Appunti Basi biologiche

Programma A.A. 2021/22

Prof. Francesco Piva

Nozioni preliminari

• Progetto genoma umano
• Linguaggio della regolazione genica, del codice genetico, dell'importo ed esporto nucleare
• Introduzione all'epigenetica

Colture cellulari

• Tecniche delle colture cellulari: terreni di coltura, strumentazione di laboratorio, allestimento
• Differenze di comportamento tra cellule normali e tumorali
• Esperimenti per osservare l'aggressività delle cellule: saggio di riparazione della ferita, saggio dell'invasione

Tecniche di microscopia

• Differenze tra microscopio ottico ed elettronico
• Microscopia a forza atomica
• Microscopia a fluorescenza: spettro di emissione-eccitazione della fluorescina sodica, struttura microscopio, vantaggi e svantaggi
• Microscopia elettronica: principio di funzionamento, preparazione campione (tecnica dello sputtering), fenomeno dello scattering
• Differenze tra microscopio elettronico a scansione e a trasmissione
• Tipologie di pompe per il vuoto

Membrane biologiche

• Fosfolipidi, liposomi, glicoproteine
• Elettroporazione
• Osmosi
• Trasporto di ioni e sostanze polari attraverso la membrana: porine, diffusione facilitata, trasporto attivo (es. pompa sodio potassio, multiple drug resistance, regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica)
• Canali a controllo: di voltaggio, di ligando, meccanico
• Integrazione tra le funzioni della membrana e quelle del citoplasma (es. barriera epiteliale dell'intestino, emato-encefalica, scambio gassoso)
• Potenziale di membrana
• Trasmissione del segnale nervoso lungo l'assone: sinapsi chimiche/elettriche, neurotrasmettitori (es. farmaci per la depressione, anti-aritmici, contro l'infarto)
• Recettori tirosina-chinatici e fattori di crescita causa del tumore (definizione di protooncogeni e oncosoppressori)

Citoscheletro

• Funzioni
• Microtubuli: funzione, sostanze che fungono da inibitori (zafferano dei prati, taxus brevifolia), proteine motrici
• Microfilamenti: funzioni, sostanze che fungono da inibitori (falloidina), contrazione muscolare
• Filamenti intermedi
• Esercitazione: programma "UCSC BLAT"

Sistemi di membrane citoplasmatiche

• Nucleo
• Apparato del Golgi
• Traffico di vescicole tra compartimenti cellulari: modalità, gemmazione, trasporto e fusione
• Proteine Rab e SNARE
• Reticolo endoplasmatico liscio e rugoso: differenze e funzioni
• Esosomi: caratteristiche, funzioni, apparecchiature per l'osservazione (microscopia a basso ingrandimento che sfrutta la diffusione della luce + centrifugazioni, tecnica della gel-filtrazione, immuno-cattura)
• Lisosomi: caratteristiche, funzioni

Genetica

• Obiettivo e ruolo
• Genetica dell'ereditarietà: definizioni, esperimenti e leggi di Mendel
• Eccezioni alle leggi di Mendel: crossing-over, dominanza incompleta (es. ipercolesterolemia), codominanza (es. gruppi sanguigni, anemia falciforme, fibrosi cistica), penetranza incompleta (es. retinoblastoma, neurofibromatosi), epistasi, effetto genetico materno, epigenetica
• Variabilità cromosomica: analisi del cariotipo, riarrangiamenti cromosomici e relativi effetti
• Genetica dello sviluppo
• Sistema immunitario: risposta immunitaria umorale e cellulare, selezione clonale, complesso maggiore di istocompatibilità (es. trapianto e rigetto)
• Genetica di popolazione
• Mutazioni: tipologie ed effetti, tabella di somiglianza tra amminoacidi
• Radiazioni ionizzanti

Processo di trasormazione da cellula normale a tumorale

Splicing

• Definizione, differenza tra esoni e introni
• Splicing alternativo

Epigenetica

• Teorie sulla formazione della specie
• Meccanismi cellulari attraverso cui agisce l'epigenetica: metilazione del DNA, regolazione della cromatina
• Differenza tra cellula staminale e differenziata
• L'alimentazione e alcuni comportamenti in relazione all'epigenetica

Cromatografia

• Cromatografia su carta
• Cromatografia su colonna e HPLC (+ pompa per cromatografo)
• Gas cromatografo
• Sensori per gas cromatografo: fotometrico a fiamma, a ionizzazione di fiamma, a cattura di elettroni, a conduttività termica

