5. Ciclo replicativo virus RNA e DNA (Classi di Baltimore)

S).

Queste sequenze possono funzionare come trasposoni ed assemblare le

varie unità secondo quattro strutture isomeriche diverse. Le TR servono

per la circolarizzazione del genoma durante la duplicazione: nel capside il genoma è dsDNA

lineare, ma all’interno della cellula appunto circolarizza; aumentando la complessità e le

dimensioni della particella virale, questi virus hanno 3 ondate trascrizionali, ed infatti si parla di:

- Geni α o proteine PRECOCISSIME (IE = Immediate Early)

- Geni β o proteine PRECOCI (E)

- Geni γ o proteine TARDIVE (L)

Il sistema è finemente regolato. Gli Adenovirus, entrando nella cellula, necessitano di fattori

cellulari per attivare gli enhancer di E1A, mentre gli Herpesvirus non necessitano nemmeno di

questo, ed infatti hanno una replicazione nucleare; tra le proteine del tegumento, una, la VP16,

detta anche αTIF (fattore della trascrizione α) promuove la trascrizione dei 5 geni α appunto,

responsabili di diverse funzioni tra cui quella di interagire con fattori trascrizionali cellulari e

promuovere la trascrizione dei geni virali con il solito meccanismo: all’inizio, essendoci basse

concentrazioni di geni α attuano un meccanismo a feedback positivo aumentando la propria

trascrizione, mentre quando raggiungono una concentrazione sufficiente prevale l’attività di

feedback negativo. Le proteine α sono responsabili anche del tropismo del virus ed hanno attività

neurotossica; i vettori viali costruiti a partire da HSV1 hanno i geni α deleti. Le proteine α sono

inoltre importanti nel processamento degli antigeni, per ridurre l’esposizione degli antigeni virali da

parte delle cellule infettate; uno dei prodotti α è indispensabile per la replicazione virale. Le

proteine α regolano positivamente la sintesi dei geni β, i quali sono proteine coinvolte nella

replicazione del DNA virale e sono molte di più rispetto a quelle degli Adenovirus, che necessita

l’induzione della fase S della cellula per sfruttare una serie di enzimi, che sono invece codificati dai

geni β di HSV, tra cui la DNA polimerasi, la timidina chinasi (importante per la manipolazione del

genoma e perché è un bersaglio per il trattamento farmacologico), elicasi, ribonucleotide riduttasi,

etc, tutti enzimi che consentono ai virus di replicarsi anche in cellule quiescenti (come anche i

neuroni appunto). Tra le proteine precoci ci sono anche quelle che intervengono nelle fasi più

tardive del ciclo replicativo, ovvero le proteine di scaffold che servono per la costruzione del

capside. La replicazione del DNA avviene mediante un meccanismo definito “ROLLING CIRCLE”,

in quanto un enzima virale determina il taglio di uno dei due filamenti permettendo alla DNA

polimerasi virale di girare attorno al filamento non tagliato, garantendo la sintesi del filamento ad

esso complementare. Così facendo si allunga il primo filamento, e contemporaneamente l’altro si

stacca, linearizzando (srotolandosi dallo stampo circolare), e viene sfruttato per formare i

frammenti di Okazaki. Via via che il filamento si stacca e la polimerasi continua a girare, il secondo

filamento si allunga sempre di più formando un concatamero che viene poi tagliato da una DNAsi

virale. A questo punto, sullo stampo dei nuovi genomi, inizia la trascrizione dei geni γ, promossa

dai geni β ed α; a loro volta, i geni γ inibiscono la trascrizione degli altri in quanto non servono più.

Le proteine di envelope e matrice non glicosilate tornano nel nucleo, mentre quelle glicosilate

diventeranno proteine dell’envelope, e questa enorme varietà permette al virus di avere numerosi

antirecettori diversi e di avere un ampio tropismo.

Quello descritto finora prende il nome di CICLO LITICO, che è un ciclo produttivo in quanto

determina la produzione di una progenie virale che si libera ed infetta altre cellule permissive; si

distinguono cellule permissive e sensibili: le cellule sensibili sono quelle che possiedono i recettori

per un dato virus, ai quali questo si lega, entra nelle cellule, ma non è detto che in esse si replichi

(una cellula sensibile non è sempre permissiva), mentre le cellule permissive sono quelle in cui il

virus si può replicare e produrre progenie. Quando il virus entra in una cellula ma non riesce a

portare a termine il suo ciclo replicativo si parla di INFEZIONE ABORTIVA, un ciclo non produttivo

in cellule non permissive, nelle quali non si forma né progenie né genoma virale, perché il virus

non trova nella cellula gli enzimi necessari; l’infezione abortiva può anche causare danni alla

cellula, perché i componenti virali possono avere un’azione tossica per la stessa, oppure le

proteine cellulari, a contatto con il virus, determinano una risposta immunitaria.

