Riassunto esame Microbiologia e immunologia, Prof. Quirino Angela, libro consigliato Principi di microbiologia medica, La placa

Colorazione dei micobatteri

I micobatteri, come Mycobacterium tuberculosis, sono batteri molto resistenti grazie a un

involucro esterno ricco di lipidi, che li rende difficili da colorare con le tecniche tradizionali.

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Colorazione di Ziehl-Neelsen

1.​ Fissazione: il campione viene fissato sotto calore, per far aderire i batteri al vetrino.

2.​ Colorante primario: si usa la fucsina fenicata (fucsina + acido fenico). Il calore e

l’acido fenico permettono alla fucsina di penetrare

3.​ Decolorazione: si utilizza una miscela di acido cloridrico e alcol. Tutti i batteri che

non sono acido-alcol resistenti si decolorano. I micobatteri, definiti bacilli acido-alcol

resistenti, conservano la fucsina e rimangono colorati di rosso.

4.​ Colorante di contrasto: per distinguere i micobatteri dalle altre cellule, si applica un

contrasto come il blu di metilene, che colora tutto il resto di blu.

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Colorazione di Kinyoun

È simile a Ziehl-Neelsen, ma non richiede calore. Il colorante penetra grazie a un

tensioattivo (Tergitol) che facilita l’ingresso della fucsina nei micobatteri.

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Colorazione fluorescente (auramina)

Questa tecnica evidenzia gli acidi micolici presenti nella parete dei micobatteri. Si usano

coloranti fluorescenti, come: Auramina (o fluoresceina), propidio ioduro.​

Questa tecnica permette di vedere i micobatteri anche quando sono pochi nel campione,

perché la fluorescenza li fa risaltare chiaramente sullo sfondo scuro. Si osserva con

microscopia a fluorescenza, quindi non serve colorante di contrasto tradizionale.

N.B. È fondamentale seguire il manuale di laboratorio per tempi, concentrazioni e passaggi.

Conoscere bene la tecnica permette di individuare errori e intervenire subito.​

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Isolamento Colturale

L’isolamento colturale, una tecnica fondamentale in microbiologia. In pratica, serve a

separare il microrganismo patogeno responsabile di una malattia da tutti gli altri

microrganismi presenti in un campione biologico. Una volta isolato, possiamo osservarlo al

microscopio e studiarlo. Per capire il genere, la specie e il sottotipo di un batterio, non basta

osservarlo al microscopio, ma è necessario fare l’antibiogramma, cioè testare la sua

sensibilità agli antibiotici, in coltura. Strumenti utilizzati:

M.C. 6

●​ ansa calibrata: è un “piccolo cucchiaio” ci permette di prelevare un volume preciso

del campione. Questo è importante perché, conoscendo il volume seminato e

contando le colonie cresciute, possiamo stimare la carica batterica.​

Ad esempio, in un’urinocoltura, si considera significativa una carica di almeno 10^5

CFU/ml, servono almeno 100.000 batteri per ml (10^5 CFU/ml) per considerarla

significativa. Se preleviamo 1 microlitro di urina con l’ansa calibrata e contiamo le

colonie dopo 24 ore che si formano in coltura e moltiplichiamo per 1000 e otteniamo

la carica batterica.

●​ ago: utile quando il campione contiene più microrganismi (campione polimicrobico).

Con l’ago preleviamo una singola colonia, per ottenere una coltura pura. Questo

concetto richiama il terzo postulato di Koch, che afferma che solo una colonia isolata

e in coltura pura può essere studiata e considerata responsabile della malattia.

Terreni e tecniche di semina

-​ Terreni liquidi: I batteri crescono e intorbidiscono il liquido.

-​ Terreni solidi: Contengono agar, un gel che solidifica il terreno. I batteri crescono in

colonie visibili. Ogni colonia nasce da circa 10^7 batteri, quindi vanno separate per

essere studiate singolarmente.

-​ Tecniche di semina: Strisciare il campione sul terreno per ottenere prima una patina

uniforme, poi colonie isolate. I terreni colturali hanno molteplici obiettivi:

●​ Isolare gli agenti patogeni,

●​ Contare i microrganismi (carica microbica)

●​ Identificarli,

●​ Effettuare l’antibiogramma,

●​ Studiare le caratteristiche biochimiche e metaboliche dei batteri.

Quando parliamo di terreni di coltura, possiamo distinguerli in liquidi e solidi.

Terreni di coltura liquidi

Si chiamano anche brodi. Sono definiti terreni di arricchimento: questo significa che se un

microrganismo è presente in piccola quantità, in questo tipo di terreno trova nutrienti e

condizioni ideali per crescere e diventare rilevabile. Sono molto utili quando dobbiamo “far

emergere” batteri che nel campione originale erano scarsi.

Terreni di coltura solidi

Per solidificarli si aggiunge agar in una concentrazione tra l’1 e il 2%. Su questi terreni i

batteri crescono formando colonie, quindi diventano facilmente osservabili. Possiamo

distinguerli in tre categorie principali:

1.​ Terreni universali: Permettono la crescita indiscriminata di tutti i microrganismi

presenti nel campione, es. agar sangue.

2.​ Terreni selettivi: Contengono sostanze che inibiscono la crescita di alcuni batteri e

favoriscono altri. In questo modo isoliamo i microrganismi che ci interessano da un

campione misto.​

Esempio: il terreno MacConkey che favorisce i Gram negativi enterici e inibisce i

Gram positivi. M.C. 7

3.​ Terreni differenziali: Contengono uno zucchero e un indicatore di pH. Servono a

valutare le capacità metaboliche dei batteri: per esempio, se fermentano lo zucchero

producono acidi che modificano il colore del terreno. Questo ci permette non solo di

far crescere i batteri, ma anche di differenziarli in base al metabolismo.

