Appunti biologia molecolare e cellulare, testo di riferimento "Biologia molecolare della cellula di Bruce Alberts 6°ediz" docente Corrado Garbi

Cap 4 – DNA, cromosomi e genomi

Genoma

Per genoma si intende l’insieme di geni presenti all’interno di un organismo.

Genoma procariotico

I genomi procariotici sono piccoli, compatti e sono costituiti da molecole circolari di DNA quasi tutto codificante. Il genoma di E. coli ha la lunghezza di 4,6 x 10⁶ coppie di basi e mediamente un gene è lungo 1000 coppie di basi.

Genoma eucariotico

I genomi eucariotici sono più elaborati di quelli procariotici a causa di una maggiore complessità strutturale e funzionale della cellula. È presente anche molto DNA che non codifica per proteine, che probabilmente svolge una funzione di regolazione e la sua reale funzione è tuttora oggetto di studio. Sono genomi ibridi, in cui la maggior parte dell’informazione è contenuta nel nucleo, ma parte è presente anche nei mitocondri.

Genoma e cromosomi

Il genoma eucariotico è distribuito in una serie di cromosomi diversi, ciascun cromosoma consiste in una singola molecola di DNA estremamente lunga associata a proteine istoniche che ripiegano e compattano il sottile filamento di DNA; i cromosomi sono associati a molte proteine e molecole di RNA necessarie per i processi di espressione genica, di replicazione del DNA e di riparazione del DNA.

Il DNA batterico è costituito da un unico e lunghissimo filamento di DNA che forma una struttura circolare; tale struttura può essere considerata un cromosoma e quindi definita cromosoma batterico (o cromonema). A differenza degli eucarioti, nei batteri il DNA non è legato ad istoni.

Genoma umano

Il genoma umano è distribuito in 24 cromosomi diversi, ciascuna cellula umana contiene due copie di ciascun cromosoma, una ereditata dalla madre e una dal padre; i cromosomi materno e paterno di una coppia sono chiamati cromosomi omologhi; l'unica coppia di cromosomi non omologhi è composta da cromosomi sessuali nei maschi, in cui cromosoma Y è ereditato dal padre ed un cromosoma X dalla madre. L'insieme dei 46 cromosomi umani si chiama cariotipo.

Schema di bandeggio

Un modo per distinguere un cromosoma dall'altro è quello di colorarli con colorante che producono uno schema di bande caratteristico lungo ciascun cromosoma mitotico. Se parti di cromosoma vengono perse o scambiate, questi cambiamenti possono essere rilevati da cambiamenti negli schemi di bandeggio. Tramite il cariotipo è possibile quindi evidenziare eventuali alterazioni cromosomiche. Il cromosoma Philadelphia è indicatore diagnostico della leucemia mieloide cronica. Si ha la traslocazione, ovvero lo spostamento, di una porzione del cromosoma 22 sul cromosoma 9 in modo reciproco: ciò determina l'alterazione di una proteina che dà luogo alla malattia.

Sequenze ripetute e sequenze uniche

Sequenze ripetute

Il 50% del genoma umano è fatto da sequenze ripetute, ossia sequenze mobili che si spostano nel genoma, attivando o inattivando altre regioni geniche. Esse possono essere classificate in base alla lunghezza, per esempio le LINES (long interspersed nuclear elements), elementi nucleari dispersi nel genoma, le SINE (short interspersed nuclear elements), piccolissime ripetizioni che sono molto importanti per determinare l’individualità di ciascuno di noi. Quindi ci sono delle piccole sequenze ripetute, come per esempio quelle di due nucleotidi ripetuti più volte in una determinata posizione del genoma, per cui un individuo può averne 7, un altro 14, un altro ancora 20 e dalla combinazione di questi elementi, si riesce a stabilire l’identità genetica di ciascun individuo.

I geni

I geni sono segmenti di DNA che contengono le istruzioni per produrre una particolare proteina, anche se una discreta percentuale di geni produce molecole di RNA. Esiste una correlazione fra la complessità di un organismo ed il numero di geni nel suo genoma; a causa delle differenze nella quantità di DNA intercalato fra i geni, le dimensioni dei genomi possono variare di molto. Ciascun gene ha una dimensione media di 27000 coppie di nucleotidi (di cui soltanto 1300 sono necessarie per codificare una proteina di dimensioni medie).

Ciascun gene è costituito infatti da:

• Esoni: ossia sequenze codificanti
• Introni: ossia sequenze intercalate (non codificanti)
• Sequenze regolatrici: che sono responsabili dell'espressione del gene

Complessità del genoma umano

Il genoma umano è molto complesso rispetto al genoma di E. coli.

