6. Diagnostica prima della pma (test dell'fsh del terzo giorno, spermiogramma, analisi cromatina spermatica, studio aneuploidie spermatiche, analisi qualita' ovociti, analisi dna ovocitario, valutazione funzionalita' mitocondriale)

Diagnostica prima della fecondazione assistita

Diagnostica ormonale

Prima di iniziare un percorso di fecondazione assistita è necessario fare una diagnostica ormonale. Questa può essere attuata sia al maschio che alla femmina: nel maschio, la diagnostica ormonale può indicare la eventuale presenza di ipogonadismo (ridotta capacità dei testicoli a produrre ormone; questo termine può essere usato anche in relazione alle ovaie) oppure, ad esempio, può mettere in evidenza che all'interno dei testicoli avviene una spermatogenesi alterata; nel caso della femmina, la diagnostica ormonale dà informazioni riguardo il numero di ovociti rimasti (queste informazioni sono importanti per sapere quanti tentativi si possono provare).

Riserva ovarica

Il numero di ovociti è indicato con il termine di riserva ovarica. Attualmente non si conosce alcun metodo per la determinazione diretta della riserva ovarica nelle donne; sono disponibili tuttavia misurazioni indirette di questa. L'ovaio può essere paragonato ad una "banca" di cellule uovo; ad ogni ciclo mestruale una cellula uovo è rilasciata dall'ovaio mediante il processo di ovulazione. Inoltre, un certo quantitativo di follicoli primordiali (ognuno con una cellula uovo, generalmente) viene perso mediante il processo di atresia.

Donne che vogliono intraprendere, quindi, un percorso di fecondazione assistita devono sottoporsi a un test che dà informazioni riguardo la riserva ovarica, soprattutto se si tratta di donne che hanno un'età pari a 35 anni o maggiore e che non sono riuscite a diventare gravide per oltre 6 mesi.

Test del FSH del terzo giorno

Il test principalmente utilizzato per la misura della riserva ovarica è il FSH del terzo giorno. Questo misura i livelli di FSH ematico e di estradiolo al terzo giorno del ciclo mestruale. La ragione per cui si sceglie questo giorno rispetto ad altri è perché, in media, i livelli di estrogeni in questo periodo sono i più bassi del mese. Se si riscontrano alti livelli di estrogeni al terzo giorno di mestruazione significa che si ha una buona riserva ovarica (dal momento che gli estrogeni stimolano la maturazione dei follicoli e, quindi, l’ovogenesi); se invece si riscontrano alti livelli di FSH significa che si ha una scarsa riserva ovarica (dal momento che l’FSH, tramite un meccanismo a feed-back negativo, riduce i livelli di estrogeni).

Prima di misurare i livelli di FSH si può somministrare il clomiphene citrato, il quale è un antagonista degli estrogeni. Se gli estrogeni bloccano la liberazione di FSH da parte dell’ipofisi, il clomiphene citrato, interagendo con gli stessi recettori con i quali interagiscono gli estrogeni, determina un aumento della sintesi e del rilascio di FSH. Nelle donne con normale riserva ovarica, l’aumento complessivo di estradiolo e di inibina dovrebbe essere in grado di vincere gli effetti del citrato di clomiphene sull’asse ipotalamico ipofisario e sopprimere i livelli di FSH entro il range normale. Questo tipo di test ha una maggiore sensibilità e un migliore valore predittivo rispetto al test che misura direttamente l’FSH in circolo.

Altre metodiche per la misura della riserva ovarica

• Misura dei livelli di inibina B
• Misura dei livelli di ormone anti-mulleriano (AMH)

L’ormone antimulleriano negli individui di sesso maschile ha la funzione di impedire la formazione di organi genitali femminili attraverso la regressione dei dotti di Müller. Nelle bambine, invece, la ridotta concentrazione dell’ormone dopo la nascita consente lo sviluppo del dotto di Müller dal quale si verranno a formare l’utero e le ovaie e in un secondo momento la sua presenza permette la sopravvivenza dei piccoli follicoli in via di sviluppo, inibisce l’eccessiva stimolazione follicolare da parte dell’FSH e funge da regolatore della produzione estrogenica follicolare. I valori dell’ormone antimulleriano consentono di accertare il numero di follicoli primordiali e, di conseguenza, permettono di effettuare una stima dell’età ovarica perché subiscono una riduzione contestualmente alla diminuzione dei follicoli.

