Appunti Biologia cellulare

Organizzazione cellulare

In generale le cellule sono molto piccole, troppo per distinguerle ad occhio nudo. Non è stato possibile distinguerle fino al 1600 con l’invenzione del microscopio.

Nel 1665, Robert Hooke esaminò per la prima volta con un microscopio un pezzo di sughero. In realtà vide le pareti cellulari di cellule ormai morte, che per la somiglianza con le celle degli alveari chiamò cellulae.

Tra il 1838 e 1839, venne enunciata la teoria cellulare, secondo la quale:

• Tutti gli organismi sono composti da cellule (Hooke)
• La cellula rappresenta l’unità organizzativa di base e autonoma di tutti gli organismi (Schwann e Schleiden)
• Ogni cellula deriva da una cellula preesistente (Virchow)

Perché le cellule hanno piccole dimensioni?

Le cellule hanno piccole dimensioni per ottimizzare il rapporto superficie/volume: ciò consente alla cellula di ottenere una superficie di scambio con l’esterno adeguata al passaggio di nutrienti e scarti. In questo modo si ha una maggiore facilità di movimento delle sostanze e un controllo delle attività cellulari.

Volumi ridotti → superfici più ampie.

Le cellule possono essere procariotiche o eucariotiche; entrambe possiedono due strutture comuni:

• La membrana plasmatica
• Il citoplasma

La cellula procariotica

• Le cellule procariotiche sono molto più piccole di quelle eucariotiche e hanno una struttura di base più semplice.
• Sono comparse per prime.
• Sono prive di nucleo racchiuso da una membrana.
• Gli organismi unicellulari costituiti da cellule procariotiche, i procarioti, sono classificati in due domini: archea e bacteria.

La cellula eucariotica

• Le cellule eucariotiche contengono organuli specializzati.
• Le cellule eucariotiche hanno un nucleo delimitato da una membrana ben distinta, che racchiude il DNA.
• Gli organismi eucariotici, ovvero i protisti, i funghi, piante e animali fanno tutti parte del dominio degli eukarya.
• Le cellule eucariotiche utilizzano gli organelli per compartimentalizzare le funzioni cellulari. Gli organelli sono compartimenti interni racchiusi da membrane.
• Gli organuli del sistema delle membrane interne lavorano in sinergia per produrre i prodotti cellulari:
  • Insieme di organuli circondati da membrane
  • In comunicazione tramite membrane interne
  • Lavorano insieme nel sintetizzare, immagazzinare e distribuire i prodotti cellulari (lipidi e proteine)
  • Connessione strutturale e funzionale: tutti gli organuli sono in connessione diretta oppure attraverso vescicole che gemmano da determinati organuli e successivamente si fondono con altri organuli

Nucleo

• È il centro di controllo della cellula.
• Contiene il DNA.
• È l’organulo più grande nella maggior parte delle cellule animali.
• Contiene il nucleolo (sede di sintesi dei ribosomi).
• È separato dal citoplasma tramite la membrana nucleare, la quale è caratterizzata da pori per l’uscita di grosse molecole.

Reticolo endoplasmatico rugoso

• Presenza di sacche (cisterne) appiattite ricoperte da ribosomi.
• Svolge due funzioni principali:
  • Produce componenti del sistema di membrane
  • Assembla e modifica le proteine (glicoproteine) destinate ad essere secrete dalla cellula
• Da notare il fatto che la membrana del reticolo endoplasmatico continua con la membrana nucleare.
• I ribosomi producono le proteine, le quali vengono secrete dalla cellula, inserite nelle membrane e trasportate in vescicole ad altri organuli.

Reticolo endoplasmatico liscio

• Costituito prevalentemente da tubuli e non da cisterne come il RER.
• Sintetizza i lipidi (acidi grassi, fosfolipidi e steroidi).
• Demolisce le tossine e i farmaci nelle cellule del fegato.
• Immagazzina e rilascia ioni calcio nelle cellule muscolari.

L’apparato di Golgi

• Sacchetti appiattiti impilati uno sull’altro.
• Ricevono e modificano i prodotti del RER e REL, trasportandoli ad altri organuli o sulla superficie della cellula, per essere secreti.
• È costituito da sacche membranose discoidali stratificate, con vescicole che gemmano e si distaccano e altre che si fondono.