Confronto fra genomi ed annotazione genica

La presenza di numerose sequenze prive di importanza oltre che la breve lunghezza degli esoni rende difficile identificare tutti gli esoni, dove comincia e finisce un gene e quanti esoni comprende esattamente. Una strategia si basa sul fatto che le sequenze che hanno una funzione (regioni conservate) sono relativamente conservate durante l'evoluzione e consiste nel confrontare la sequenza umana con quella di un genoma correlato, come quello del topo il cui genoma è stato sequenziato completamente.

Gli studi comparativi non solo hanno rilevato che gli esseri umani e altri mammiferi hanno in comune la maggior parte degli stessi geni, ma anche che questi geni sono spesso contenuti nello stesso ordine, una caratteristica chiamata sintesiaconservata. L'annotazione genica è il processo che consiste nel mappare geni ed altre caratteristiche biologiche all'interno di una sequenza di DNA.

Dogma centrale della biologia: DNA->RNA->Proteine

L'mRNA si dice monocistronico quando porta l'informazione per un solo gene, ed è una caratteristica tipica degli eucarioti mentre nei procarioti l'mRNA è molto spesso policistronico, cioè che porta l'informazione per più geni (il trascritto di mRNA è in grado di tradurre per più catene polipeptidiche diverse).

I cromosomi

I cromosomi in una cellula in divisione sono altamente condensati e sono noti come cromosomi mitotici e sono facilmente visualizzabili. Durante le fasi del ciclo cellulare in cui la cellula non si sta dividendo i cromosomi sono estesi e molta della loro cromatina è sotto forma di lunghi filamenti sottili e aggrovigliati così che i cromosomi non possono essere distinti facilmente. Questi sono i cromosomi interfasici.

Cromatina

La cromatina è la forma in cui gli acidi nucleici si trovano nella cellula. Negli eucarioti è costituita da DNA, RNA e proteine acide e basiche (istoni, ossia proteine basiche, e proteine non istoniche, ossia proteine neutre o acide), nei procarioti solo da DNA. La struttura complessiva della cromatina dipende da vari fattori: nel ciclo cellulare, infatti, ad esempio durante l'interfase, la cromatina è strutturalmente allentata per permettere l'accesso a DNA e RNA polimerasi che trascrivono e replicano il DNA; è meno condensata quando è associata a geni trascrizionalmente attivi, mentre è impacchettata nei geni inattivi.

Esistono diversi livelli di organizzazione della cromatina:

• La fibra da 11 nm di diametro è il primo livello, è uno stadio detto "filo a collana di perle" per il suo aspetto. In questo stadio il DNA è avvolto attorno agli istoni, senza ulteriori ripiegamenti;
• La fibra da 30 nm di diametro è il secondo livello. In esso la cromatina assume un aspetto solenoidale grazie alle interazioni tra le code degli istoni di un nucleosoma, con quelle dei nucleosomi adiacenti, nonché grazie agli istoni H1. La fibra da 30 nm è lo stadio in cui si trova la cromatina attiva in interfase (periodo compreso fra due divisioni cellulari), cioè la cromatina che viene trascritta;
• La fibra da 300 nm di diametro o fibra ad ansa, la cromatina si ripiega ulteriormente su se stessa grazie anche all'aiuto di altre proteine;
• La fibra da 700 nm di diametro, la cromatina si superavvolge, è il diametro dei singoli cromatidi;
• La fibra da 1400 nm di diametro, è il livello di condensazione massimo, quello dei cromosomi metafasici.

Istoni e nucleosomi

Gli istoni sono proteine piccole (formate da 100-200 amminoacidi) basiche (perché costituite soprattutto da amminoacidi basici, arginina e lisina), e con un eccellente grado di conservazione tra le specie; sono responsabili del primo livello dell'organizzazione del cromosoma, il nucleosoma, un complesso DNA-proteine. Ciascuna particella centrale del nucleosoma consiste in un complesso di otto proteine istoniche (H2A, H2B, H3 e H4) e di DNA a doppio filamento lungo 147 coppie di nucleotidi che avvolge sinistrosamente per 1,7 giri il nucleo istonico. Ciascun particella centrale del nucleosoma è separato da una regione di DNA linker.

