8. Metabolismo e analisi i lipidi (generalità e tecniche per la valutazione delle dislipidemie)

LIPOPROTEINE

Il colesterolo, i fosfolipidi, i trigliceridi, gli esteri del colesterolo, essendo insolubili in acqua e, quindi, di conseguenza, anche nel sangue, per veicolare nel torrente circolatorio devono assemblarsi tra loro e con proteine a formare le cosiddette lipoproteine. Si distinguono diversi tipi di lipoproteine: chilomicromi, LDL, HDL, VDL.

I chilomicroni sono stati descritti precedentemente.

Le VLDL (lipoproteine a bassissima densità) sono sintetizzate dagli epatociti. Esse trasportano trigliceridi dal fegato (dove sono stati sintetizzati, ad esempio, a partire dal glucosio) ad altri tessuti (soprattutto quello adiposo e muscolare). Anche i trigliceridi delle VLDL, come quelli dei chilomicroni, vengono idrolizzati dalla lipoproteina lipasi. Questo porta alla formazione di lipoproteine IDL, dalle quali vengono "rubati" altri lipidi, formando quindi le LDL. I processi che interessano le VLDL e che portano alla formazione di IDL prima e di LDL dopo costituiscono il

cosiddetto CICLOENDOGENO. Le LDL (lipoproteine a bassa densità) derivano dalle VLDL, per progressivo impoverimento del loro contenuto in trigliceridi. Sono cariche di colesterolo che trasportano e distribuiscono ai tessuti periferici. Le LDL entrano nelle cellule attraverso meccanismi di endocitosi mediati da recettori (glicoproteine) concentrati in corrispondenza di invaginazioni chiamate fosse rivestite (dette anche coated pits), in quanto tappezzate da una particolare proteina fibrosa a forma di canestro, chiamata clatrina. I recettori riconoscono la apo B-100 presente sulla superficie delle LDL, si legano e formano il complesso LDL-recettore che viene avvolto dalla clatrina ed internalizzato nella cellula sotto forma di vescicola rivestita. Per azione di un enzima il complesso LDL-recettore perde il rivestimento e si ha dissociazione del complesso; i recettori ritornano sulla superficie delle fossette per ripetere l'operazione con altre LDL. Quello che rimane della vescicola entranei lisosomi, il sito principale di degradazione delle LDL. Durante questo processo, le idrolasi lisosomali idrolizzano le LDL, separando il colesterolo dalle proteine. Tuttavia, se le LDL vengono modificate chimicamente, chimico-fisicamente o immunologicamente, diventano estranee al normale recettore che non le riconosce, non le lega e non le fa entrare all'interno della cellula. Di conseguenza, la concentrazione di LDL nel sangue aumenterà e tenderà ad accumularsi tra le cellule della parete dei vasi sanguigni. Una volta che le LDL si trovano in questa posizione, subiscono ulteriori modificazioni ossidative e aumentano la permeabilità dell'endotelio vascolare ai monociti e ai linfociti T, che migrano all'interno della parete dei vasi sanguigni. Nel corso del tempo, queste cellule si trasformano in macrofagi, che presentano recettori in grado di riconoscere le LDL modificate e le internalizzano. Queste cellule diventano, quindi, i principali responsabili dell'accumulo di colesterolo nella parete dei vasi sanguigni, contribuendo così allo sviluppo dell'aterosclerosi.quindi, cellule schiumose. Queste ultime secernono delle sostanze infiammatorie e fattori di crescita che inducono proliferazione cellulare delle fibrocellule muscolari lisce. Tale situazione porta alla formazione di una capsula fibrosa che ricopre l'accumulo adiposo. Si formano così le placche aterosclerotiche. E' stato osservato che un più elevato contenuto ematico in HDL, piuttosto che in LDL, potrebbe prevenire la formazione di queste placche. Le HDL (lipoproteine ad alta densità) sono secrete nel sangue dal fegato e intestino. Sono quindi deputate al trasporto del colesterolo dai tessuti periferici al fegato. Il colesterolo contenuto nelle HDL, per poter diffondere nei tessuti, viene esterificato attraverso una reazione catalizzata dalla lectina colesterolo acil transferasi (LCAT), nella quale la reazione avviene il trasferimento dell'acido grasso dalla lectina al colesterolo, con conseguente formazione di colesterolo esterificato. Questa reazioneÈ particolarmente importante nel trasporto inverso del colesterolo (cioè quello attuato proprio dalle HDL). ESEMPIO DI ESTERE DEL COLESTEROLO: SI OSSERVA LA CATENA LINEARE DI UN ACIDO GRASSO A SINISTRA CHE LEGA CON LEGAME ESTEREO IL COLESTEROLO A DESTRA. Nel fegato, il colesterolo o viene utilizzato per sintetizzare i sali biliari o viene eliminato con la bile. Sulla superficie delle HDL è presente una importante apolipoproteina, l'apo-A, che permette a queste lipoproteine di legare i recettori sulla membrana delle cellule epatiche e permette al colesterolo in eccesso di riconoscere le HDL. Il rapporto LDL/HDL non deve mai superare il valore di 4. DELLE -> SEPARAZIONE LIPOPROTEINE PLASMATICHE I lipidi in generale hanno una bassa densità e per questo contribuiscono a ridurre anche la densità delle lipoproteine di cui ne fanno parte. In base alla percentuale di lipidi, le varie categorie di lipoproteine (prima elencate) hanno diversa densità tra di loro. I chilomicroni,come evidenziato nella tabella prima riportata, sono le lipoproteine con la densità più bassa, poi a seguire le VLDL, le LDL e le HDL in ultimo (cioè hanno la densità più alta). Proprio perché hanno una diversa densità, le lipoproteine possono essere separate attraverso un FRAZIONAMENTO BASATO SULLA DENSITÀ. Si effettua, cioè, una ultracentrifugazione del plasma in una soluzione di NaCl a densità nota, e le lipoproteine con la densità più elevata (cioè le HDL) tendono a sedimentare, cioè a scendere sul fondo della provetta. Le lipoproteine con una più bassa densità migrano verso la superficie con una velocità tanto più elevata quanto più bassa è la loro densità. I chilomicroni quindi si disporranno più in alto. Al di sotto di essi si disporranno le VLDL e tra le VLDL e le HDL del fondo si disporranno le LDL. Le varie frazioni lipoproteiche possono