Lisosoma

• Vescicola circondata da membrana.
• Contiene enzimi idrolitici con funzioni digestive.
• Demolisce le sostanze alimentari e di rifiuto delle cellule.
• Le sostanze nutritive vengono incluse nella cellula, si forma il vacuolo alimentare che si fonde con il lisosoma e successivamente si ha la digestione.
• Degradazione degli organuli danneggiati (esempio mitocondrio).
• Nei globuli bianchi i lisosomi distruggono i batteri nocivi che sono stati ingeriti.

Lisosomi particolari: perossisomi

• Organuli circondati da membrana che contengono la perossidasi: enzima in grado di trasformare il perossido di idrogeno in ossigeno e acqua.

Mitocondri

• Demoliscono i carboidrati e producono ATP (adenosina trifosfato).
• Svolgono la respirazione cellulare.
• Convertono l’energia chimica presente negli alimenti in energia utilizzabile dalla cellula.
• Contengono DNA di origine materna.
• Sono formati da una membrana esterna e da una interna.

Citosol o fluido intracellulare

• È un liquido formato per la maggior parte di acqua, ioni e macromolecole.

Citoscheletro

• Dà forma alla cellula e ne guida i movimenti.
• Citoscheletro = scheletro della cellula.
• Mantiene la forma, contribuisce alla formazione delle giunzioni tra cellule e permette il movimento sia della cellula stessa sia dei suoi organuli.
• Il citoscheletro degli eucarioti è costituito da 3 tipi:
  • Filamenti di actina: sono disposti a fasci o a reticella e svolgono un ruolo strutturale di fondamentale importanza. Si tratta di filamenti flessibili e resistenti, tanto da consentire alle cellule di spostarsi con movimento ameboide o strisciando.
  • Filamenti intermedi: simili a una corda ritorta, i filamenti intermedi sono costituiti da diversi polipeptidi fibrosi e svolgono una funzione strutturale, sostenendo l’involucro nucleare e la membrana plasmatica. Hanno un diametro medio di 10nm.
  • Microtubuli: sono costituiti da una proteina globulare chiamata tubulina. Essi agiscono come rotaie lungo le quali si spostano i vari organuli cellulari. Lo scorrimento è reso possibile dalla presenza di molecole motrici associate ai microtubuli.

Ciglia e flagelli

• Contengono microtubuli.
• Sono estroflessioni a forma di frusta che si trovano in alcune cellule procariotiche ed eucariotiche.
• Negli animali svolgono ruoli cruciali lungo il tratto respiratorio (ciglia che muovono il muco) e riproduttivo (spermatozoo).
• Le ciglia sono strutture brevi, mentre i flagelli sono appendici più lunghe.

Centrioli

• Sono strutture formate da microtubuli (9 triplette).
• Sono presenti a coppie nella cellula, disposte a 90°.
• Ruolo importante nella divisione cellulare.
• Non si trovano nelle cellule vegetali.
• Sono importanti perché sono il centro di organizzazione dei microtubuli, sui quali viaggiano le proteine motrici.

Ogni cellula comunica con le cellule adiacenti. Le cellule animali sono connesse tra loro tramite tre tipi di giunzioni:

• Giunzioni di ancoraggio (desmosomi)
• Giunzioni occludenti (serrate)
• Giunzioni comunicanti (giunzioni gap)

Le cellule di un organismo pluricellulare possono diversificarsi molto tra loro, pur contenendo lo stesso DNA. Le cellule dello stesso tipo si organizzano per formare i vari tessuti di un organismo. I principali tipi di tessuti nel corpo dei mammiferi sono: epiteliale, connettivo, muscolare e nervoso.

Microscopia ottica

Quali approcci sperimentali sono stati usati finora per studiare le cellule?

• Citologia: studia le cellule dal punto di vista morfologico e funzionale. Comincia con l’avvento del microscopio ottico, lo studio della morfologia cellulare migliora con l’invenzione di nuove e molteplici tipologie di microscopia.
• Biochimica: lo studio della struttura e le trasformazioni dei componenti delle cellule, come il codice genetico, le proteine e la loro sintesi, carboidrati, lipidi, il meccanismo di trasporto della membrana cellulare e la trasduzione del segnale. Sviluppi più importanti si hanno a partire dalla messa a punto di tecniche quali l’ultracentrifugazione, la cromatografia, l’elettroforesi e la spettrometria di massa.
• Scienze omiche: le scienze che sono in grado di studiare un determinato processo nel loro insieme:
  • Genomica: i geni contenuti nel DNA e le loro molteplici funzioni.
  • Epigenomica: le modifiche epigenetiche presenti nel materiale genetico di una cellula.
  • Trascrittomica: studio di alcuni o tutti RNA messaggeri trascritti.
  • Proteomica: il complesso delle proteine, in particolare delle loro strutture e funzioni.
  • Metabolomica: tutti i metaboliti di un organismo biologico, che sono il prodotto finale del metabolismo.

