Riassunto esame Istologia, Prof. Campanelli Anna Rita, libro consigliato Citologia e istologia , Dalle donne

RNA: un gene un enzima

Beadle e Tatum studiarono a lungo la relazione tra le mutazioni geniche e le proteine. Essi infatti trattarono la muffa del pane (Neurospora crassa), capace di crescere in un terreno minimo, con raggi X per indurre mutazioni. I due scienziati notarono che i ceppi mutanti prodotti non erano più in grado di crescere in un terreno minimo poiché avevano perso la capacità di sintetizzare alcuni amminoacidi o vitamine. In un primo momento queste muffe mutanti vennero posizionate in un terreno di coltura differente e così giunsero alla conclusione che essi erano impossibilitati a sintetizzare solo un particolare amminoacido o una particolare vitamina.

Essendo la sintesi degli amminoacidi e quella delle vitamine un processo che si sviluppa in più passaggi, i due scienziati provarono a capire quali di essi era stato inibito dalle mutazioni: essi misero nel terreno minimo non più l’amminoacido o la vitamina ma i loro precursori metabolici. Trovando il precursore che permetteva la crescita di un particolare ceppo mutante, Tatum e Beadle furono in grado di definire che ciascuna mutazione corrispondeva all’inattivazione di un unico enzima che catalizzava un passaggio responsabile della sintesi di uno specifico composto. In questo modo essi dimostrarono la corrispondenza diretta tra le mutazioni geniche e la perdita di uno specifico enzima. Alla luce di questo esperimento si giunse alla conclusione che ogni sequenza genica controlla la produzione di una singola molecola enzimatica.

Un gene una catena polipeptidica

Linus Pauling era uno scienziato alle prese con la malattia ereditaria dell’anemia falciforme. Cercando il motivo di questa malattia egli analizzò l’emoglobina dei globuli rossi affetti. Essendo l’emoglobina una molecola carica, egli attraverso l’elettroforesi (materiale organico immerso in un gel sottoposto all’effetto di un campo elettrico) notò che l’emoglobina delle cellule falciformi migrava con velocità differente rispetto all’emoglobina di una cellula sana. Poiché alcuni amminoacidi presentano gruppi carichi, Linus giunse alla conclusione che l’emoglobina delle cellule falciformi differiva da quella delle cellule sane per la sua composizione amminoacidica.

Per verificare questa ipotesi però bisognava sequenziare l’intera proteina di emoglobina, cosa impossibile con gli strumenti dell’epoca. Fu Vernon Ingram che riuscì a confermare l’ipotesi di Pauling senza sequenziare l’intera molecola. Infatti egli utilizzò la proteasi tripsina per tagliare l’emoglobina in frammenti peptidici i quali vennero poi separati grazie all’elettroforesi ed in seguito attraverso la cromatografia. Dall’analisi del quadro peptidico dell’emoglobina falciforme e di quella normale, Vernon osservò che esse differivano per un solo amminoacido, infatti nella molecola falciforme l’acido glutammico era stato sostituito da una valina. Questa sostituzione, dovuta al cambiamento di una singola coppia di basi nel DNA, è sufficiente ad alterare il modo in cui le molecole di emoglobina si aggregano nei globuli rossi. Infatti l’emoglobina normale presenta una consistenza gelatinosa quando rilascia l’ossigeno e lega l’anidride carbonica; l’emoglobina falciforme invece assume una consistenza di tipo cristallino che modifica la forma dei globuli rossi e gli impedisce di muoversi liberamente nel flusso sanguigno.

Studi successivi a quelli di Pauling hanno dimostrato che esistono altre mutazioni della molecola di emoglobina dovute a geni che codificano per il dominio alfa ed il dominio beta della molecola. Non essendo l’emoglobina un enzima, la concezione di un gene un enzima fu soppiantata da quella di un gene una proteina, ma avendo visto che determinati geni codificano anche solo per parti di proteine, si giunse alla conclusione che i geni codificano per catene polipeptidiche. In seguito si scoprì però che determinati geni possono codificare non solo per la sintesi di catene polipeptidiche ma anche per la sintesi di RNA.

Il codice genetico a triplette

Siccome i nucleotidi di un gene determinano da quali amminoacidi deve essere composta la catena polipeptidica, ad ogni amminoacido quante coppie di nucleotidi corrispondono? Se fossero due coppie (4² = 16) sarebbe troppo poco poiché gli amminoacidi che formano le proteine sono 20; si giunse quindi alla conclusione che per ogni tre coppie di nucleotidi (triplette) corrisponde un amminoacido (4³ = 64).

La conferma del codice a triplette

Crick e Brenner sottoposero dei batteriofagi T4 all’azione mutagena della proflavina. Questo agente mutageno è un colorante all’acridina che causa l’aggiunta o la delezione di una singola coppia di basi (mutazioni frameshift) che comporta lo scivolamento dell’intera cornice di lettura; il messaggio nucleotidico risulta quindi alterato dal punto della mutazione in poi. I due scienziati notarono però che due mutazioni inverse (+ ; –) molto vicine riportavano il batteriofago nella forma fenotipica originale (pseudo wild-type). Ciò non avveniva quando le mutazioni erano entrambe dello stesso segno. Crick e Brenner ottennero anche tripli mutanti ed osservarono che quando le mutazioni erano tutte dello stesso segno (+++; —) il batteriofago ripresentava il fenotipo wild-type. Alla luce di ciò, la teoria del codice genetico a triplette era confermata poiché:

