6. Diagnostica prima della pma (test dell'fsh del terzo giorno, spermiogramma, analisi cromatina spermatica, studio aneuploidie spermatiche, analisi qualita' ovociti, analisi dna ovocitario, valutazione funzionalita' mitocondriale)

Conteggio degli spermatozoi con la camera di Burker

Per effettuare il conteggio degli spermatozoi con la camera di Burker, si preleva una piccola quantità del campione precedentemente diluito; si appoggia la punta della micropipetta contro il bordo del vetrino coprioggetti; si procede lasciando fuoriuscire una piccola concentrazione di campione nello spazio compreso tra camera e vetrino. Il campione si diffonderà per capillarità.

Si potrebbe procedere contando le cellule in un solo quadrante, ma è consigliabile contare le cellule in 4 quadranti e calcolare la media in modo da ridurre il margine di errore. In sintesi, per contare, ad esempio, le cellule con la camera di Burker bisogna considerare le due diagonali di ciascuna cella. Ogni diagonale è composta da 12 quadrati, per un totale di 48 quadrati (24 per ogni cella). Dopo aver contato le cellule, si divide il numero ottenuto per 48: si fa, cioè, una media. Questo numero viene moltiplicato per...

250 (microlitri), che è il volume di ogni quadratino; si moltiplica il risultato per 1000 (serve a convertire i microlitri in ml); il tutto viene moltiplicato per il fattore di diluizione. Quindi: NUMERO DI CELLULE IN 1mL: Si potrebbe procedere anche contando il numero di cellule all'interno di quattro quadranti. Per ogni quadrante escludere le cellule che si trovano a ridosso di duelati. Fare la media (dividere il numero di cellule per 4). Moltiplicare poi questo numero di cellule per 10. Se si usa la microscopia a contrasto di fase non è necessario l'uso del colorante. Con la microscopia ottica tradizionale i preparati citologici o istologici si possono osservare solo se opportunamente colorati. In questi casi, succede che quando la luce attraversa il campione colorato, il colore stesso determina una modifica dell'ampiezza (cioè della luminosità) e della lunghezza (il colore) d'onda del raggio di luce stesso. Nel caso del microscopio a

contrasto di fase: la differenza di fase (invisibile all'occhio) viene convertita in differenza di ampiezza (luminosità) visibile all'occhio. Quindi in questo caso, il raggio luminoso che colpisce il campione, lo attraversa e fuoriesce semplicemente sfalsato rispetto all'onda iniziale del raggio. La luce che raggiunge il preparato (le cellule) subisce quindi una deviazione, mentre la luce che attraversa il mezzo (lo spazio tra le cellule) non viene deviata. In questo tipo di microscopio, un anello è posto tra la sorgente luminosa (disposta in alto in questo caso) e il campione posto sul vetrino. Quest'anello proietta sul campione un cono di luce. I raggi che colpiscono il campione producono due tipologie di raggi uscenti dal campione: uno che non subisce alterazioni, che è generato quando la luce passa attraverso il mezzo e non colpisce le cellule; l'altro che risulterà deviato e sfalsato ed è quello che si genera quando la luce

colpisce e attraversa le cellule. Questo microscopio fa convergere, poi, i raggi deviati con i raggi non deviati, ottenendo un terzoraggio che presenta caratteristiche di ampiezza d'onda diversa rispetto alla luce incidente, e quindi potrà essere percepito dall'occhio umano.

Spesso, all'interno del liquido seminale potrebbero esserci altre cellule differenti dagli spermatozoi e, quindi, sarà necessario utilizzare delle colorazioni differenziali, cioè delle specifiche colorazioni che permettono di distinguere tra i vari tipi cellulari presenti nel liquido spermatico.

Se in seguito al conteggio degli spermatozoi si rileva la loro assenza, si parla di azoospermia. In questo caso è necessario centrifugare l'eiaculato e ricercare gli spermatozoi nel sedimento. Il termine di azoospermia indica assenza di spermatozoi nell'eiaculato e per definire un liquido seminale azoospermico è indispensabile eseguire l'analisi del sedimento dopo

Centrifugazione del campione seminale. La presenza rara di spermatozoi nel sedimento, osservata dopo centrifugazione, prende il nome di criptozoospermia. Se gli spermatozoi si presentano con un numero basso nell'eiaculato si parla di oligozoospermia.

Motilità nemaspermica: come in tutti i mammiferi, anche nell'uomo il movimento dello spermatozoo è di tipo flagellare e consiste in una serie di onde che si originano alla base del flagello e si propagano lungo quest'ultimo, per cui la testa viene spinta in avanti passivamente. La progressione dello spermatozoo nello spazio è in realtà dovuta alla somma di due tipi di movimento: uno oscillatorio e uno rotatorio intorno all'asse longitudinale che attraversa la cellula nella sua lunghezza. Una motilità ridotta o assente è una causa frequente di infertilità maschile. La motilità viene valutata in percentuale su un preparato a fresco utilizzando l'obiettivo a 20 o 40x.

