5. Ciclo replicativo virus RNA e DNA (Classi di Baltimore)

Replicazione dei virus ad RNA (III, IV, V classe)

Virus di classe IV (ssRNA+)

I virus della IV classe hanno un genoma che funge esso stesso da mRNA. Una volta che perdono il capside, è in grado di legare i ribosomi compiendo la traduzione. I virus della V classe invece trascrivono l'RNA + a partire da quello negativo, e quelli della III classe sfruttano il filamento negativo agendo poi come quelli della V classe.

A questa classe appartengono molte famiglie di virus tra cui i Picornaviridae (tra cui il virus della poliomielite) ed i Flaviviridae (tra cui il virus dell’epatite C), e la cui strategia replicativa è comparabile. Il Poliovirus ha un genoma abbastanza piccolo (7-9 kb) e perciò anche la particella virale è piccola (20-22 nm); il genoma, nell’estremità 5’, possiede legata una proteina di pochi aminoacidi che prende il nome di VPG e che ha due funzioni: serve da primer per la trascrizione e duplicazione del genoma, e per indirizzare i genomi nelle particelle virali.

Verso l’estremo 5’ sono raggruppati gli ORF codificanti per le proteine capsidiche, mentre verso il 3’ sono presenti gli ORF codificanti per gli enzimi utili al virus; il genoma funziona esso stesso come mRNA, quindi una volta scapsidato si lega ai ribosomi e viene tradotto. Tutto l’RNA virale viene tradotto in un’unica poliproteina che viene successivamente tagliata attraverso 3 tagli: dal primo taglio si formano 3 poliproteine più piccole chiamate P1, che comprende quelle che diventeranno le proteine capsidiche, P2 e P3, che daranno luogo alle proteine utili durante la replicazione; dal secondo taglio si formano invece altre poliproteine più piccole, e con il terzo taglio si formano le proteine definitive.

Tutti i tagli sono operati da due proteasi virus specifiche, 2A e 3C; inizialmente i primi tre tagli sono auto catalitici, e la poliproteina 3CD può essere tagliata in modi diversi dando luogo alla 3C (proteasi) ed alla 3D. Quest’ultima è la RNA polimerasi RNA dipendente, che non serve immediatamente al virus dopo l’ingresso nella cellula, ma viene sintetizzata con la prima traduzione; 3D procede alla trascrizione dell’RNA+ in RNA- formando degli intermedi replicativi ad dsRNA che hanno un’importanza notevole nei rapporti che si stabiliscono tra virus e cellula.

Durante la replicazione si formano delle specie di “grappoli” di RNA bicatenario perché sullo stampo di RNA+ si attaccano più copie della polimerasi. Gli RNA- serviranno come stampo per sintetizzare il nuovo genoma a polarità positiva; tutto ciò avviene all’interno di vescicole del reticolo dirette al Golgi, che il virus sfrutta per i suoi scopi. Questo serve affinché la RNA polimerasi non trascriva RNA cellulari, ma anche per proteggere gli stessi RNA virali che potrebbero essere facilmente degradati all’interno della cellula; altro vantaggio è il fatto che all’interno della vescicola si raggiungono alte concentrazioni di prodotti virali, proteine capsidiche e genomi, e questo è importante per avviare il loro assemblaggio.

I Picornavirus hanno anche la peculiarità che il genoma, pur funzionando come mRNA, non è provvisto di CAP, ma al suo posto è presente una sequenza detta IRES (Internal Ribosomal Entry Sequence) che rappresenta, rispetto al CAP, qualcosa di più efficiente: spiazza infatti gli mRNA cellulari già attaccati ai ribosomi, favorisce l’assemblaggio delle due subunità dei ribosomi ed evita che si faccia lo scanning iniziale permettendo un rapido avvio della traduzione. La VPG, oltre a funzionare come primer per la RNA polimerasi, svolge anche un’altra funzione, infatti, una volta che si formano i nuovi RNA+, una parte di essi viene legata alla VPG ed un’altra parte rimane libera, differenziandone il destino: quelli legati alla VPG vengono indirizzati all’incapsidamento, mentre quelli che ne sono privi vengono utilizzati come nuovi messaggeri per amplificare la sintesi proteica virale.