Tutti e quattro gli istoni possiedono un motivo strutturale comune noto come ripiegamento istonico o histone fold, formato da 3 α-eliche connesse da anse. Nell'assemblaggio dell'ottamero istonico gli istoni si legano fra loro tramite un tetramero di H3-H4 e due dimeri H2A-H2B: un tetramero H3-H4 si forma e si lega al DNA. Si aggiungono quindi due dimeri H2A-H2B. Le reazioni di assemblaggio sono mediate da proteine chaperone degli istoni. La formazione del nucleo istonico è garantita dall'alta affinità mostrata dalle proteine istoniche nei confronti dei loro “complementari”.

Legami H e cariche positive

Ciascun nucleosoma forma circa 142 legami ad idrogeno con il DNA e inoltre contribuiscono anche numerose interazioni idrofobiche e legami salini dovuti ai residui amminoacidici degli istoni. Le abbondanti lisine ed arginine per esempio contribuiscono con le loro cariche positive a neutralizzare efficacemente l'ossatura del DNA carica negativamente.

Curvatura del DNA in un nucleosoma

Il percorso del DNA intorno al nucleo non è rettilineo, si osservano invece parecchie curve dovute alla superficie non uniforme del nucleo istonico. Queste curve richiedono una compressione della scalanatura secondaria del DNA e certi dinucleotidi nella scalanatura secondaria sono particolarmente facili da comprimere e si legano al nucleosoma con maggiore forza di altre (per esempio i dinucleotidi AA, TT e TA). Ciò spiega il posizionamento molto preciso del DNA intorno ad un nucleosoma. In generale però affinché avvenga un'interazione su larga scala tra DNA e nucleosomi la preferenza di sequenza dei nucleosomi deve essere abbastanza bassa.

Gli istoni hanno delle lunghe code N-terminali che si estendono fuori dal nucleosoma, sono accessibili anche quando la cromatina è condensata, e sono soggette a numerose modificazioni che regolano struttura e funzione della cromatina.

Code istoniche ed istone H1

I nucleosomi sono compattati l'uno sull'altro generando schiere regolari con diametro di circa 30 nm. Per formare questo compattamento intervengono sia le code degli istoni, soprattutto quella dell'istone H4, sia un altro istone, l'istone H1 (istone linker) più grande dei singoli istoni e presente su ogni nucleosoma.

Complessi di rimodellamento della cromatina e chaperone degli istoni

I meccanismi di lettura genetici richiedono un rapido accesso a molte sequenze specifiche di DNA, pertanto è necessario un allentamento dei contatti DNA-istoni. Ciò avviene grazie ai complessi di rimodellamento della cromatina dipendenti da ATP che tramite l'energia di idrolisi di ATP allentano il contatto DNA-istoni, rendendo il DNA del nucleosoma disponibile ad altre proteine cellulari.

Gli chaperone degli istoni, cooperando con proteine cariche negativamente, sono in grado di rimuovere il nucleo del nucleosoma in tutto o in parte, catalizzando uno scambio dei suoi istoni H2A-H2B o la rimozione completa del nucleo ottamerico.

Regolazione della struttura della cromatina

Si distinguono due tipi di cromatina: l'eterocromatina che è una forma altamente condensata che spegne i geni concentrata nei telomeri e nei centromeri, e l'eucromatina al contrario meno condensata. Quando un gene che è normalmente espresso in eucromatina viene sperimentalmente riposizionato in una regione di eterocromatina viene silenziato (variegazione per effetto di posizione).

Variegatura dell'effetto di posizione

L'eterocromatina normalmente non può diffondere in regioni adiacenti di eucromatina a causa di specifiche sequenze barriera. Nelle mosche che ereditano un determinato riarrangiamento cromosomico questa barriera non è più presente. Questa eterocromatina si può diffondere nel DNA adiacente. Lo schema di eterocromatina che si è formato viene ereditato da molte cellule discendenti che avranno anch'esse taluni geni inattivati. L'espansione dell'eterocromatina può “saltare” alcune regioni di cromatina, risparmiando i geni da effetti repressivi. Nella β-emoglobina c'è una proteina barriera (HS4) che impedisce l'invasione dell'eterocromatina che silenzierebbe il gene.

Modificazioni covalenti degli istoni

Le catene laterali degli amminoacidi sulle code N-terminali dei quattro istoni del nucleosoma sono soggette a molte modificazioni fra cui acetilazione e metilazione di lisine e fosforilazione su serine. Quasi tutte queste modificazioni sono reversibili e sono create (e rimosse) da enzimi specifici (istone acetiltrasferasi HAT) (istone deacetilasi HDAC). Tuttavia ci sono anche modificazioni che avvengono sul nucleo globulare del nucleosoma.