Per accertare i valori dell’ormone antimulleriano è sufficiente un semplice esame del sangue in qualsiasi periodo del mese, perché questi non subiscono variazioni nel corso del ciclo mestruale. È possibile procedere all’analisi anche nel corso della gravidanza. Se alti valori di ormone antimulleriano possono fungere da indicatori della sindrome dell’ovaio policistico o, nei casi più gravi, segnalare l’eventuale presenza di un tumore ovarico, bassi valori dell’AMH possono essere l’indice di un’insufficienza ovarica primaria o, comunque, possono consentire di valutare una progressiva riduzione della fertilità.

Analisi del liquido seminale: spermiogramma

Oltre alle indagini ormonali, tra gli esami di primo livello dell’infertilità maschile riveste un ruolo fondamentale anche l’analisi del liquido seminale. Lo spermiogramma costituisce, inoltre, l’indagine di laboratorio di primo livello per definire la potenzialità fecondante del partner maschile di una coppia. Il campione va raccolto dopo 3-5 giorni in cui non si è avuta alcuna eiaculazione, ma può essere raccolto anche dopo 2 o 7 giorni in cui non si è avuta alcuna eiaculazione. Nel primo caso si ha una valutazione meno soggetta a variazioni casuali. Osservare un’astinenza controllata è importante perché eiaculazioni troppo frequenti o troppo distanziate possono alterare i parametri seminali.

Quindi questa indicazione è indispensabile per poter standardizzare la quantità e la qualità degli spermatozoi che vengono analizzati e per poterli confrontare sia con altri spermiogrammi precedenti o successivi del medesimo paziente, sia rispetto ai valori di riferimento. La raccolta del campione deve essere completa in quanto il liquido seminale si forma solo al termine dell’ultima spinta eiaculatoria quando si uniscono i tre secreti principali che compongono il plasma seminale e cioè prostatico, testicolare ed epididimario. La raccolta incompleta determina la perdita di una di queste frazioni e di conseguenza l’alterazione dei parametri seminali. Il tipo di contenitore per la raccolta è quello sterile per urine.

Il campione deve essere consegnato entro 30-60 minuti dalla raccolta, se raccolto in sede diversa dal laboratorio. Il contenitore, una volta consegnato, viene posto in termostato a temperatura controllata (compresa tra 35°C e 37°C) per almeno 15 minuti. Trascorso questo tempo, si trasferisce il campione, mediante una pipetta, in una provetta conica trasparente. Si miscela il liquido seminale delicatamente prima di passare alla fase analitica.

Valutazione macroscopica

Durante la valutazione macroscopica si valutano i seguenti parametri:

• Volume: volumi seminali troppo ridotti possono essere indicativi di ostruzioni delle vie seminali o di assenza congenita dei deferenti (come accade nel caso degli individui affetti da fibrosi cistica); al contrario, volumi seminali elevati possono essere indicativi di patologie flogistiche. Nel caso in cui ci sia proprio assenza di eiaculato si parla di aspermia; l’ipospermia indica una bassa quantità di sperma; l’iperspermia fa riferimento a una elevata quantità di sperma.
• pH: il pH del liquido seminale deriva dal bilanciamento delle secrezioni delle vescicole seminali alcaline e della secrezione prostatica acida. Questo parametro si valuta utilizzando una cartina al tornasole, cioè una carta impregnata di tornasole che è un colorante che vira al rosso in ambiente acido e al blu in ambiente basico. Se il pH è minore di 7 ed è associato a basso volume consente di indirizzare verso una diagnosi di alterazione della secrezione delle vescicole seminali o un’ostruzione bilaterale dei dotti eiaculatori e/o deferenti.
• Aspetto: si valuta ponendo la provetta di fronte a una fonte luminosa. L’aspetto fisiologico del seme è avorio opalescente. Può essere trasparente se la componente cellulare è molto scarsa (aspetto acquoso); rosato o rosso o rosso-bruno in caso di presenza di emazie; bianco-latte se costituito solo da secreto prostatico; bianco-giallastro in caso di piospermia (vuol dire che c’è un elevato numero di globuli bianchi e che, quindi, potrebbe essere in atto un’infezione); giallastro in presenza di pigmenti di origine ematica o batterica o in seguito ad assunzione di farmaci.
• Fluidificazione: il liquido seminale appena eiaculato subisce un rapido processo di coagulazione che lo fa rimanere adeso al fornice vaginale per un tempo sufficiente a consentire la migrazione degli spermatozoi nel muco cervicale. In un tempo variabile tra 10 e 60 minuti il processo di fluidificazione riporta il coagulo allo stato liquido. Se la fluidificazione è avvenuta nella sua completezza viene definita fisiologica; se permangono coaguli viene definita irregolare e questo è spesso indice di infiammazione. La fluidificazione si valuta facendo percolare il seme da una pipetta lungo le pareti della provetta e osservando il fluido in trasparenza contro una sorgente luminosa.
• Viscosità: si valuta facendo gocciolare il liquido seminale da una pipetta. Viene definita normale se le gocce si staccano una dopo l’altra in maniera ritmica e sequenziale. È considerata aumentata se le gocce sono sostituite da un unico filamento ed è indicativa di patologie flogistiche acute o croniche o di alterazioni congenite della secrezione delle ghiandole accessorie oppure diminuita se le gocce si staccano più rapidamente a causa di una scarsa componente cellulare. Una viscosità aumentata può rendere difficile la valutazione della concentrazione e della motilità nemaspermica (il termine “nemaspermica” fa riferimento al fatto che gli spermatozoi degli uomini sono anche detti nemaspermi e cioè dotati di flagello).

