Unità 3 semestre filtro medicina

BIOLOGIA: unità didattica 3

IL FLUSSO DELL’INFORMAZIONE GENETICA

Il dna trasmette l’informazione attraverso la replicazione che viene espressa sotto forma di RNA. Nei procarioti

ciò avviene nel nucleoide (dove si trova il cromosoma batterico), negli eucarioti avviene nel nucleo della cellula. Il

mRNA replicato deve subire delle modificazioni prima di farla uscire dal nucleo, fuori nel citoplasma il mrna viene

riconosciuto dai ribosomi ed è lì che avviene la produzione di proteine.

Replicazione del DNA

Il DNA è una doppia elica costituita da due filamenti che sono antiparalleli ciò significa che si associano in

direzione opposta cioè uno inizia con il 3’ e l’altra con il 5’. I due filamenti sono uniti da legami idrogeno che

avvengono tra le basi azotate che si associano secondo la legge di complementarietà delle basi, conoscendo la

successioni delle basi azotate su un filamento, la cellula può ricreare il suo filamento complementare.

La replicazione potrebbe avvenire in modo semiconservativo cioè la doppia elica parentale si apre e i due

filamenti fanno da stampo a due filamenti di nuova sintesi. Le due doppie eliche che si formano saranno formate

da un filamento di vecchio stampo e uno di nuova sintesi. La replicazione potrebbe essere conservativa in cui la

doppia elica si apre e si viene a creare una doppia elica di nuova sintesi mentre la elica parentale viene

trasmessa. La terza ipotesi è la replicazione dispersiva dove si creano due doppie eliche in cui i due filamenti

sono formati entrambi da dna antico e dna parentale. Per vedere quale di queste ipotesi è corretta faccio degli

esperimenti.

E' quello che hanno fatto Meselson e Stahl, hanno fatto

crescere i batteri su un terreno di coltura che aveva qualcosa di

particolare cioè era costituito da una molecola cioè azoto

pesante, un isotopo non radioattivo. Gli scienziati hanno fatto

crescere questi batteri per molto tempo e tutto il dna dei batteri

era costituito da azoto pesante. Questi scienziati hanno

centrifugato il dna in un gradiente di cesio che serve per

differenziare molecole che pesano in maniera diversa (quelle

più pesanti vanno sul fondo, quelle più leggere vanno sopra).

Quindi hanno estratto il dna e hanno guardato dove si localizzava nella provetta, hanno visto che si localizzava

nella parte bassa (dna pesante). Hanno preso poi altri batteri e li hanno messi in un terreno di azoto leggero e

hanno fatto crescere i batteri per 20 minuti . Le molecole di DNA contengono l’azoto leggero, dopo 20 minuti gli

scienziati estraggono il dna, lo centrifugano e lo mettono in una nuova provetta e si posiziona a metà. Gli

scienziati hanno fatto crescere un’altra generazione e da lì hanno ottenuto ancora un risultato diverso cioè una

banda leggere cioè spostata verso l’alto.

Nella replicazione semiconservativa abbiamo dna replicativi formati da una banda pesante e una leggera,

avendo pesante e leggero allora il dna si posiziona al centro che coincide con i dati sperimentali. Replicazione

conservativa in cui si originano due dna ma di cui uno completamente leggero e una completamente pesante ma

non si ottengono una banda leggera e una pesante, quindi non può essere questa la replicazione. La

replicazione dispersiva mi dà risultati coerenti con quello che era l’esperimento. Allora gli scienziati hanno fatto

una seconda generazione di replicazione e si formano anche in questo caso filamenti misti, si forma una banda

centrale ma ciò non va bene perchè l’esperimento mi dà due bande, una pesante e una leggera.

Dunque la replicazione che avviene è quella semiconservativa cioè ogni nuova doppia elica contiene un

filamento parentale e uno di nuovo stampo. Stiamo creando dunque un nuovo polimero e queste reazioni si

chiamano reazioni di polimerizzazione che indica l'unione o l’inserimento in maniera però direzionata. Il filamento

viene letto in direzione 3’ → 5’. L’enzima che media questo tipo di reazione viene chiamato DNA polimerasi. Ci

sono diversi tipi di questi enzimi e ogni tipo di polimerasi ha delle caratteristiche peculiari, le più importanti sono

le polimerasi I e III. Le polimerasi eucariotiche sono più numerose negli eucarioti rispetto ai procarioti.