Gli Herpesvirus presentano inoltre il fenomeno della LATENZA, un ciclo non produttivo in cellule

permissive, che si verifica con tutti i virus a DNA e, tra quelli a RNA, solo nei Retrovirus; per

latenza si intende che il virus infetta l’ospite, il sistema immunitario riesce a controllare l’infezione e

contenerla, ed il virus smette di replicarsi ma, a differenza di quanto avviene con i virus ad RNA,

dove la risposta immunitaria porta a completa eradicazione del virus dall’ospite, con i virus a DNA

questo non succede in quanto durante il ciclo litico una certa quantità di virus raggiunge le cellule

della latenza, diverse da quelle in cui si replica, dove stabilisce un rapporto di latenza, ovvero non

si replica e non forma la progenie virale o il DNA. In alcuni casi il virus è completamente silente,

mentre altre volte (Herpes Simplex) si ha la trascrizione di alcuni RNA che non vengono però

tradotti, ed altre volte ancora si formano degli mRNA che vengono poi tradotti a formare le proteine

della latenza, le quali non portano però alla duplicazione del genoma. La latenza è una fase in cui

il virus è completamente o parzialmente silente, ma è presente nelle cellule, ed infatti possiamo

documentarlo con la PCR, e sotto determinati stimoli il DNA può riattivarsi dando un ciclo litico e

determinando le infezioni ricorrenti, che possono essere sintomatiche o, nella maggior parte dei

casi, asintomatiche. Terminata la riattivazione, il virus ritorna in latenza, ed infatti il rapporto di

latenza dura per tutta la vita. Quali sono i meccanismi che determinano una riattivazione del virus

dalla latenza? Il principale è sicuramente un calo delle difese immunitarie, che può voler dire sia

immunosoppressione, ed in questo caso i virus si comportano come opportunisti, mentre negli

immunodepressi causano malattie molto gravi e spesso mortali (HSV1 è la causa più frequente di

encefalite sia negli immunocompetenti che negli immunodepressi), ma anche essere associata a

stress psicofisico, situazioni ormonali, esposizione ai raggi UV, traumi meccanici (rari nell’uomo),

gravidanza (la riattivazione di HSV2 -herpes genitale- durante la gravidanza può infettare il

neonato al momento del parto ed essere anche fatale). Alcuni virus si riattivano più facilmente di

altri, ad esempio l’herpes labiale, mentre il virus della varicella Zoster, nei bambini dà questa

malattia esantematica, mentre nell’adulto dà Zoster o “fuoco di Sant’Antonio”, che però è piuttosto

raro. 24 h dopo l’infezione nelle cellule epiteliali periferiche, il virus risale le terminazioni nervose

sensitive della faccia e si localizza in latenza nei neuroni del ganglio del trigemino, da cui si può

riattivare andando in senso inverso e causando infezioni labiali o gengivali.

Cosa succede quando il virus raggiunge i gangli? Si possono verificare due fenomeni che si

escludono reciprocamente: se vengono espresse le 4 proteine α si attiva la cascata replicativa e si

formeranno le proteine β e γ, mentre se vengono trascritte le tre regioni LAT (trascritti associati alla

latenza), che si trovano nella stessa regione della proteina α0 ma vengono trascritte in senso

opposto, non parte il ciclo litico ed il virus stabilisce la latenza, sebbene la funzione di questi

trascritti, che possiedono due promotori (LAP1 e 2), non sia implicata nel mantenimento della

latenza (virus deleti per questi geni instaurano comunque la latenza), ma sono sicuramente

coinvolti nella riattivazione dalla latenza; mutanti per LAT non sono in grado di riattivarsi dalla

latenza. I LAT sono geni importanti per la costruzione dei vettori perché essendo espressi in fase

di latenza, si possono costruire dei vettori per l’espressione del transgene anche nei neuroni, in

quanto raggiungono queste cellule con estrema facilità. Che vantaggio ha mettere un transgene al

posto di LAT? I primotori funzionano durante la latenza e questo fa sì che il virus non si replichi ma

esprima comunque il gene d’interesse senza riattivarsi.

I Poxvirus sono dotati di un genoma molto grosso, con simmetria complessa e dimensioni elevate;

la simmetria complessa è data da una membrana lipidica con sopra fibrille, due corpi proteici

laterali che schiacciano il core, la membrana a palizzata lipidica ed il DNA a doppio filamento (250

geni, molti dei quali non essenziali per la replicazione, quindi anche questi possono essere usati

per la costruzione di vettori).

All’interno della cellula si formano due tipi di particelle virali, IMV (Intracellular Mature Virus) ed

EEV (Extracellular Enveloped Virus), che hanno funzioni diverse e si distinguono per il fatto che

EEV ha un’ulteriore membrana fosfolipidica all’esterno. L’enorme quantità di geni codificati dal

virus dà luogo a numerose proteine dei rivestimenti e proteine enzimatiche, ed inoltre non ci sono

sequenze introniche e non avvengono fenomeni di splicing. Anche nei Poxvirus si hanno tre

ondate trascrizionali:

- Trascrizione precoce

- Trascrizione intermedia

- Trascrizione tardiva

È una famiglia che comprende numerose sottofamiglie e generi, tra cui i Cordopoxvirinae, che

comprende gli Ortopoxvirus che infettano anche l’uomo (Variola e Vaccinia) e gli Avipoxvirus che

infettano gli uccelli; il Variola è l’agente eziologico del vaiolo, ed infetta solo l’uomo, mentre il virus

del mollusco contagioso causa una malattia esantematica piuttosto rara, ed il Vaccinia è il virus

che veniva utilizzato epr i primi vaccini, ma la cui origine (sicuramente animale) si è persa nel

tempo, sebbene si pensava derivasse dal Cowpox. Il Variola era causa del VAIOLO, una pandemia

che ha condizionato fortemente l’andamento della storia: gli Spagnoli sconfissero gli Inca

spargendo il vaiolo (a Cuba ci sono solo persone nere perché i nativi sono stati sterminati dagli

spagnoli); alcuni stipiti particolari avevano una mortalità del 70%. È un virus estremamente

resistente nell’ambiente, che pu&