• Due mutazioni di segno diverso alterano la cornice di lettura unicamente tra la prima mutazione e la seconda, ma il numero di nucleotidi rimarrà sempre un multiplo di tre; inoltre, se le mutazioni sono molto vicine, le sequenze alterate comprendono solo poche triplette e quindi il fenotipo risulta essere wild-type.
• Due mutazioni di segno uguale alterano tutta la cornice di lettura a partire dalla prima mutazione.
• Tre mutazioni dello stesso segno alterano la cornice di lettura solo tra la prima e l’ultima mutazione e l’intera sequenza nucleotidica rimane comunque un multiplo di tre; inoltre, quando queste mutazioni sono molto vicine, questi errori possono essere tollerati nella formazione di una proteina e perciò il fenotipo risulta essere wild-type.

Il codice genetico è degenerato e non sovrapposto

Se soltanto 20 delle 64 possibili triplette codificassero per amminoacidi utilizzati nelle catene polipeptidiche, la presenza di mutazioni ridurrebbe drasticamente il numero di organismi mutanti compatibili con la vita. Ciò però, grazie agli esperimenti di Brenner e Crick, risulta non essere vero. I due scienziati infatti giunsero alla conclusione che il codice genetico è un codice degenerato, ossia un singolo amminoacido può essere codificato da più di una tripletta di nucleotidi, in questo modo si diminuisce anche il rischio di una mancata comprensione di una cornice di lettura a seguito di mutazioni.

I due scienziati giunsero anche alla conclusione che il codice genetico è non sovrapposto, ossia la lettura dei nucleotidi avviene di tripletta in tripletta e quindi ogni nucleotide viene letto una sola volta. Se il codice genetico fosse sovrapposto, la cornice di lettura dovrebbe avanzare solo di un nucleotide alla volta, così che ogni nucleotide sarebbe letto tre volte. In un codice sovrapposto, una mutazione frameshift porterebbe all’inserzione o alla delezione di un amminoacido in un punto del polipeptide e cambierebbe alcuni amminoacidi adiacenti ma non avrebbe effetto sulla cornice di lettura della rimanente porzione del gene. Questo significa che se il codice genetico fosse sovrapposto, Crick e Brenner non avrebbero osservato le mutazioni frameshift. In conclusione, quindi, ogni nucleotide è parte di una sola tripletta. In realtà si è scoperto successivamente che esistono dei virus che presentano un codice genetico sovrapposto.

L'RNA messaggero dirige la sintesi proteica

La dimostrazione che le molecole di mRNA, ottenute dalla trascrizione, sono responsabili dell’ordine degli amminoacidi nella sintesi di una catena polipeptidica è stata ottenuta grazie all’esperimento di Nirenberg e Matthei. Questi due scienziati studiarono la sintesi proteica in un sistema acellulare, ossia al di fuori della cellula in una miscela di ribosomi isolati, amminoacidi, una fonte di energia ed un estratto cellulare contenente i componenti solubili del citoplasma. I due ricercatori osservarono che l’aggiunta di RNA al sistema acellulare aumentava la velocità della sintesi proteica. A questo punto decisero di aggiungere ad un sistema cellulare delle molecole di RNA sintetiche derivate dall’enzima polinucleotide fosforilasi il quale appaia in maniera lineare i ribonucleotidi a disposizione. Per questo esperimento gli unici ribonucleotidi utilizzati furono quelli UTP e quindi la molecola di RNA sintetizzata era formata unicamente da uracile (omopolimero), RNA poli(U). Una volta aggiunto questo acido nucleico sintetico nel sistema acellulare, i due scienziati osservarono che le catene polipeptidiche presentavano molteplici amminoacidi fenilalanina. Molecole di RNA sintetico contenenti basi differenti non stimolavano l’incorporazione della fenilalanina. Da questi risultati Nirenberg e Matthei giunsero alla conclusione che le molecole di RNA determinano l’ordine in cui gli amminoacidi vengono uniti durante la sintesi proteica.

Gli mRNA sintetici ed il dizionario delle triplette

Le triplette dell’mRNA prendono il nome di codoni e sono proprio queste sequenze nucleotidiche a dirigere la sintesi delle proteine. Poiché le molecole di mRNA vengono sintetizzate in direzione 5’ → 3’ e sono tradotte cominciando dall’estremità 5’, i 64 codoni per convenzione sono scritti nell’ordine 5’ → 3’. A partire dall’esperimento di Nirenberg e Matthei, i quali scoprirono che la tripletta UUU codifica per la fenilalanina, ulteriori esperimenti portati avanti con omopolimeri portarono alla scoperta delle triplette AAA (lisina) e CCC (prolina). Successivamente si utilizzarono copolimeri sintetici di mRNA contenenti soltanto due basi azotate ma ciò rendeva più difficile capire a quale tripletta corrispondeva un determinato amminoacido in quanto la polinucleotide fosforilasi appaiava casualmente i nucleotidi. Così i ricercatori sintetizzarono mRNA contenenti soltanto tre nucleotidi e riuscirono a catalogare la maggior parte dei codoni e degli amminoacidi corrispondenti. In seguito Gobind Khorana nel suo laboratorio riuscì a sintetizzare RNA con triplette determinate, capendo più facilmente gli amminoacidi corrispondenti. Una volta confrontati i dati ottenuti con quelli dei due scienziati, si giunse ad un primo dizionario delle triplette.