a tempi fissi dall'eiaculazione (1 o 2h) solo a fluidificazione completata. Per rendere significativa la valutazione devono essere presi in esame non meno di 200 elementi nemaspermici; quindi, nei campioni a bassa concentrazione è necessario ripetere la valutazione su più preparati. È importante descrivere la motilità da un punto di vista qualitativo: bisogna osservare se lo spermatozoo si muove attivamente in modo lineare o non lineare indipendentemente dalla velocità; bisogna osservare se lo spermatozoo non è in grado di progredire nello spazio; bisogna osservare se lo spermatozoo rimane immobile. L'alterazione della motilità è correlata a quasi tutte le patologie andrologiche; non è pertanto un sintomo di una singola patologia. Solo nel caso di totale acinesi si può sospettare una patologia genetica legata all'alterazione della costituzione microtubulare del flagello. L'assenza totale di

motilità va sotto il nome di astenozoospermia. Per l'valutazione della motilità si devono utilizzare delle camere di osservazione che abbiano una profondità di 20 micrometri, in modo tale che lo spermatozoo sia libero di muoversi tranquillamente durante l'analisi. È molto importante, inoltre, mantenere la temperatura di lavoro a 37°C, in quanto si valuta un'attività fisiologica per cui bisogna ricreare al massimo le condizioni naturali in cui si trova lo spermatozoo. Per stabilire il grado di motilità degli spermatozoi si fa uso di tabelle di riferimento come quella riportata di seguito. La motilità può essere valutata anche con sistemi computerizzati denominati Computer Assisted Sperm Analysis (CASA System). Per l'esecuzione dell'analisi vengono posti 10 microlitri del campione seminale nella camera di Makler, preriscaldata; l'immagine microscopica viene trasferita, mediante la videocamera, al monitor per

essere controllata dall'operatore; dal monitor l'immagine viene inviata al software di elaborazione presente nel computer, il quale trasforma l'immagine reale in traccia elettronica.

IMMAGINE MICROSCOPICA VISTA SUL DISPLAY DEL COMPUTER TRAIETTORIA PERCORSA DA UNO SPERMATOZOORAPPRESENTATA SCHEMATICAMENTE

Il sistema è anche in grado di distinguere gli spermatozoi da altre cellule, detriti cellulari e aggregati presenti nel liquido seminale. Durante la fase di messa a punto del sistema viene fissato un limite di dimensioni per la cellula spermatica che consente di discriminare componenti cellulari e detriti presenti nel liquido seminale che abbiano dimensioni superiori o inferiori a tali limiti standard. Se nel campione in esame sono presenti, però, elementi cellulari non nemaspermici e detriti con dimensioni simili a quelle stabilite per la testa dello spermatozoo, tali elementi potrebbero essere considerati come spermatozoi e inseriti nella conta finale come spermatozoi immobili.

Per tale motivo è necessario avere ulteriori criteri per diminuire i possibili errori. Un secondo criterio di discriminazione è rappresentato dalla luminosità della testa dello spermatozoo. Il sistema di lettura computerizzato è integrato con il microscopio a contrasto di fase in modo da far apparire la testa dello spermatozoo luminosa, potendola così differenziare da altre strutture che non appaiono luminose e che, quindi, non verranno viste dal sistema. Il sistema è in grado di valutare la velocità curvilinea (VCL), la velocità media di percorso (VAP) e la velocità lineare (VSL). La VCL (micrometri/secondo) si ottiene dividendo la somma delle linee rette che congiungono le posizioni sequenziali della testa nema spermica lungo la traccia dello spermatozoo, per l'intervallo di tempo in cui la cellula è stata analizzata. La VAP rappresenta la velocità media calcolata lungo il percorso medio dello spermatozoo. La VSL.

Rappresenta la distanza inlinea retta tra il punto di partenza e il punto di arrivo della traccia esaminata. Dall'integrazione di questi tre valori possono essere ricavati i seguenti indici di progressione della cellula: linearità (LIN= VSL/VCLx100); rettilineità (STR=VSL/VAPx100); oscillazione (WOB= VAP/VCLx100). La valutazione del

3. Vitalità: è importante eseguire un test di vitalità che può essere di grande utilità clinica perché consente di distinguere spermatozoi immobili non vitali da quelli vitali, potenzialmente in grado di fecondare con una tecnica di riproduzione assistita. Uno dei test utilizzati per rilevare la percentuale di

TEST ALL'EOSINA

spermatozoi vitali è il TEST DI RIGONFIAMENTO, che utilizza un colorante vitale, l'eosina Y, che consente di distinguere le cellule vive dalle morte che appaiono specificamente colorate in rosa a causa del danno di membrana. Un altro test

vitalità spermatica è il parametro che valuta al microscopio ottico la percentuale di spermatozoi rigonfi dopo incubazione in soluzione ipotonica. Si basa sul presupposto teorico che gli spermatozoi con membrana plasmatica integra, incubati con una soluzione iposmotica, richiamano acqua nel proprio interno rigonfiandosi a livello della coda; gli spermatozoi non vitali, invece, lasciano passare acqua nelle due direzioni e quindi non si rigonfiano. Se tutti gli spermatozoi nell'eiaculato sono morti si parla di necrozoospermia.

4. Morfologia degli spermatozoi: un normale spermatozoo dovrebbe presentare una testa con forma ovale; una regione acrosomiale ben definita dovrebbe coprire il 40-70% della superficie della testa; non dovrebbe presentare difetti al collo, al centro o alla coda. Tra le anomalie più frequenti si annoverano le normalità che possono interessare le teste degli spermatozoi: ad