7 PCR e progettazione primer e primer degenerati

USO DEI PRIMER SINTETICI IN BIOLOGIA MOLECOLARE

I primer sono utilizzati in molte tecniche di biologia molecolare che richiedono la DNA-polimerasi, come in alcune tecniche di sequenziamento del DNA e nella reazione acatena della polimerasi (PCR). I primer usati in queste tecniche sono dei cortiframmenti di DNA (differentemente da quanto accade in natura), della lunghezza di 18-20 basi. Questi inneschi sono costruiti in laboratorio attraverso una sintesi chimica.

PCR

La PCR è una tecnica che consente di ottenere rapidamente milioni di molecole identiche di DNA a partire da quantità estremamente ridotte dell'acido nucleico. Infatti la PCR è una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico frammento di DNA mediante una DNA polimerasi. Nella reazione sono coinvolti due oligonucleotidi a singolo filamento (primer) complementari uno all'estremità 3' e l'altro all'estremità 5' del segmento di DNA che si vuole amplificare.

Che costituiscono gli elementi di innescodell'attività della DNA polimerasi. Altri elementi coinvolti nella reazione sono idesossiribonucleotidi (unità del DNA, ciascuna composta da una base azotata, unozucchero desossiribosio e uno o più gruppi fosfato) e il MgCl2: i primi sono necessariper la sintesi delle nuove eliche ed il secondo rappresenta il cofattore indispensabilealla DNA polimerasi e maggiore è la quantità di MgCl , minore sarà la specificità di2legame tra primer e filamento bersaglio, cioè i primer legheranno anche le estremitàche non sono perfettamente complementari. Inizialmente veniva utilizzata una DNApolimerasi prodotta da E.Coli. Tuttavia, questo enzima non è stabile alle altetemperature e viene inattivato durante la fase di denaturazione di ciascun ciclo PCR.Era pertanto necessario aggiungerne una nuova aliquota prima della fase diestensione, che veniva effettuata ad una temperatura di 37 °C.

Tutto ciò rendeva la tecnica laboriosa e costosa e aumentava la probabilità di avere prodotti di reazione aspecifici. Nel 1988 fu isolata una DNA polimerasi termostabile prodotta dal batterio termoresistente Thermus aquaticus (Taq DNA Polimerasi). L’uso di questa polimerasi ha consentito di effettuare la fase di estensione a 72 °C aumentando la resa e la specificità dei prodotti di reazione e soprattutto ha reso possibile l’automazione del processo. La reazione prevede il succedersi di cicli di amplificazione durante i quali si alternano tre diverse temperature che rendono possibile rispettivamente:

1. La denaturazione della doppia elica del DNA stampo in due singole eliche (alla temperatura di 95 °C). Normalmente il DNA si trova nella classica conformazione a doppio filamento in cui i due filamenti (strands) del DNA sono tenuti assieme dai legami a ponte di idrogeno formati tra le basi azotate complementari (A:T; G:C) . Il DNA deve essere portato ad una

Condizione di singola elica (single-stranded) in modo che successivamente si verifichi l'appaiamento (annealing) alle molecole di primer (anch'esse a singolofilamento). Per fare ciò la soluzione contenente il DNA viene portata ad una temperatura al di sopra della sua "temperatura di fusione (Tm)", nella quale i legami ad idrogeno, non più stabili, permettono la separazione tra i due singoli filamenti del DNA. La Taq DNA polimerasi ha solitamente una emivita di 30 min a 95 °C.

L'appaiamento degli inneschi oligonucleotidici (annealing) alle sequenze di DNA a singola elica ad essi complementari e localizzati alle estremità del frammento bersaglio (ad una temperatura in genere compresa tra i 50 ed i 70 °C). La temperatura che favorisce l'unione tra primer e DNA è detta Temperatura di annealing (Ta). La temperatura di annealing (Ta) dei primer dipende dal loro contenuto in G+C e dalla loro lunghezza.

Considerando primerdi lunghezza media di 20 basi una formula empirica spesso utilizzata per ilcalcolo della Tm è la seguente:

Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C.

Dove G, C, A e T indicano il numero di nucleotidi contenenti le basi azotateguanina, citosina, adenina o timina. Nel caso che i due primer abbiano Tmdiverse generalmente si considera quello con la Tm più bassa. Solitamente siutilizza come temperatura di annealing:

Ta= Tm – 5°C

Nella gran parte delle reazioni la Ta rimane costante per tutta la durata dellareazione e non si effettuano variazioni lungo i cicli. In alcuni casi si usa unastrategia detta touch-down, la quale prevede che la Ta diminuisce ciclo dopociclo. La strategia di reazione touch-down permette di rendere i primi cicli diPCR estremamente "stringenti", cioè tali da promuovere l'amplificazione solo diframmenti specifici rendendo instabili eventuali annealing dei primer asequenze di DNA non perfettamente complementari. Il

tempo di annealinginfine non deve essere troppo lungo (in modo da sfavorire appaiamenti a stampicon bassa complementarietà). Di solito si utilizzano tempi dell’ordine di 30 sec omeno.

3. L’estensione degli inneschi (elongation) mediante aggiunta di nucleotidi nelladirezione 5’-3’ ad opera della DNA polimerasi che porta alla sintesi di una nuovaelica complementare al DNA stampo (ad una temperatura compresa tra i 68 e i72 °C).

PROCEDIMENTO DI UNA PCR IN LABORATORIO:

In base al numero di esoni che si vuole analizzare si utilizza un determinato numero di coppie diprimer : per ogni esone occorrono due primer ( un reverse e un forward ).