Componenti dei terreni di coltura: Per supportare la crescita dei batteri, i terreni

contengono:

●​ Nutrienti: proteine, carboidrati, peptidi, amminoacidi e metalli essenziali.

●​ Agenti tamponanti: mantengono stabile il pH.

●​ Indicatori di pH: ci aiutano a capire se avvengono processi metabolici (ad esempio

fermentazioni).

●​ Sali biliari: usati soprattutto nei terreni selettivi per inibire alcuni microrganismi e

favorire altri.

Agar cioccolato

Si chiama così perché ha il colore del cioccolato. Il colore deriva dalla cottura del sangue a

60–80 °C, che provoca la lisi dei globuli rossi e la liberazione di due fattori fondamentali:

●​ il fattore V (NAD): è una coenzima coinvolto in reazioni di ossidoriduzione,

indispensabile per alcuni batteri che non riescono a sintetizzarlo da soli.

●​ il fattore X (eme): è un derivato dell’emoglobina, serve come fonte di ferro per la

sintesi di alcuni enzimi batterici.

Quindi l’agar cioccolato è un terreno arricchito, usato soprattutto per coltivare batteri

esigenti, che non crescerebbero sui terreni più semplici. Questi fattori sono indispensabili

per la crescita delle Neisseria patogene. Le Neisseria non patogene, invece, non riescono a

crescere su questo terreno.

Per ottenere una crescita ottimale in coltura non è sufficiente che il terreno di coltura

risponda alle necessità nutrizionali, ma è necessario che anche l’ambiente in cui il terreno

viene mantenuto sia idoneo alle particolari esigenze del batterio in questione. Quindi il

terreno dovrà essere incubato alla temperatura ottimale, dovrà essere fornita la

concentrazione di CO2 necessaria, che di norma coincide con quella presente nell’aria, ma

che talora è necessario aumentare notevolmente inoltre si dovrà assicurare la presenza di

ossigeno per i batteri aerobi e d’altra parte si dovrà provvedere all’eliminazione

dell’ossigeno per la coltura degli anaerobi obbligati . Se non si rispettano queste condizioni

di incubazione, il microrganismo non cresce e rischiamo di perderlo.

Curva di crescita batterica

Quando coltiviamo i batteri, soprattutto in terreni liquidi, la loro crescita segue un andamento

tipico chiamato curva di crescita batterica. È importante conoscerla perché riflette i diversi

momenti del ciclo vitale della coltura. Le fasi principali sono:

1.​ Fase di latenza: I batteri si adattano al nuovo ambiente. Non si moltiplicano subito,

ma iniziano a metabolizzare i nutrienti. La durata varia a seconda del microrganismo.

2.​ Fase esponenziale o logaritmica: I batteri iniziano a dividersi molto rapidamente.

La crescita è esponenziale: da pochi diventano milioni in poco tempo. È la fase in cui

la coltura è “giovane” e più attiva. M.C. 8

3.​ Fase di decelerazione: La velocità di crescita comincia a diminuire perché i nutrienti

iniziano a ridursi.

4.​ Fase stazionaria: Il numero di batteri che nascono è uguale al numero di batteri che

muoiono. Nel terreno si accumulano sostanze tossiche e prodotti di scarto. La coltura

è considerata “vecchia”.

5.​ Fase di morte o declino: I nutrienti finiscono e i batteri muoiono progressivamente.

Colture continue

In laboratorio, per studiare i batteri senza che vadano incontro alla fase di declino, possiamo

utilizzare sistemi come il chemostato: si toglie continuamente il terreno “vecchio” che

contiene scarti, e si aggiunge terreno fresco con nutrienti. In questo modo la coltura resta in

una condizione di crescita costante.

Agar sangue

L’agar sangue è considerato il terreno di coltura universale per eccellenza. Molti batteri

producono emolisine, sostanze in grado di danneggiare i globuli rossi dell’agar sangue

(emolisi). L’attività emolitica viene utilizzata per l’identificazione e la classificazione dei

batteri. Il tipo di emolisi dipende anche dalla specie a cui appartengono i globuli rossi.

Comportamento dei batteri in relazione all' emolisi:

●​ α-emolisi (emolisi incompleta): colonie

circondate da un alone di colorazione

verdastra (es. Streptococcus pneumoniae).

●​ β-emolisi: (emolisi completa): colonie

circondate da alone chiaro; (es.

Streptococcus pyogenes).

●​ γ-emolisi → assenza di emolisi.​

Crescita batterica su terreno solido

Su un terreno solido i batteri crescono, ma in genere non si spostano. Un’eccezione

importante è rappresentata dai batteri del genere Proteus, che possiedono un particolare

meccanismo di motilità detto swarming (o “a sciame”). Questo batterio si muove sulla

superficie del terreno formando cerchi concentrici caratteristici. Il problema è che,

muovendosi molto, può ricoprire e mascherare la crescita degli altri microrganismi presenti

sul terreno, rendendo più difficile l’osservazione.​

Patina batterica

Quando seminiamo un campione biologico su un terreno i batteri che crescono possono

formare:

●​ colonie singole → piccole, ben separate, ognuna derivata da un solo batterio.

●​ patina uniforme → una crescita estesa che ricopre tutta la superficie del terreno,

senza lasciare spazi vuoti, questo può indicarci che il campione è polimicrobico

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Terreni di coltura selettivi e differenziali

I terreni selettivi hanno la