• L'acetilazione delle lisine tende ad allentare la struttura della cromatina perché l'aggiunta di un gruppo acetile alle lisine rimuove la loro carica positiva, riducendo l'affinità delle code per i nucleosomi adiacenti; alcune lisine possono essere sia metilate che acetilate, ma questi due eventi non possono avvenire contemporaneamente perché sono competitivi fra loro (il processo viene detto mutually exclusive (mutuamente esclusivo), anche perché le due modifiche sono antitetiche rispetto a ciò che avviene dopo).
• La metilazione delle lisine provoca una chiusura della cromatina.
• La fosforilazione della serina aggiunge una carica negativa ad un istone.
• La fosforilazione di una treonina.
• La mono e dimetilazione di un'arginina.
• L'aggiunta di un gruppo di ubiquitina, di SUMO o di biotina ad una lisina.

Proteine SIR

Le proteine SIR si occupano dell'impacchettamento delle regioni di eterocromatina, si occupano quindi del silenziamento genico; si legano generalmente a istoni che hanno subito una reazione di metilazione.

Varianti istoniche

Varianti istoniche esistono in quantità molto più piccole degli istoni principali. Ad eccezione dell'istone H4 esistono varianti di ciascuno degli istoni. Gli istoni principali sono sintetizzati soprattutto nella fase S del ciclo cellulare mentre la maggior parte delle varianti istoniche durante l'interfase.

Complesso lettore scrittore

Gli enzimi che modificano gli istoni (o rimuovono modificazioni) fanno parte di complessi multisubunità. Dopo che un enzima modificatore ha scritto la sua marcatura interviene un enzima lettore del codice che è posto nello stesso complesso proteico. Questa seconda proteina contiene un modulo che legge la modificazione e si lega con forza al nucleosoma appena modificato, posizionando l'enzima scrittore sul nucleosoma adiacente. Questi complessi lettore-scrittore contengono anche proteine di rimodellamento della cromatina dipendenti da ATP e lavorano tutte insieme per condensare o decondensare lunghi tratti di cromatina.

Topologia e superavvolgimento

La topologia è un’analisi che ci consente di capire strutture di ordine superiore del DNA. La prima esigenza per cui una cellula sfrutta meccanismi topologici, ossia il superavvolgimento del DNA, è per compattarlo; quando un superavvolgimento è destrorso si parla di superavvolgimento negativo, sinistrorso invece quando si parla di superavvolgimento positivo. La topologia è anche una disciplina della matematica; si occupa dei rapporti tra le curve nelle tre dimensioni dello spazio (gli assi x, y, z), in questo spazio cartesiano potete analizzare due curve, per esempio due circonferenze. Esiste una costante, L, che rappresenta il numero di legame di queste due curve: se L è 0 queste curve non si incontreranno mai, se L è 1 queste due curve non si separeranno mai a meno che non si tagli una delle due curve; L può essere anche 2 però invece di fare un solo legame se ne fanno 2.

La regola principale della topologia è L = T + W: L rappresenta il numero di legami (linking number) cioè il numero di volte che un filamento di DNA gira intorno all’altro, T il numero di giri dell’elica (normalmente in una molecola rilassata e lunga L = T), W è il numero di giri di superelica, cioè l’elica che si arrotola su se stessa. L è costante ma quando apriamo la doppia elica stiamo facendo diminuire T questo vuol dire che W deve per forza aumentare. È intuitivo che per trascrivere il DNA bisogna aprire e quindi nelle nostre cellule accade che T diminuisce e aumenta W. I superavvolgimenti che si formano quando si apre in un punto la doppia elica, hanno una tensione torsionale moto grande che aumenta pian piano e rischia di spezzare i filamenti. Quindi è ovvio che deve intervenire un enzima che regoli questo meccanismo.

Topoisomerasi

Le topoisomerasi sono degli enzimi che sono capaci di catalizzare l’interconversione tra isomeri topologici, la stessa molecola di DNA si può trovare in due forme isomeriche topologiche cioè può avere L = T (W = 0) e quindi si dice che è rilassata, oppure potrebbe trovarsi in una conformazione in cui L = T + W (>0) e si dice superavvolta. Le topoisomerasi, come tutte le isomerasi, interconvertono, per es rilassano un DNA superavvolto oppure superavvolgono un DNA rilassato. L’unico modo per modificare L è tagliare:

Topoisomerasi I

Le topoisomerasi I tagliano uno dei due filamenti, il filamento intero passa nell’incisura e poi il filamento tagliato viene richiuduto, alterando il numero di collegamenti di un'unità senza richiedere ATP.