiale con forze elettrostatiche abbastanza deboli. Se ci sono tante proteine che si attaccano al materiale e se queste stanno attaccate per un certo periodo di tempo possono attivare le reazioni sopra illustrate. Gli elementi che dobbiamo considerare sono: fibrinogeno, fattore Von Willebrand. Nel caso del fibrinogeno, esso se si attacca espone il dominio riconosciuto dai recettori delle piastrine. Perciò serve diminuirne l’adesione poiché altrimenti lo strato di fibrinogeno può impegnare i recettori delle piastrine che le attivano e, attivandole, si dà luogo all’aggregazione. Il fattore von Willebrand è un cofattore del Fattore VIII della cascata coagulativa, che circola nel sangue senza creare problemi. È una proteina allungata, che si allunga ulteriormente all’interno di un gradiente di velocità (come ad esempio un flusso ematico). L’allungamento del Fattore von Willebrand implica l’esposizione dei siti di legame e quindi la sua attivazione. Esso a sua volta attiva l’adesione delle piastrine portando alla formazione di un trombo. Quindi dovremo fare in modo che sul nostro materiale non ci sia la possibilità di adesione del VWF, quello che succede solitamente sulla superficie di materiali artificiali è che il VWF aderisce, si allunga, ma poi si frammenta. Questa frammentazione, induce nel paziente problemi di coagulazione, perché il Fattore von Willebrand non funziona più normalmente.

Test di biocompatibilità

Assorbimento in vitro delle proteine al materiale. Quasi tutti materiali hanno siti di legame aspecifici, la quantità di proteine che arriva sui siti di legame dipende dal numero di siti di legame e dal numero di proteine, quindi è difficile quantificare questa interazione. Questi siti sono aspecifici e non selettivi.