Il processo di polimerizzazione

La dna polimerasi si lega al doppio filamento, legge il nucleotide sul filamento stampo e inserisce i nucleotidi

complementari. L’energia che serve al dna polimerasi viene ricavata dalla scissione del gruppo fosfato.

La dna polimerasi aumenta con l'aggiunta di nucleotidi complementari.

La dna polimerasi per agire deve avere un filamento stampo e quindi in particolari regioni chiamate origine di

replicazione si legano altri enzimi come le elicasi che denaturano la doppia elica cioè aprono la doppia elica

creando una bolla di replicazione. I filamenti di DNA tendono subito a snaturarsi e quindi alcune proteine

chiamate proteine di srotolamento tengono separati ai due filamenti legandosi ai filamenti in maniera cooperativa

(cioè prima si lega una e poi l'altra) e si formano le bolle in alcune zone chiamate forcelle di replicazione.

La replicazione nei procarioti

La replicazione del Dna nei procarioti inizia nell’origine di replicazione che si chiama OriC. La proteina Dna A

riconosce questa origine di replicazione e induce un cambiamento conformazionale che va a denaturare il Dna

(rompe legami idrogeno tra Adenina e Timina). Successivamente le elicasi (ricavando energia attraverso l’idrolisi

di ATP) separano i due filamenti. Si genera quindi una bolla di

replicazione a cui agli estremi si formano due forcelle di

replicazione. Le proteine SSB si legano al DNA per evitare

che i due filamenti si ri associano spostando l’equilibrio verso

la denaturazione (questo perché i due filamenti tendono a

riunirsi tra di loro ri formando due legami idrogeno).

Le elicasi reclutano l’enzima primasi formando il primosoma

che è è un complesso proteico fondamentale nel processo di

replicazione del DNA. La sua funzione principale è quella di

iniziare la sintesi del nuovo filamento di DNA durante la

duplicazione cellulare. La primasi è un RNA polimerasi a DNA

dipendente che sintetizza un breve frammento di RNA (complementare al filamento stampo) noto come primer

che fornisce un’estremità 3’OH. Grazie a questo primer vengono richiamate le DNA polimerasi (non possono

iniziare una sintesi ex novo, ma solo aggiungere nucleosomi). Il primer va a minimizzare gli errori iniziali.

Grazie al DNA polimerasi si aggiungono nucleotidi. La polimerizzazione produce due idrolisi:

●​ la prima produce pirofosfato e desossiribonucleotidi monofosfato

●​ la seconda idrolizza il pirofosfato

L’energia aumenta i passaggi della replicazione. Ci sono due tipi di polimerasi:

●​ polimerasi III: sintetizza il nuovo filamento di DNA

●​ polimerasi I: riempie gli spazi lasciati da primer di RNA, ripara il DNA così come il Pol II, IV, V →

correzione di bozze

La polimerasi rimane attaccata attaccata attraverso la morsa scorrevole ed è formata da due subunità beta e

consente alle subunità alfa, omega e epsilon della polimerasi di rimanere ancorate.

La replicazione va da 5’ a 3’ quindi si legge lo stampo da 3’ a 5’. Ci sono due filamenti:

●​ un filamento da 3’ a 5’: filamento veloce e continuo

●​ filamento da 5’ a 3’: filamento lento e semi discontinuo, la

replicazione avviene attraverso dei filamenti chiamati frammenti di

Okazaki e per ogni frammento di Okazaki c’è un primer che verrà poi

rimosso dalla polimerasi I. Questi frammenti vengono poi uniti dalla

DNA ligasi.

Le due forcelle replicative si incontrano in un punto detto Ter.

La polimerasi III permette il ripiegamento del filamento in un complesso

chiamato replisoma. Quando la polimerasi completa un frammento, l’ansa

viene rilasciata e il filamento si ripiega per iniziare un nuovo ciclo di sintesi.

Per evitare la super tensione le topoisomerasi alleviano alleviano lo stress:

●​ le topoisomerasi I: tagliano un filamento

●​ le topoisomerasi I: taglia due filamenti

Nei batteri c’è la girasi che riduce la torsione

Replicazione negli eucarioti Il genoma degli eucarioti è diverso da quello dei procarioti. Quest’ultimo è

infatti circolare e il genoma non è particolarmente ampio, mentre il genoma

degli eucarioti è molto più grande

Ciclo cellulare

●​ interfase: la prima parte si chiama G1 (gap 1) dove la cellula si

accresce e si differenzia, alcune cellule hanno la fase G0, ma altre passano

dalla fase G1 alla fase S dove la cellula va a replicare il proprio DNA, la cellula

passa alla fase G2 dove la cellula produce le proteine necessarie alla fase M

e controlla che la duplicazione sia avvenuta correttamente.