Spettrometro di massa

Spettrofotometria

• Schema a blocchi
• Lampade
• Reticolo di diffrazione
• Spettrofotometro a doppio raggio e a vettore di diodi

Spettrofluorimetria

Fotomoltiplicatore

Contatori Geiger

• Particelle ionizzanti
• Dispositivo per rilevare radiazioni
• Camera a ionizzazione
• Contatore Geiger-Muller

Cenni di fisica atomica e NMR

Esercitazioni su LTspice

• Generatore ideale e reale
• Circuito raddrizzatore a ponte di Wien
• Circuito duplicatore di tensione
• Diodo Zener
• Diodo SCR
• Circuito stabilizzatore di tensione con transistor npn
• Circuito con stabilizzazione perfetta
• Transistor npn usato come amplificatore in tensione e in corrente
• Transistor npn usato come interruttore
• Circuiti stampati

Dall'era della lettura del genoma a quella della riscrittura

La genetica consiste nello studio dell'informazione e riguarda come essa influenza la vita. Il genoma è l'insieme dell'informazione genetica di un individuo, quindi contiene tutto il DNA ovvero in esso è scritto come siamo fatti, le nostre variabili fenotipiche (come il colore dei capelli, occhi), la predisposizione ad ammalarci o meno in conseguenza di certe condizioni ambientali, le malattie a cui siamo più suscettibili, le dosi e i farmaci che funzionano bene per noi, le informazioni di base della nostra vita contiene il progetto per costruire un individuo.

In ogni nostra cellula, nel vi è nucleo un filo di DNA, che contiene il genoma del nostro organismo. Il fenotipo, cioè l'insieme delle caratteristiche morfologiche e funzionali di un organismo, è determinato da una componente genetica, il genotipo e da una componente ambientale. Esempio: se un bambino adottato e la sua famiglia si ammalano della stessa malattia allora è prevalsa la componente ambientale, in quanto essi non condividono gli stessi geni.

È di interesse lo studio che riguarda le coppie di gemelli, che possono essere di due tipi:

• Monozigoti: sono a tutti gli effetti due individui geneticamente identici, perché derivano da una stessa cellula divisa in due, ovvero c'è un solo genoma in una sola cellula che si divide a metà; se i due gemelli vivono in condizioni ambientali diverse e si ammalano contemporaneamente della stessa malattia, allora significa che questa presenta una base genetica rilevante.
• Eterozigoti: gemelli-fratelli, perché derivano dalla fecondazione di due spermatozoi diversi con due ovociti diversi, semplicemente hanno condiviso lo stesso ambiente di sviluppo uterino.

La genetica riguarda anche gli alberi, ci sono foglie e forme diverse, perché la forma della foglia è scritta nel genoma di quella pianta. Il genoma contiene anche i caratteri fisici dell'individuo come la forma del naso, le impronte digitali (a-dermatoglifia: assenza delle impronte digitali). Il genoma contiene miliardi di basi: nel cromosoma 1 abbiamo circa 130 milioni di caratteri, basi (ogni base codifica 4 caratteri e quindi vale 2 bit per cui ho 260 megabit). Uno degli obiettivi di questa era è capire dove sono le zone genomiche deputate al controllo di determinati caratteri.

Inoltre, il genoma è utile a predire certe malattie: per esempio, è noto a tutti che il fumo fa male e infatti quando si fuma, si introduce nel corpo una miriade di sostanze nocive, come il catrame. Il corpo per difendersi da queste sostanze xenobiotiche, estranee, produce enzimi di detossificazione, cioè proteine che si occupano di eliminare queste sostanze tossiche tramite la trasformazione chimica di una molecola; infatti, essendo di solito le sostanze tossiche lipofile, cioè si sciolgono meglio nei grassi, queste vengono trasformate in idrofile e, successivamente, eliminabili tramite urina. Questi enzimi, chiamati citocromi P450, sono presenti in molte versioni differenti, per cui ognuno è capace di combattere le sostanze nocive, ma con tempistiche differenti (chi impiega più tempo ha un rischio maggiore di contrarre malattie).

Questo discorso è molto utile in medicina, poiché ogni persona possiede una differente risposta operata dagli enzimi verso gli antibiotici:

• Enzima troppo efficiente: l'antibiotico viene smaltito troppo in fretta e non riesce ad agire, cioè uccidere i batteri.
• Enzima troppo poco efficiente: l'antibiotico viene smaltito con il doppio del tempo necessario, determinando la morte dei batteri (o comunque impedisce la loro crescita) ed effetti indesiderati, dovuti al fatto che costituiscono una tossina nociva per il fegato.