essere separate anche conTECNICHE ELETTROFORETICHE. Una rapida separazione dellelipoproteine del plasma si può ottenere per elettoforesi su carta, o meglio su gel di agarosio a Ph 8.4.

La mobilità elettroforetica dellevarie lipoproteine dipende dalla loro carica elettrica, dalla loromassa e dal tipo di supporto utilizzato per la separazioneelettroforetica. Le HDL migrano più velocemente verso il polopositivo, seguite dalle VLDL e dalle LDL; i chilomicroni rimangonoinvece fermi sulla zona di applicazione del plasma. A corsaelettroforetica effettuata, le frazioni lipoproteiche vengonoevidenziate mediante coloranti dei lipidi. Per la praticità delprocedimento, la separazione elettroforetica delle lipoproteine delplasma viene effettuata di routine a scopo diagnostico.

DISLIPIDEMIALa dislipidemia è la variazione di quantità dei lipidi circolanti nelsangue, in particolare del colesterolo, dei trigliceridi, dei fosfolipidi, assai più

frequentemente in aumento (ipercolesterolemia, ipertrigliceridemia, iperfosfolipidemia, generalmente chiamate iperlipidemie), più raramente in diminuzione (ipolipidemia). Sebbene molto poco frequente l'ipolipidemia può causare mancato accrescimento corporeo; ridotti livelli di HDL possono causare insorgenza di placche aterosclerotiche, mentre ridotti livelli di LDL sono salutari, infatti riducono il rischio di infarto. L'assenza totale di HDL (malattia di Tangier) provoca accumulo di esteri del colesterolo nelle tonsille, nelle adenoidi e nella milza. È una malattia benigna. Il rischio di sviluppare aterosclerosi aumenta parallelamente all'incremento dei livelli di colesterolo, così come aumenta anche il rischio di sviluppare xantomi (cioè accumulo di lipidi nella pelle). A seconda delle cause, le dislipidemie si distinguono tradizionalmente in primitive (su base genetica) e secondarie (o acquisite, cioè causate da malattie come diabete, ipertiroidismo,

Abuso di alcol, cirrosi epatica, danni renali ecc.). L'Organizzazione Mondiale della Sanità ha adottato convenzionalmente una classificazione delle dislipidemie in sei tipi (classificazione di Fredrickson), che non tiene conto della causa o dell'eventuale base genetica della dislipidemia, ma solo del fenotipo, del conseguente aspetto del siero e dei livelli di lipoproteine presenti. L'aspetto del siero viene valutato dopo essere stato incubato per 12 ore a 4°C. (vedi slide per l'immagine reale)

ESAMI DI LABORATORIO PER EVIDENZIARE DISLIPIDEMIE

Tre esami sono sufficienti per avere un quadro soddisfacente della situazione del metabolismo lipidico:

• Il dosaggio del colesterolo totale;
• Il dosaggio del colesterolo HDL;
• Il dosaggio dei trigliceridi.

In alternativa al dosaggio del colesterolo totale e del colesterolo HDL, potrebbe essere richiesto il dosaggio delle apolipoproteine A e B dal momento che la prima tipologia è legata alla superficie del colesterolo HDL.

mentre la apo-B 100 è specifica delle LDL.
DEL COLESTEROLO TOTALE → MISURA
Per determinare il colesterolo totale scindono gli esteri del colesterolo in colesterolo libero attraverso una reazione catalizzata dalla colesterolesterasi. Il colesterolo libero, formatosi attraverso la reazione precedente, insieme a quello che è presente già in forma libera nel campione (e quindi non era esterificato), viene ossidato da parte dell'ossigeno molecolare attraverso una reazione catalizzata dalla colesterolo ossidasi. Si forma così colesterone e acqua ossigenata.
Colesterolo libero + O2 → colesterone + H2O2
Per misurare la quantità di perossido di idrogeno, direttamente proporzionale a quella del colesterolo, si aggiunge perossidasi, 4-amino antipirina e clorofenolo. Si forma così un composto chinonico colorato che assorbe a 500-550 nm.
Se la determinazione viene effettuata senza procedere alla idrolisi preliminare degli esteri colesterolici, si determina ilsul quale sono presenti le HDL, si procede con la misurazione del colesterolo. Per fare ciò, si utilizzano reagenti specifici che reagiscono con il colesterolo presente nelle HDL, formando un complesso colorato. La quantità di colesterolo presente viene quindi determinata tramite spettrofotometria, misurando l'assorbanza del complesso colorato a una determinata lunghezza d'onda. Questo permette di ottenere la concentrazione di colesterolo HDL nel campione analizzato.