Valori di riferimento e livelli decisionali

VALORI DI RIFERIMENTO E LIVELLI DECISIONALI

Confronto del risultato con un intervallo di riferimento (LR) con un minimo e un massimo.

Confronto del risultato nel soggetto vs distribuzione dei valori in una popolazione apparentemente

sana. “valori normali” sostituito da “valori di riferimento”. Riferimento a:

livello di salute dichiarato/confermato da altri dati nella popolazione indagata

 fattori che caratterizzano la popolazione di riferimento

 fattori pre-analitici (raccolta, preparazione, conservazione materiale biologico)

 prestazioni analitiche dello strumento (imprecisione, inesattezza)

 metodi statistici per analisi e trattamento dati



Individui di riferimento costituiscono una popolazione di riferimento dalla quale è estratto un gruppo di

campioni di riferimento sui quali vengono determinati i valori di riferimento che si distribuiscono in una

distribuzione di riferimento dalla quale vengono calcolati i limiti di riferimento che definiscono l’

intervallo di riferimento.

Produzione dei valori di riferimento: raccomandazioni:

1. Selezione accurata della popolazione (Caratterizzazione della popolazione, Fonti di variabilità delle

concentrazioni dell’analita: Età, sesso, alimentazione, fattori genetici, Definizione criteri

inclusione/esclusione, Definizione delle condizioni fisiologiche (stato di buona salute).

2. Protocollo accurato di raccolta/conservazione campione: Preparazione soggetto/condizione di

prelievo (orto-clinostatismo), Tipo/conservazione campione (-80 °C).

3. Descrizione del metodo di dosaggio (valutazione possibili interferenze).

4. Metodologia statistica: distribuzione dei valori→ scelta del modello.

La Lineaguida Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP28-A3c raccomanda un approccio

basato sul questionario per la determinazione degli intervalli di riferimento arruolando almeno 120

individui ed utilizzando dei metodi statistici non parametrici se la distribuzione dei dati non è

gaussiana. Protocollo sperimentale:

1. Investigare le interferenze analitiche e le fonti di variabilità pre-analitiche (se l’analita è nuova e

la letteratura non è di aiuto, è necessario verificare sperimentalmente le potenziali fonti di

variabilità).

2. Stabilire i criteri di inclusione/esclusione

3. Preparare un questionario per escludere/includere i soggetti. Rispetto privacy

4. Preparare un consenso informato richiesto dal comitato etico che il soggetto firma per dare il

consenso all’uso del campione biologico.

Possibili criteri di esclusione: alcool, fumo, pressione arteriosa, obesità, gravidanza, farmaci… Possibili

criteri di suddivisione in gruppi: età, gruppo sanguigno, genere, dieta, fumo, etnia. Quello che è un

criterio di esclusione in uno studio potrebbe essere un criterio di suddivisione in gruppi in un altro

studio. Il questionario è un ottimo strumento per verificare la presenza o meno dei criteri di esclusione

o di raggruppamento; semplice, non intimidatorio. Domande a cui si risponde con “no” o “si” . E’

possibile affiancare al questionario anche semplici misurazioni (pressione del sangue, peso, altezza,

esami del sangue). Il questionario: Trattare le informazioni fornite dal soggetto in maniera

confidenziale, I questionari anonimi per cui il soggetto si riconosce con un semplice identificativo, Il

consenso informato.

5. Suddividere i soggetti in base alle informazioni del questionario e delle misurazioni.

Esclusione a priori: i soggetti vengono esclusi prima della raccolta dei campioni. Richiede dei

 criteri di esclusione e di raggruppamento ben definiti, questionario, valutazione dei soggetti

prima della raccolta dei campioni. Solitamente si usa se l’analita è conosciuto e ci sono chiari

valori di riferimento.

Esclusione a posteriori: i soggetti vengono esclusi dopo la raccolta dei campioni. Il processo di

 esclusione e di raggruppamento avviene dopo la raccolta dei campioni, può essere appropriato

per analiti nuovi (poche informazioni in letteratura), questionario più dettagliato.

Tecnica di campionamento diretta: Fortemente raccomandato dalla lineaguida CLSI,

 Arruolamento di una popolazione di riferimento per poi valutare gli intervalli di riferimento

Tecnica di campionamento indiretta: Utilizzo di metodi statistici applicati ai valori di un database.

 Da utilizzare solo se non è possibile arruolare soggetti. Basata sull’assunzione, confermata

dall’osservazione, che la maggior parte dei risultati dei pazienti sono dentro l’intervallo di

riferimento. Molti metodi sono utilizzati per escludere i valori di individui non sani. Meglio

includere i valori di particolari pazienti (donatori, piccoli interventi chirurgici, screening). Es:

neonati.

6. Estrarre il gruppo di riferimento da una popolazione di riferimento

Principio: “Tutti gli individui della popolazione Pi devono avere la stessa probabilità di essere

selezionati.” Selezione ‘a priori’ casuale (ideale): Criteri Inclusione/Esclusione punto di applicazione: Pi;

Da Pi estrarre casualmente Gi. Nella pratica spesso selezione ‘a priori’ a “ridotta” casualità; Criteri

Inclusione/Esclusione punto di applicazione: Gi.

La produzione dei valori di riferimento deve avvenire nelle stesse condizioni di produzione dei risultati

clinici. Standardizzazione fase pre-analitica: Preparazione, modalità, tempo effettuazione

prelievo/raccolta materiale. Controllo variabilità analitica: Inesattezza/imprecisione (CQI),

Inaccuratezza (VEQ). Identificazione dei possibili interferenti sulla misura (esclusione dei campioni):

Emolisi, lipemia, ittero, farmaci. Se le valutazione sono multicentriche (da più sedi): Confrontabilità dei

dati (armonizzazione dei metodi).