●​ fase mitotica: avviene la replicazione della cellula

Negli eucarioti non c’è solo un’ origine di replicazione ma ce ne sono migliaia e queste diverse origini di

replicazione vanno a fornire delle regioni chiamate repliconi.

In fase G1 viene espresso il dna e vi è il complesso di riconoscimento, diverse proteine si legano ai repliconi per

far sì che riconoscano le origini di replicazione (sono i complessi pre replicativi). Questo richiama l’enzima

mcm2-7 cioè le elicasi. Durante la fase G1 la cellula ha riconosciuto quali sono le origini di replicazione.

La cellula entra in fase S ed è il momento in cui la cellula viene replicata.

Negli eucarioti ci sono tante origini di replicazione chiamate repliconi. Quando la cellula entra in fase S vengono

richiamate due cicline, le cdk e le ddk che vanno a fosforilare le proteine:

●​ le cdk: attivano le proteine necessarie per l’inizio della replicazione e l’avanzamento del ciclo cellulare

●​ le ddk: fosforilano le proteine del pre-RC ovvero il complesso pre replicativo

Queste fosforilazioni vanno a richiamare l’enzima mcm2-7 ovvero l’elicasi. Altre proteine importanti sono le

licensing factor che fanno sì che l’origine di replicazione venga usata soltanto una volta.

Si genera successivamente una bolla di replicazione ai cui estremi si formano le forcelle replicative e inoltre ci

sono delle proteine chiamate HDP che tengono separati i due filamenti.

Vengono reclutate le DNA primasi (chiamata polimerasi alfa) da parte dell'enzima elicasi che formano il

proteasoma e che producono il primer che fornisce un’estremità 3’OH. Questo primer è una preve sequenza di

RNA. A questo primer si lega dunque la polimerasi che si lega alla morsa scorrevole che negli eucarioti si

chiama PCNA che forma una struttura ad anello sulla quale si può legare la dna polimerasi e con cui quest’ultima

può lavorare in maniera precisa.

Oltre a essere coinvolta nella replicazione, PCNA partecipa anche alla

riparazione del DNA quando ci sono danni, aiutando a richiamare le

proteine adatte per correggere gli errori. In queste situazioni, può essere

modificata da segnali chimici (come l’ubiquitinazione) che ne cambiano la

funzione, per esempio permettendo la sintesi del DNA anche se ci sono

lesioni temporanee. PCNA è anche un regolatore del ciclo cellulare: può

legarsi a proteine come la ciclina D per evitare che il DNA venga copiato

troppo presto. Quando la cellula è pronta per iniziare la sintesi del DNA,

PCNA viene liberato da queste interazioni. In caso di danni al DNA,

invece, PCNA viene bloccata da un’altra proteina chiamata p21, che

impedisce la replicazione e dà tempo alla cellula per ripararsi. Poiché è

molto attivo nelle cellule che si dividono, PCNA viene spesso usato come

indicatore per capire se un tessuto è in crescita o se è tumorale. Infatti, nei tumori è spesso presente in quantità

elevate, ed è per questo che viene studiato anche come possibile bersaglio per terapie contro il cancro.

La polimerizzazione, come nei procarioti, avviene con due idrolisi che rilasciano energia. Gli enzimi che si

occupano della replicazione sono la polimerasi epsilon e omega (la polimerasi y è la polimerasi mitocondriale

mentre altre polimerasi si occupano della duplicazione quando il DNA è danneggiato).

Le polimerasi di replicazione vengono poi interrotte dal fattore di replicazione C unito alla PCNA.

La rimozione degli inneschi avviene con la RNasi H mentre la rimozione del RNA avviene grazie al FEN-1.

Anche per gli eucarioti ci sono frammenti di Okazaki sul filamento lento, che vengono poi uniti dalla DNA ligasi.

Così come per i procarioti c’è anche per gli eucarioti l’avvolgimento dell'elica e lo svolgimento da parte delle

topoisomerasi.

Il processo di duplicazione del DNA negli eucarioti comporta anche la necessità di riorganizzare la struttura della

cromatina, in particolare i nucleosomi, che sono le unità fondamentali composte da DNA avvolto attorno a un

ottamero di istoni. Durante la replicazione, i nucleosomi vengono temporaneamente disassemblati per

permettere il passaggio della forcella replicativa. Questo disassemblaggio non è completo: il tetramero c