Virus di classe V (ssRNA-)

A questa classe appartengono i Paramyxoviridae (virus respiratorio sinciziale: prima causa di ricovero e mortalità infantile nei paesi occidentali, virus della parotite, del morbillo e degli orecchioni), il cui genoma è discretamente grande (15-20 kb), e che come primo evento subiscono la trascrizione del genoma, infatti possiedono una proteina all’interno del capside associata all’RNA, che permette l’immediata trascrizione appunto.

Sulla stessa molecola di RNA si attaccano più copie di RNA polimerasi formando anche in questo caso i “grappoli” di dsRNA, che sono di due tipi: RNA monocistronici (i veri e propri mRNA, dotati di CAP e di PoliA) ed RNA lunghi come l’intero genoma che devono essere immediatamente ricoperti da proteine capsidiche per non essere degradati (serve come stampo per la sintesi di una nuova molecola a polarità negativa).

Cosa fa sì che l’RNA polimerasi sintetizzi questi due tipi di genomi? Ci sono due teorie a riguardo: una prima teoria afferma che ogni ORF abbia il suo promotore e quindi la polimerasi può partire da vari punti, sebbene i promotori stessi abbiano una forza decrescente tale per cui l’RNA polimerasi, procedendo, riesce a forzare alcuni codoni di stop trascrivendo l’intera molecola, oppure si ferma ad ognuno di essi generando degli RNA monocistronici appunto; la seconda teoria sostiene invece che ci sia un unico promotore che lega una singola RNA polimerasi, la cui forza diminuisce all’allontanarsi della polimerasi stessa.

I virus infatti hanno la necessità di sintetizzare più proteine strutturali rispetto a quelle enzimatiche, in quanto queste ultime possono funzionare più di una volta: adottando l’una o l’altra teoria, verso l’estremo 3’ sono concentrati i geni per le proteine strutturali, ed essendo vicine all’unico promotore, o avendo i promotori con forze maggiori, si formano in maggiori quantità rispetto a quelle enzimatiche.

In questa classe si inserisce anche la famiglia Ortomyxoviridae (virus influenzali), che hanno una serie di peculiarità: il genoma è segmentato (7-8 segmenti a seconda del tipo), si replicano nel nucleo e non nel citoplasma, perché la polimerasi non ha la capacità di sintetizzare il CAP, e nel nucleo staccano il CAP dagli mRNA cellulari. La polimerasi di questi virus è formata da tre subunità: PA, PB1 e PB2; dagli mRNA cellulari neo trascritti viene tagliato il CAP ad opera della polimerasi, che contemporaneamente trascrive il genoma, e che viene poi attaccato agli RNA+ del virus.

Come avviene questo processo? La porzione PB1 si lega all’RNA- virale e compie la trascrizione sintetizzando l’RNA+, PB2 ha invece il compito di legare gli mRNA cellulari mantenendoli ancorati al complesso polimerasico, mentre il ruolo di PBA non è del tutto chiaro. Una volta che l’mRNA cellulare è legato da PB2, PB1 compie il taglio del CAP attaccandolo al genoma virale, e si formano degli mRNA+ dotati di CAP che, uscendo nel citoplasma, vengono tradotti in proteine, una parte delle quali torna nel nucleo, mentre quelle di matrice rimangono nel citoplasma e quelle dell’envelope vengono portate sulla membrana citoplasmatica.

Nel nucleo tornano le nuove copie di RNA polimerasi RNA dipendente e la proteina nucleocapsidica che si dovrà avvolgere alle nuove molecole genomiche. Una parte degli RNA+ sintetizzati dalla polimerasi non viene attaccata al CAP, ma rimane libera nel nucleo, dove serve da stampo per la sintesi di nuove molecole di RNA-. L’ingresso dei vari segmenti non è regolato, ed infatti nell’envelope possono essere inglobati un numero di segmenti proporzionali alle dimensioni della particella virale: se ne entrassero solo 8 la probabilità che una particella virale possieda tutti i segmenti diversi e diventi infettante sarebbe molto bassa, perciò nella particella virale possono entrare fino a 12-14 segmenti, aumentando la probabilità di generare particelle infettanti; per i virus influenzali non vale il meccanismo dell’interferenza (tale per cui una cellula infettata da un virus non può essere super infettata da un altro virus della stessa specie o di specie diverse), infatti è probabile che due o più particelle virali entrino nella stessa cellula, permettendo il riassortimento genico ed il fenomeno della complementazione (nessuna delle due particelle ha tutti e gli 8 segmenti, ma una volta nel nucleo possono complementarsi e fornire l’uno all’altro i segmenti mancanti).

