Test biologici in vitro

Prima si fanno i test di citotossicità indiretta e poi se sono positivi

quelli di citocompatibilità diretta. Danno sia info qualitative che

quantitative.

I test vengono fatti rispetto a un controllo, cioè in assenza del mat.

La citotossicità si riferisce alla caratteristica di un mat di provocare un

effetto dannoso sulle cell, come la morte o l alterazione della normale

morfologia/funzionalità delle cell.

Si valuta il possibile rilascio di sostanze tossiche da parte del mat

- Prodotti di degradazione

- Solventi residui

- Reticolante residuo

- Contaminanti

- Prodotti di corrosione

- Ecc

Si usano test di citotossicità indiretti. Si usa il metodo di eluizione:

1. Si immerge lo scaffold all interno del mezzo di coltura, lo si

lascia invecchiare per 7 gg (o anche 1 g e 3 gg per avere +time

point), durante i quali vengono rilasciati gli eventuali prodotti

tossici, a T di 37°

2. Il mezzo di coltura invecchiato detto eluato viene posto a

contatto con le cell, per 24 h, a T di 37°

3. Saggi di vitalità cell, ovvero MTT o l Alamar Blue

+ osservazione morfologica al microscopio (ottico, fluo,

sem)

+ valutazione della funzionalità con test specifici

Saggio MTT:

L MTT è un sale di tetrazolio ed è di colore giallo. Quando entra all

interno delle cell vive, i mitocondri lo trasformano in un sale di

formazano di colore violetto.

Quindi le cell vive sono quelle viola, le cell morte sono quelle gialle. È

un saggio colorimetrico.

Si può ottenere un info qualitativa, osservando al microscopio la

distribuzione delle cell vive e morte.

Si può ottenere un info quantitativa, utilizzando uno

spettrofotometro che investe il campione con una specifica lunghezza

d onda e misura l assorbanza.

È un saggio distruttivo, cioè uccide le cell. Quindi se si deve ripetere si

deve usare un nuovo campione.

Saggio Alamar Blue:

Misura il livello di proliferazione cell. La resazurina di colore blu viene

ridotta a resorufina di colore rosso nell cell vitali.

È un saggio colorimetrico, in cui le cell vive sono rosse e quelle

morte sono blu.

Info qualitativa sulla distribuz delle cell e quantitativa tramite

spettrofotometro.

Saggio non distruttivo. Quindi posso ripetere l operazione sullo stesso

campione.

Posso fare una valutazione qualitativa andando a osservare la morfologia

delle cell ad es con microscopio ottico.

Posso quantificarla per vari tempi di contatto con gli eluati, oppure

per diversi tempi di invecchiamento dell eluato, anche

confrontando diversi mat ad es diverse [] di reticolante.

La vitalità dev essere > del 70%.

Citocompatibilità è la caratteristica opposta rispetto alla citotossicità,

ovvero la capacità del mat di interagire correttamente con le cell.

Si valuta tramite test di citocompatibilità per contatto diretto. Si

usa il metodo di contatto diretto:

1. Il mat viene posto nei pozzetti di coltura

2. Le cell vengono seminate direttamente al di sopra o inglobate

all interno

3. Si attendono tempi stabiliti, in condizioni standard

4. Saggi di vitalità cell, ovvero MTT o Alamar Blue

+ osservazione morfologica

+ valutazione della funzionalità mediante saggi specifici

Di solito per valutare la vitalità si uso l Alamar Blue perché non è

distruttivo. Di solito la vitalità cresce nel tempo.

Osservazione della morfologia, adesione e distribuzione delle

cell. Con microscopio ottico opp a fluorescenza opp SEM:

Con la SEM devo eprò fissare i campioni con glutaraldeide, disidratarli

per poi osservarli, è una tecnica distruttiva e non va bene con gli

idrogeli perché può modificarli.

M. a fluorescenza.

- Posso fare il LIVE/DEAD staining: le cell vive sono verdi (calceina), le

cell morte sono rosse (iodio propidio opp etidio omodimero 1). Si fa la

conta e si calcola la % di cell vive rispetto al totale.

- Con il DAPI marco il nucleo in blu.

M ottico. Colorazione istologica.

- Con ematossilina, di colore blu, per i nuclei.

- Eosina, di colore rosa, per il citoplasma.

Test specifici:

Per valutare se le cell sono in grado di svolgere la loro funzione, es se si

sono differenziate correttamente.

Es. per valutare la deposizione di matrice inorganica di CaP da parte

degli osteoblasti, posso usare una colorazione Alizarin Red (rosso)

oppure Von Kossa (marrone).

Es. per vedere l accumulo delle gocce lipidiche all interno degli

adipociti, si usa l Oil Red O staining (rosso).