Visualizzazione di cellule e tessuti

• Il microscopio è uno strumento fondamentale per effettuare gli studi su cellule, tessuti e organi.
• Esistono diversi metodi di microscopia:
  • Microscopia ottica: si basa sulla luce visibile e delle lenti per ingrandire cellule.
  • Microscopia elettronica: si basa su fasci di elettroni e permette un maggior ingrandimento → la microscopia elettronica serve quando dobbiamo vedere organuli presenti nelle cellule che non sono visibili con il microscopio ottico.
• L’ingrandimento è la capacità di fornire un’immagine ingrandita dell’oggetto osservato. Nella microscopia ottica è possibile farlo fino a 1000 volte, mentre nella microscopia elettronica fino a 10⁶ volte.
• L’ingrandimento è limitato dal potere di risoluzione, ovvero la distanza minima alla quale due punti possono essere distinti l’uno dall’altro:
  • Per l’occhio è 0.2 mm = 200 µm.
  • Per il microscopio ottico è 0.2 µm = 200 nm.
  • Per il microscopio elettronico a trasmissione è 0.2 nm = 2 Å.

Risoluzione

• Se abbiamo due sorgenti puntiformi che trasmettono la loro luce attraverso la lente, quello che andremo a vedere saranno due piccoli aloni distanti che vedremo come immagine. Il fatto che si formano gli aloni è dovuto alla diffrazione della luce, ovvero quando si attraversa un foro si generano delle onde circolari che illuminano anche le parti nascoste.
• Quando avviciniamo i due punti, gli aloni che si formano sono sovrapposti e non si riescono più a distinguere le due sorgenti luminose.

Abbe scoprì che questa distanza minima “dmin” è legata alla lunghezza d’onda della luce emessa dal punto, secondo la relazione: dmin = 0.34 x λ.

Più è corta la lunghezza d’onda, più informazioni riusciamo ad ottenere sul bersaglio che incontrano. Esempio: limitandoci alla luce visibile, già illuminando un campione viola (λ = 400 nm) invece che con la luce rossa (λ = 650 nm) è possibile diminuire la distanza minima da circa 230 nm a circa 150 nm e quindi aumentare la risoluzione dell’immagine.

La risoluzione di un microscopio dipende da:

• Caratteristiche della luce (λ)
• Caratteristiche delle lenti (apertura angolare α)
• Caratteristiche del mezzo in cui si svolge l’osservazione (n)

Apertura angolare

• È il semi angolo α del cono di luce che dal campione penetra nell’obiettivo del microscopio.
• Più è alta l’apertura angolare e più si riduce l’alone riprodotto (disco di Airy).
• Più ridotto sarà il raggio dei dischi di Airy riprodotti e più alto sarà il potere risolutivo dell’obiettivo.
• L’indice di rifrazione (n) dipende dalle caratteristiche del mezzo in cui si svolge l’osservazione. Esso misura la diminuzione della velocità di propagazione di un’onda elettromagnetica quando attraversa un materiale. La diminuzione della velocità è accompagnata dalla variazione della direzione secondo il fenomeno della rifrazione (l’olio dà meno rifrazione rispetto all’aria, perché l’indice di rifrazione dell’olio è simile a quello del vetrino sopra il quale si trova).
• Per migliorare il potere di risoluzione bisogna utilizzare obiettivi ad immersione, utilizzare lenti con apertura angolare grande e lunghezze d’onde a bassa ampiezza.

Microscopia ottica

Si ha una sorgente luminosa; un condensatore che condensa il cono di luce sulla sezione che dobbiamo studiare e un obiettivo. Il fascio di luce passa attraverso un tubo ottico e va a finire all’oculare. Ogni obiettivo ha delle sigle che lo identificano: specificano il grado di ingrandimento, l’apertura numerica e se sono ad aria o ad olio (immersione).

Nel microscopio convenzionale, il condensatore proietta dal basso il fascio di luce e gli obiettivi sono in alto. Nel microscopio invertito, appunto, condensatore e obiettivo sono invertiti.