Virus di classe III (dsRNA segmentato)

È una classe che comprende la famiglia Reoviridae, che ha un unico genere patogeno per l’uomo (Rotavirus, virus causativi di diarree infantili); sono dotati di doppio capside ed un genoma dsRNA segmentato (10-12 segmenti) delle dimensioni di circa 30 kb. Si comportano in realtà come i virus della V classe, perché una volta entrati nella cellula trascrivono il filamento a polarità positiva; possiedono nel capside la RNA polimerasi RNA dipendente.

All’interno della vescicola dell’endosoma viene degradato il capside esterno, mentre quello interno viene parzialmente degradato solo dopo l’arrivo dei lisosomi, e si formano le particelle infettanti subvirali, all’interno delle quali avviene anche la prima trascrizione: i filamenti a polarità negativa vengono trascritti per formare gli mRNA, dotati di CAP ma non di PoliA, che vengono trascritti in quantità diverse, infatti prevale inizialmente la trascrizione dei geni enzimatici (NS). A questo punto gli RNA a polarità positiva sintetizzati grazie alla trascrizione primaria si associano a tre proteine non strutturali formando una specie di procapside all’interno del quale la RNA polimerasi duplica il filamento positivo riformando il segmento a polarità negativa e ricreando il dsRNA.

Si ha poi una seconda fase trascrizionale, determinata dal fatto che le proteine non strutturali prodotte all’inizio modificano i ribosomi cellulari rendendoli in grado di legare solo RNA privo di CAP, bloccando quindi la sintesi proteica cellulare: l’RNA polimerasi sintetizza dal dsRNA neo sintetizzato una serie di filamenti a polarità positiva che funzionano come mRNA ma sono privi di CAP, cosicché possano essere tradotti dai ribosomi modificati, dando origine alle proteine strutturali della particella virale. Sono gli unici virus ad RNA ad avere due ondate trascrizionali, con un comportamento simile ai virus a DNA.

Replicazione dei virus a DNA (I, II classe)

Virus di classe I e II

I virus a DNA si comportano molto più similmente a ciò che fa la cellula, tant’è che tutti, eccetto i Poxvirus, sfruttano la DNA polimerasi 2 della cellula; hanno sempre due ondate trascrizionali eccetto quelli della II classe: su stampo del DNA parentale virale vengono prodotti gli mRNA definiti “precoci” a formare poi le proteine enzimatiche precoci che servono al virus per la duplicazione ed hanno anche una capacità autoregolatoria in quanto all’aumentare del loro numero segue una diminuzione della trascrizione precoce per lasciare spazio inizialmente alla duplicazione del DNA, e successivamente alla trascrizione “tardiva” a partire dalle nuove copie di genoma, che prevede la trascrizione dei geni codificanti per proteine strutturali che servono al virus per la formazione di nuove particelle virali.

Questo è un sistema regolatorio molto efficiente, infatti mentre le proteine precoci vengono trascritte da un’unica copia di DNA, quelle tardive vengono prodotte dalle numerose copie di DNA della progenie.

Virus di classe II (ssDNA)

A questa classe appartengono i Parvovirus, una classe di virus che fanno eccezione allo schema generale di replicazione dei virus a DNA, in quanto sono virus molto piccoli (18-20 nm di diametro) che come genoma (4-6 kb) hanno un DNA a singolo filamento, che può essere a polarità positiva o negativa, perché per duplicare un genoma di questo tipo si formeranno delle copie complementari, quindi si ha un intermedio replicativo di dsDNA.

Sono dei virus il cui materiale genetico è molto ridotto, ed un genere di Parvovirus è defettivo (Parvovirus adenoassociati), ed infatti questi virus sono incapaci di replicazione autonoma, ma necessitano di un Adenovirus o di un Herpesvirus come helper.

Appartengono al genere Dependovirus perché dipendono appunto da un altro virus per la loro replicazione; non sono virus patogeni per l’uomo e sono molto importanti per la costruzione di vettori virali, possedendo il vantaggio che il loro DNA si integra (evento molto raro nei virus umani). I vettori che si formano a partire dai Parvovirus adenoassociati sono in grado di integrarsi nel genoma dando un’espressione genica continuata nel tempo.