L'approccio della medicina classica prevede di fornire la stessa dose del farmaco ad ogni soggetto a differenza della medicina personalizzata, che prevede di studiare i geni per fornire la corretta dose del farmaco al paziente da curare (si parla di cure di prima linea, poi il farmaco scelto è sbagliato, perché ha effetti collaterali, allora si cambia cura, cura di seconda linea).

Era della lettura del genoma

Il progetto genoma umano (1990-2003) consisteva nel determinare la sequenza di basi ACGT del nostro genoma, progetto tanto lungo e costoso che si è sequenziato un solo genoma, quello collettivo. Miliardi di basi da sequenziare a pezzettini da 500/600 basi tramite l'uso di sequenziatori, che sequenziava in un'ora circa 200/300 basi. Oggi un intero genoma viene sequenziato in un paio di ore.

Si è trovato che:

• In ogni cellula vi sono 3,2 miliardi di basi, una quantità enorme di informazioni.
• In tutte le nostre cellule (del fegato, del cuore ecc.) c'è lo stesso genoma e solo l'1,5% è codificante, cioè contiene geni, il restante è definito DNA spazzatura.
• Esistono solo 30 mila geni (un moscerino ne ha 16 mila, un vermetto ne ha 22 mila! Dov'è l'origine della nostra complessità?).
• Si hanno delle sequenze virali ormai degradate, tanto "sporche di rumore".

Ora siamo nell'era post-genomica, il cui scopo è quello di decifrare, interpretare il genoma, cioè quella sequenza di caratteri. Il DNA di ogni singola cellula è lungo 2 metri, quindi la somma delle lunghezze di tutti i DNA del corpo è pari alla distanza tra la terra e la luna.

Nel genoma coesistono più linguaggi:

Linguaggio della regolazione genica o della trascrizione

• Tra i 30 mila geni che abbiamo, alcuni vengono utilizzati sempre (geni housekeeping, geni del mantenimento dello standard), cioè sono sempre accesi, perché devono assolvere a funzioni fondamentali, altri geni che, invece, si attivano in certe condizioni particolari, cioè la loro funzione è regolata.
• Esistono dei sistemi cellulari che sono in grado di riconoscere quando il DNA è danneggiato, attivando il sistema di riparo del danno di DNA, costituito da geni regolanti che proteggono l'organismo in caso arrivi un virus.

Regolazione genica

Dato uno stimolo esterno, come fa a sapere la cellula quali geni accendere e quali spegnere?

• Il gene fisicamente è una sequenza di DNA, di basi che vengono trascritte al bisogno.
• A monte della sequenza genica contenente mille basi, c'è ne è un'altra costituita da 3 mila basi chiamata promotore, che dunque è una sequenza di DNA a stringa o a monte del gene.
• Nel promotore c'è scritto il linguaggio della regolazione genica, ovvero dice in corrispondenza di quale evento il gene deve essere attivato/spento; quindi, contiene, in un linguaggio ancora da scoprire, istruzioni, secondo cui accendere o spegnere quel gene sulla base di certi stimoli.

Il promotore regola la trascrizione del gene e presenta alla sua fine delle piccole sequenze, chiamate motivi (sequenze di 4/5 basi), che segnalano al sistema della trascrizione che il promotore finisce in quel punto e da lì inizia il gene. Alla fine del promotore ci sono delle sequenze ben specifiche, chiamate data-box, riconosciute da proteine specifiche che in parte si chiamano fattori di trascrizione, in parte polimerasi.

Uno degli ultimi obiettivi della ricerca è quello di decifrare il linguaggio della regolazione genica (non si sa a priori, dato uno stimolo, l'effetto che si avrà). A livello sperimentale esistono degli esperimenti di trascrittomica (biotecnologia che mira all'analisi del trascrittoma, ovvero dell'intero profilo degli RNA messaggeri (mRNA) trascritti di un organismo o di un particolare organo, tessuto o cellula a un dato stadio dello sviluppo dell'organismo o a seguito di particolari condizioni ambientali), lunghi e costosi, ma che permettono di scattare un'istantanea alla cellula in esame e permettono di capire in quel momento quali geni sono accesi (presenza di RNA nella cellula) e quali spenti.