Diversi tipi di microscopia ottica

• Microscopia in campo chiaro: è semplicemente la luce che passa attraverso il campione e viene trasmessa all’immagine. Le cellule sono difficili da distinguere perché la cellula è sostanzialmente incolore e composta da acqua.
• Microscopia a contrasto di fase: per migliorare il contrasto, è possibile sfruttare le lievi differenze di indice di rifrazione del materiale da osservare. I raggi di luce che attraversano le cellule subiscono un leggero rallentamento che risulta in una variazione della fase dell’onda. Un anello di fase posto sopra l’obiettivo trasforma questa variazione di fase in cambiamenti di luminosità → aumento dei dettagli delle cellule che si vogliono osservare.
• Microscopia a contrasto di interferenza differenziale: funziona sul principio dell’interferometria e misura la differenza di cammino ottico fra oggetto e campo circostante, permettendo di generare contrasto e di vedere meglio le cellule.
• Microscopia a campo scuro: la luce che arriva dal condensatore non passa direttamente, ma passa in modo obliquo → porta ad una visione con lo sfondo nero. Aumenta il potere di risoluzione di 10 volte rispetto a quella chiara.

Con il microscopio ottico e determinate attrezzature è possibile osservare i movimenti coinvolti in processi come la migrazione cellulare e la mitosi. Si registrano immagini in successione, separate da un breve intervallo di tempo, così che quando la serie di immagini vengono proiettati a velocità normale gli eventi appaiono molto accelerati.

Time lapse: un filmato ottenuto processando una serie di fotografie scattate in sequenza e opportunamente montate o attraverso video che verranno poi accelerati.

Con il microscopio ottico è possibile migliorare il contrasto dei preparati colorandoli. È difficile vedere la struttura interna di una cellula, non solo perché le sue parti sono piccole, ma anche perché in genere sono incolori e trasparenti. Utilizzando diverse classi di coloranti è possibile migliorare il contrasto delle immagini al microscopio.

Coloranti vitali

• Le cellule possono essere colorate senza fissazione.

I coloranti vitali hanno la proprietà di essere assunti attivamente da alcune cellule viventi permettendo così la loro identificazione o lo studio di funzioni particolari. Esempi di coloranti vitali sono:

• Alzarina: incorporata elettivamente nella sostanza fondamentale dell’osso in corso di calcificazione, colorandola di rosso. Gli osteoblasti elaborano la matrice extracellulare organica del tessuto osseo costituita da fibre di collagene, proteoglicani, glicoproteine e vescicole di secrezione ricche di fosfatasi alcalina e di ioni calcio e fosfato → l’alzarina colora di rosso i depositi di calcio.
• Blu triptan: litio carminio, blu pirrolo, che sono fagocitati dai macrofagi permettendo così la loro individuazione.
• Verde janus: colora elettivamente i mitocondri in virtù delle proprietà ossido – riduttive di questi organuli.
• Rosso neutro: colora i granuli specifici dei leucociti (in rosa quelli dei granulociti neutrofili, in giallo quelli degli eosinofili e in rosso quelli dei basofili). Esso è incolore quando non è protonato e presenta il colore quando viene protonato (ad esempio nei lisosomi, in quanto abbiamo un ambiente acido).
• Blu di metilene: è un colorante basico che colora in blu il nucleo e il reticolo endoplasmatico rugoso delle cellule e che colora di blu intenso gli assoni dei neuroni.

Coloranti sopravitali

Sono somministrati a cellule o a tessuti isolati dall’organismo. I coloranti si legano ai tessuti mediante legami chimici con le proteine, gli acidi nucleici, le glicoproteine e le lipoproteine. Sono classificati in due categorie:

• Coloranti acidi: nei quali il gruppo cromoforo è acido (anionico) che ha affinità per le molecole cariche positivamente, ad esempio alcune classi di proteine presenti nel citosol; i più comuni sono eosina, arancio G e verde metile. I componenti dei tessuti che hanno affinità per i coloranti acidi sono detti acidofili.
• Coloranti basici: nei quali il gruppo cromoforo è basico (cationico), che ha affinità per le molecole cariche negativamente, ad esempio DNA ed RNA, principalmente nel nucleo: i più comuni sono ematossillina, blu di metilene, blu di toluidina, tionina, verde di metile, pironina, azzurro B, fucsina basica. I componenti dei tessuti che hanno affinità per i coloranti basici sono detti basofili.

Preparazione di un campione biologico per la microscopia ottica

• Fissaggio (formaldeide o alcool)
• Preparare il campione per il taglio (inclusione in paraffina)
• Taglio (microtomo)
• Colorazione

Colorazione ematossilina e eosina

• Vengono usate insieme.
• Ematossilina colore blu – viol