Testo completo sulla PCR per esame Genetica

la PCR è la POLYMERASE CHAIN REACTION ed è quindi una reazione a catena della polimerasi ed

è un metodo recente che ha rivoluzionato la biologia molecolare

fu ideata da Kary Mullis nel 1985 e da allora le sue applicazioni hanno rivoluzionato la biologia.

oggi esistono numerose varianti della PCR e viene utilizzata anche in diagnostica molecolare in

ambito forense e nelle analisi dell'espressione genica

in particolare la PCR è l'applicazione esponenziale IN VITRO di una specifica regione di DNA a

DOPPIA ELICA generando una quantità sufficiente per essere ANALIZZATA

richiede due OLIGONUCLEOTIDI che sono PRIMES, ciascuno complementare ad una delle due

eliche di DNA da amplificare, ed una DNA POLIMERASI

cicli ripetuti di riscaldamento e raffreddamento amplificano la regione di DNA compresa tra

due primer, producendo grandi quantità di DNA

La reazione di PCR è suddivisa in 3 stadi distinti ciascuno condotto ad una specifica temperatura e

questi sono:

1. DENATURAZIONE

2. APPAIAMENTO

3. ESTENSIONE

ed ogni ciclo è ripetuto 25-30 volte portando all'amplificazione finale di milioni di copie della

sequenza di RNA iniziale quindi

1. DENATURAZIONE: avviene a 94 C° e il DNA stampo a doppio filamento viene DENATURATO

2. APPAIAMENTO o anche ANNEALING che avviene tra 50-60 C° e i primers si appaiano al DNA

stampo e questo è l'unico stadio in cui la T può essere modificata in modo da ottenere la

massima efficienza di appaiamento tra primer e DNA stampo

3. ESTENZIONE: avviene a 72 C° e avviene la sintesi di un DNA a partire dall'estremità 3' di

ciascun primer

quindi per la miscela di reazione abbiamo: una SOLUZIONE TAMPONE, dNTPs, primers, un DNA a

doppio filamento e la DNA polimerasi TERMOSTABILE estratta da thermophilus aquaticus

quindi il nel primo ciclo abbiamo il DNA stampo, vengono aggiunti primer e avviene la

DENATURAZIONE, poi avviene l'ANNEALING e l'ESTENZIONE seguiti poi da un ulteriore ciclo

uguale

nel SECONDO CILCO abbiamo i prodotti del primo ciclo vanno incontro di nuovo a cicli di

denaturazione, annealing e estenzione ed alla fine abbiamo DUE ELICHE di DNA entrambe con

estremità 5' e 3' definite

nel TERZO CICLO alla fine abbiamo 2 molecole di DNA a doppia elica con estremità 3' e 5'

CORRISPONDENTI alle estremità dei primer

i primi prodotti discreti di PCR si formano a partire dal terzo ciclo e si accumulano con andamento

di tipo esponenziale e il numero di molecole finali è dato da N x 2^n-2 dove N è il numero di

molecole di partenza e n è il numero di cicli

quindi la PCR e numerose varianti trovano applicazioni tra l'altro nella ricerca di base in

diagnostica molecolare e in ambito forense, ma si occupano di genetica e ricerca, diagnosi malattie

ereditarie, determinazione del sesso e dei portatori nelle famiglie e nella genetica delle

popolazioni

ci sono 3 TECNICHE DI BLOTTING e servono per identificare specifiche molecole all'interno di un

campione

SOUTERN BLOTTING

NORTHEN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

Nel soutern blot il DNA viene estratto dall'organismo di interesse, viene frammentato con enzimi

di restrizione

viene sottoposto ad elettroforensi su gel per separare i vari frammenti in base alle dimensioni. il

DNA viene trasferito dal gel su una membrana di nitrocellulosa per capillarità

la MEMBRANA viene IBRIDATA con una SONDA RADIOATTIVA specifica per la sequenza di

interesse e il legame sonda/DNA viene rilevato su una lastra fotografica

IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

consiste nell'appaiamento di 2 molecole di DNA o RNA complementari

Dopo il blot il DNA TARGHET viene fissato sulla membrana e compare una SONDA o PROBE

PROBE: che è una molecola di DNA a singolo filamento, opportunamente marcata, che si accoppia

e quindi si ibrida ad una seconda molecola contenente una SEQUENZA NUCLEOTIDICA

complementare IMMBILIZZATA e definita TARGET

1. questa sonda viene marcata tramite incorporazioni di deossinucleotidi che portano isotopi

radioattivi del fosforo mentre il targhet viene denaturato con calore e trattament