Immaginiamo di avere a disposizione il DNA estratto dal sangue di una sola persona e di voleranalizzare solo un esone e, quindi, di utilizzare solo una coppia di primer.

Si procede quindi alla preparazione delle provette e della mix: si dispone una provetta in cuiandrà il DNA (2,0 microlitri) che si vuole analizzare con

La tecnica della PCR prevede l'utilizzo di diverse provette. Una provetta contiene il DNA (2,0 microlitri) che viene utilizzato come controllo negativo, mentre un'altra provetta non contiene DNA (detta bianco). In entrambe le provette viene inserita una determinata quantità di mix di fattori per l'amplificazione.

Prima di tutto, si prepara il mix dei fattori. Questo mix è composto da:

• 5 microlitri di Buffer (50x)
• 2.5 microlitri di magnesio
• 2 microlitri di basi
• 0.2 microlitri di primer forward
• 0.2 microlitri di primer reverse
• 0.25 microlitri di TAQ polimerasi

Un tampone di reazione (buffer) standard contiene:

• 10-50mM Tris-HCl pH 8.3
• fino a 50mM KCl
• 1.5mM o più di MgCl2 (Maggiore è la concentrazione di MgCl, minore è la specificità di legame dei primer, cioè si lega anche se non sono perfettamente complementari)
• 0.2 - 1µM di ciascun primer
• 200µM di ciascun deossiribonucleotide (dNTP)
• gelatina o BSA (siero albumina)

bovina) fino a 100µg/ml,in alcuni casi vengono aggiunti detergenti non ionici come Tween20, Nonidet P-40 o Triton X-100 (0.05-0.10% v/v).In questo caso, dato che abbiamo tre provette ( due con il DNA e un bianco ) moltiplichiamo ilnumero relativo alla concentrazione di ciascun fattore per tre. Volendo fare per eccesso, simoltiplica per quattro.Se avessimo dovuto analizzare il DNA di due persone mediante la PCR avremmo dovutodisporre una quarta provetta con il DNA e quindi moltiplicare la concentrazione di ciascunfattore della mix per quattro ( volendo fare per eccesso, per cinque).CALCOLI:Calcolo la concentrazione dei fattori della mix relativa a tre provette ( una con il DNA daanalizzare, una con il DNA che funge da controllo negativo, e una priva di DNA). Quindi procedoin questo modo:BUFFER : 5µl x 4(soluzione salina acquosa che mantiene stabile il pH) = 20 µl( considero quattro anche se le provette sono tre, perché voglio eccedere )MAGNESIO

(svolge un ruolo di cofattore per la DNA polimerasi e influenza) : 2.5 µl x 4 = 10 µl l'appaiamento del primer allo stampo

BASI (d NTP ) 2.0 µl x 4 = 8 µl

PRIMER : Forward 0.2 µl x 4 = 0.8 µl ; Reverse: 0.2 µl x 4 = 0.8 µl

TAQ polimerasi: 0.25 µl x 4 = 1.0 µl

Ora, quindi, conosciamo la concentrazione di ciascun fattore che dobbiamo inserire nella mix. Procediamo con il pipettaggio di ciascuno di essi e con il loro inserimento nella provetta. Mescoliamo tutti i fattori, e prima di inserire anche la TAQ polimerasi procediamo a disporre il DNA in ciascuna provetta. A questo punto, in questo caso preciso, avremo una provetta con 2.0 µl di DNA da analizzare, una con 2.0 µl di DNA che funge da controllo, una provetta in cui non c'è ancora niente, ed una provetta in cui abbiamo inserito tutti i fattori tranne la TAQ polimerasi. Per inserire la TAQ bisogna aspettare ancora : nella mix bisogna versare,

infatti, prima l'acqua.

CALCOLO DEL VOLUME DELL'ACQUA:
Sommare le concentrazioni dei fattori: 5 µl (buffer) + 2.5 µl (magnesio) + 2.0 µl (basi) + 0.2 µl (primer) + 0.2 µl (primer) + 0.25 µl (TAQ) + 2.0 µl (DNA) = 12.15µl.
50 µl - Questo valore andrà sottratto a 50 µl (volume finale che vogliamo raggiungere): 12.15µl = 37.85 µl.
Questo valore andrà moltiplicato per il numero di provette che inseriremo nel termociclatore: 37.85µl x 4 = in questo caso, quindi, si moltiplica per tre (o meglio, per quattro). Quindi 151.4 µl.
151.4 µl è la concentrazione di acqua che dobbiamo aggiungere nella mix (ovviamente il valore è riferito a questo caso).

Aggiunta l'acqua si può procedere con l'inserimento della TAQ polimerasi nella mix. La TAQ, nel frattempo, era conservata nel congelatore; ed è bene ricordare che essa non solidifica.perché in essa è disciolto il glicerolo, che essendo un alcool, tende a noncongelare. Inoltre quest’ enzima può essere aggiunto una sola volta e rimane attivoper 30 – 40 cicli. Inoltre bisogna fare attenzione al pipettaggio della TAQ polimerasi:una volta prelevata con la pipetta, inserire il puntale della stessa proprio all’ internodella mix per evitare che goccioline di TAQ restino adese alle pareti della provetta e,quindi, evitare che nella mix ci sia una minore concentrazione di enzima rispetto aquella desiderata.Ora possiamo inserire una determinata quantità di mix in ciascuna provetta. Dato che inognuna di essa vogliamo un volume di 50 µl, e dato che già abbiamo inserito in ciascunaprovetta ( tranne nel bianco) 2.0 µl di DNA, aggiungeremo 48 µl di mix.Terminata questa preparazione possiamo inserire le provette all’ interno del termociclatoredove si sussg