Valutazione microscopica

Per effettuare una valutazione microscopica bisogna innanzitutto, con l’ausilio di una micropipetta, prelevare un volume di liquido seminale pari a 10 µl e porlo su di un vetrino portaoggetti pulito, e ricoprire quest’ultimo con un vetrino coprioggetto di 22 x 22 mm. Il peso del coprioggetto distende il campione così da ottenere una ottima visione al microscopio, e particolare attenzione dovrà essere posta ad evitare la formazione e l’intrappolamento di bolle d’aria tra il vetrino portaoggetti ed il vetrino coprioggetto. Il preparato appena ottenuto viene lasciato stabilizzare per circa un minuto. Nella fase microscopica vengono valutate la componente cellulare gametica e non gametica e quella non cellulare. Per studiare la componente cellulare gametica è bene rilevare i seguenti parametri:

Numero di spermatozoi

Per la valutazione del numero di spermatozoi vengono utilizzate le camere di conta cellulare, quali la camera di Burker, la camera di Thoma, la camera di Neubauer, ecc. La camera appositamente ideata per la conta degli spermatozoi è la camera di Makler e offre il vantaggio di non dover ricorrere alla diluizione del campione. Infatti, 10 µl del campione in esame sono depositati sul vetrino portaoggetti della camera e coperti con uno speciale vetrino coprioggetti, sul quale vetrino viene posizionata la griglia di 2 conta, avente area pari a 1 mm². La griglia di conta è costituita da un quadrato grande formato da 100 quadratini di 0,1x0,1 mm ciascuno.

Camera di Makler

La conta cellulare, in questo caso, si effettua valutando 4 righe, ciascuna costituita da 10 quadratini. Si calcola la media del numero ottenuto e si moltiplica per 1 milione ottenendo la concentrazione di spermatozoi come milione per ml. Nel caso in cui si volesse effettuare la conta del numero degli spermatozoi con l’ausilio di altre camere si dovrà diluire il campione: si miscelano 50 µl di liquido seminale liquefatto con 950 µl di diluente. Quest’ultimo viene preparato con 50 g di NaHCO₃ (bicarbonato di sodio), 10 ml di formalina e si aggiunge una quantità di acqua distillata fino ad arrivare a un volume di 1000 ml. La camera di Burker consta di una lastra di vetro rettangolare, che presenta al centro un rilievo, delimitato da ambo i lati da due solchi o scanalature parallele ed un corto solco trasversale che divide questo rilievo centrale in due metà, ciascuna delle quali porta inciso un reticolo di conta. Ogni reticolo di conta prende il nome di cella, ciascuna delle quali è divisa in 9 quadranti, ognuno con 16 quadrati. All’interno di ogni quadrante si osservano, oltre i 16 quadrati, anche 9 quadrati più piccoli, e 24 rettangoli. Ogni quadrante è delimitato da tre righe parallele tra loro su tutti e quattro i lati; ogni quadrato nel quadrante è delimitato da due righe parallele tra loro.

Aletta che trattiene il vetrino coprioggetti

Per effettuare il conteggio degli spermatozoi con la camera di Burker, si preleva una piccola quantità del campione precedentemente diluito; si appoggia la punta della micropipetta contro il bordo del vetrino coprioggetti; si procede lasciando fuoriuscire una piccola concentrazione di campione nello spazio compreso tra camera e vetrino. Il campione si diffonderà per capillarità.

Si potrebbe procedere contando le cellule in un solo quadrante, ma è consigliabile contare le cellule in 4 quadranti e calcolare la media in modo da ridurre il margine di errore. In sintesi, per contare, ad esempio, le cellule con la camera di Burker bisogna considerare le due diagonali di ciascuna cella. Ogni diagonale è composta da 12 quadrati, per un totale di 48 quadrati (24 per ogni cella). Dopo aver contato le cellule, si divide il numero ottenuto per 48: si fa, cioè, una media.