Fattori preanalitici:

Il metodo impiegato deve essere descritto nel dettaglio: imprecisione, linearità, esattezza, LoD,

strumentazione, interferenze, reagenti, calibrazione. Il controllo di qualità analitico: Componente I:

Verifica dell’allineamento; Componente II: Verifica dell’imprecisione.

Simulazione: la popolazione di riferimento per marcatori di neoplasia ovarica. CA125:↑ aspecifico in

gravidanza, TBC, cirrosi, pat. infiammatorie pelvi, malattie benigne ginecologiche e non; K endometrio,

pancreas, polmone, mammella, colon- retto, gastro-intestinale.

Popolazione di riferimento: Razza (caucasica o miscellanea…), Indicazione sullo stato ormonale:

 pre/post-menopausa, Condizioni stabili (es: regolarità mestruo in pre-M).

Esclusione: Assunzione di farmaci (inclusi contraccettivi orali), Alcol, fumo, Pregressa malattia

 ginecologica, Irregolarità ciclo.

Campionamento: In pre-M al 12-14 g del ciclo (fase ovulatoria), Prelievo 09.00-09.30 a digiuno, in

 provetta senza gel/anticoagulante, Aliquote siero a -80 °C, Dosaggio di tutti i campioni nella

stessa seduta analitica.

7. Identificare gli outlier (dati aberranti da eliminare)

Cause possibili: Errori grossolani, Errori analtici, Inclusione di soggetti patologici, Mistura di

distribuzioni (adulti e bambini). Effetti: Gli outlier incidono sulla distribuzione dei dati. Management:

Devono essere identificarli prima di calcolare gli intervalli di riferimento, Se sono errori devono essere

eliminati e/o sistemati. Altrimenti valutare attentamente. Identification: Tuckey test.

8. Verificare la distribuzione dei dati Gaussiana. Incrementando il numero di valori

incremento la potenza statistica. Distribuzione ’’teorica’’ a cui poter fare riferimento per descrivere la

variabile casuale. media= µ ; deviazione standard=

σ. Caratteristiche essenziali: è

simmetrica; media, mediana e

moda coincidono; il 68% dei

valori è compreso tra µ − σ e µ +

σ; il 95% dei valori è compreso

tra µ − 1.96σ e µ + 1.96σ; il

99.7% dei valori è compreso tra µ

Per valutare la gaussianità: La verifica visuale della distribuzione dei dati è auspicabile. Differenti test

statistici (es. Shapiro Wilk test per valutare se la distribuzione è normale o meno). Il grafico normale

riporta:

In x i quantili della variabile (standardizzata), che si otterrebbero con una distribuzione

 Gaussiana con µ = xm e σ = s (con xm, s= del campione utilizzato)

In y i quantili della variabile (standardizzata) ottenuti dalla distribuzione del campione

 Perfetta concordanza: punti sulla bisettrice



9. Stimare gli intervalli di riferimento

Intervallo di riferimento: Delimitato tra due numeri (limite inferiore e limite superiore). Comprende il

95% dei valori della popolazione di riferimento arruolata: µ − 1.96σ e µ + 1.96σ (approccio

parametrico); 2.5 e 97.5 percentile di una distribuzione (approccio non parametrico).

Metodo statistico parametrico: fa

riferimento principalmente alla

distribuzione Gaussiana.

La trasformazione dei valori: Molti valori di riferimento di molti analiti non seguono la distribuzione

gaussiana. In questi casi per poter utilizzare il metodo parametrico bisogna eseguire una

trasformazione dei dati. (ad esempio, trasformazione logaritmica i cui dati poi devono essere

ritrasformati per essere corretti ). Successivamente è necessario verificare se i valori di riferimento

trasformati sono conformi a una distribuzione gaussiana. Questo approccio implica una teoria statistica

Trasformazioni di scala della

variabile possono riportare la

distribuzione a una forma

adeguatamente descritta da una

Gaussiana.

moderatamente complessa.

Quando la distribuzione non è gaussiana: es: Distribuzione della bilirubinemia totale (µmol/L). Notare

asimmetria (“skewness”) negativa che è implausibile; Distribuzione della bilirubinemia totale (µmol/L)

dopo trasformazione logaritmica*. Notare l’approssimazione Gaussiana. *Trasformazione: log10(x).

Se applichiamo la statistica gaussiana senza trasformare la variabile: Distribuzione bilirubinemia totale.

Assumiamo una distribuzione Gaussiana con media: µx = 6.94 µmol/L e DS (σx) = 3.86 µmol/L: limite

inferiore = -0.63 µmol/L. (!!!ATTENZIONE: valori negativi non sono plausibili). Limite superiore = 14.51

µmol/L. In precedenza, la stima corretta aveva identificato: 2.5° perc = 3 µmol/L e 97.5° percentile =

20 µmol/L. Conclusione: La statistica Gaussiana non è accettabile per elaborare la distribuzione dei

valori di riferimento della bilirubinemia totale.

Metodo statistico non parametrico: Il più semplice è basato sui ranghi. Ordinare i valori in senso

crescente. Identificare il 2,5% e il 97,5% percentile della distribuzione. Tra i due percentili è compreso il

95% delle osservazioni. Il percentile fa riferimento al limite superiore e inferiore delimitato: il 2,5% è la