Codice genetico

• Tabella di corrispondenze tra la sequenza del gene e la sequenza proteica prodotta dal gene.
• È nota la corrispondenza tra sequenza nucleotidica (mondo del DNA) e sequenza amminoacidica (mondo delle proteine), ovvero il codice genetico.
• Quando il gene è attivato, viene prima trascritto, cioè trasformato in RNA, e poi viene prodotta la proteina corrispondente (l'informazione del DNA per essere fenotipo deve diventare proteina).
• Tale linguaggio è non univoco ed è ridondante, perché lo stesso amminoacido può essere espresso da più triplette di nucleotidi (ridondanza: robustezza al rumore, che nel nostro caso è espressa come robustezza alle mutazioni).

Esempio: Stesso amminoacido (lisina) decodificato da tre triplette diverse.

• CCACCCCCGCCT: ci sono più codoni, che hanno lo stesso significato, cioè che producono sempre la lisina
• Se nel gene ho la tripletta CCA, poi subisce una mutazione (cambio di una base) e si ottiene CCG, questa variazione non produce alcun effetto in negativo, poiché quel codone codifica sempre lo stesso amminoacido.
• Queste parole hanno lo stesso significato, infatti si dice che costituiscono la robustezza del nostro codice genetico.

Si possono tollerare le mutazioni sulla terza base, in genere la mutazione sulle prime due basi determina una proteina differente, per cui si ottengono codoni non proprio sinonimi perché influenzano lo splicing. Quando il DNA produce RNA, non si ha una struttura solida, ma una catena flessibile di basi; alcune basi hanno la tendenza ad attrarsi e ad assumere strutture tridimensionali (strutture scritte nel gene: dalla sequenza è possibile prevedere la struttura).

Il promotore non produce RNA, ma resta DNA, che è una struttura rigida, poco flessibile (poco binding), perché presenta proteine istoniche.

Linguaggio dell'importo-esporto nucleare

La cellula, sulla sua superficie, possiede dei pori nucleari selettivi alle sostanze, passaggio che è regolato dal DNA (stabilisce quale sostanza può entrare e quale uscire dalla cellula). Il poro è fatto di sequenze di amminoacidi, quindi proteine.

Esempi:

• Quando si origina un battito cardiaco, la cellula apre o meno certi canali a determinati ioni sulla base di una certa tensione (millivolt).
• Ci sono degli RNA che non devono uscire dal nucleo, perché hanno una funzione regolativa, quindi le sequenze di DNA presentano dei motivi per permettere questo meccanismo.

Le proteine possono avere funzione meccanica (es. proteine del citoscheletro), altre possono assumere la struttura di canali, possono essere dei sensori (es. ciglia del rene, che sono ricettori specifici; ciglia degli epiteli che intrappolano con il muco i batteri). Purtroppo, data una sequenza amminoacidica, non si riesce a prevedere quale sarà la funzione di una certa macchina molecolare, della proteina (di cui si può leggere gli amminoacidi ed è possibile sequenziarla).

Sindrome della fibrosi cistica: il muco prodotto dalle ciglia delle cellule è molto viscoso a tal punto che esse non riescono a spazzarlo via, quindi il muco carico di batteri resta lì, per cui intervengono i macrofagi, creando una grande infiammazione, che porta alla distruzione degli organi. I pori permettono anche il passaggio di proteine, come i fattori di trascrizione, che servono a portare nel nucleo il messaggio di infiammazione.

Le proteine, costituite da amminoacidi, si ripiegano, per cui alcuni filamenti possono nascondere le sequenze che sono su un altro filamento; spesso tale parte contiene il nuclear localisation, una sequenza di amminoacidi che viene riconosciuta dai pori e che permette loro di entrare dentro il nucleo. Questo segnale di localizzazione nucleare è come se venisse coperto e la proteina resta nel citoplasma, ma se sente l'informazione, questa macchina molecolare cambia forma e può essere portata nel nucleo dove viene riconosciuta dai promotori che attivano i rispettivi geni.

Epigenetica

La genetica studia come si trasmette l'informazione in maniera ereditaria, da una generazione all'altra, e come l'informazione si manifesta, quindi come dal gene si produce il carattere. L'epigenetica (significa "Qualcosa che sta sopra la genetica") afferma che i nostri geni possono essere regolati (accesi e spenti) anche dall'ambiente circostante, da ciò che si mangia, dai pensieri e dalle attività svolte. Determinati stimoli ambientali modificano gli organismi in maniera epigenetica.

L'ambiente può modulare i nostri geni a livello epigenetico, cioè influenzare il modo in cui i nostri geni vengono espressi senza alterare la sequenza del DNA stesso. Questo significa che due individui con lo stesso DNA possono avere espressioni geniche diverse a seconda delle condizioni ambientali in cui si trovano.