Appunti esame regolazione dell'espressione genica negli eucarioti (REGE)

Regolazione genica durante lo sviluppo embrionale

La fase embrionale del gene lin-14 presenta un andamento interessante: l'RNA non varia durante lo sviluppo, ma varia la proteina. Questo suggerisce che l'espressione genica deve abbassarsi post-trascrizionalmente. Se l'RNA rimane costante mentre la proteina diminuisce, significa che la regolazione non è trascrizionale. In caso contrario, si avrebbe una modulazione dell'RNA.

Se mutiamo il 3'UTR di lin-14, otteniamo lo stesso fenotipo della mutazione di lin-4. Questo indica che il gene lin-4 regola lin-14 a livello post-trascrizionale, legandosi al 3'UTR. I ricercatori hanno quindi cercato una proteina, ma non hanno trovato nessun cDNA che complementasse la mutazione lin-4. Hanno quindi iniziato a confrontare con pezzi di genoma e hanno trovato un pezzo di 693 bp, anche se in questo pezzo non c'era niente di rilevante. Si trattava semplicemente di sequenze di...

nucleotidi senzanessun significato biologico. All’epoca il significato biologico erano le ORF. Quindi, hannopreso il verme WT, il verme senza il gene lin-4 e il verme in cui davano il plasmide. Poihanno fatto un northern utilizzando come probe lo stesso plasmide. Nel WT c’era unpezzettino grosso 22 nucleotidi che mancava nel mutante. Soprattutto, quando andavanoa fare il rescue vedevano un frammento più grande e ancora una volta il ripristino delframmento piccolino di 22 nucleotidi. Questo frammento più grande non era altro che ilprecursore del frammento più piccolo. Nella sequenza di 693 bp cercavano dunque unaregione che corrispondesse a questi 2 elementi. In questo modo trovarono lin-4L (ilprecursore) e lin-4S (la molecola di 22 nucleotidi).Siamo nel 1993 e questa fu la scoperta di quelli che vengono chiamati small temporalRNA. Il piccolo RNA lin-4 di soli 22 nucleotidi si appaia al 3’UTR di lin-14 inibendonel’espressione. Fu il primo

Caso di un RNA non codificante piccolo che regolava l'espressione genica di un gene canonico codificante a livello post-trascrizionale. 7 anni dopo trovarono una seconda mutazione. Questa seconda mutazione ha una caratteristica simile a lin-4: invece di bloccarsi in L1, l'animale si blocca in L4. Trovarono così un secondo stRNA che chiamarono let-7. Let-7 funziona allo stesso identico modo di lin-4. Scoprirono così che i miRNAs non targettavano un solo messaggero ma potevano targettare tanti messaggeri sfruttando delle piccole regioni di complementarità. Bastava che poche regioni fossero complementari (sequenza seed) per avere una inibizione dell'espressione genica. Quindi, fecero un modello per cui nello sviluppo del nematode, è importante che ci sia l'espressione di questi piccoli miRNAs che vanno a regolare la quantità di proteina. Le fluttuazioni di proteina erano quindi dovute a dei piccoli miRNAs. Questo modello venne pubblicato su

Nature nel 2000. In questo modello veniva spiegato che l'espressione genica durante lo sviluppo può essere regolata da piccoli RNA. Questa volta quando hanno confrontato let-7 con il genoma umano hanno trovato tantissimi omologhi. Il genoma umano era pieno di let-7. Quindi il meccanismo di regolazione dell'espressione genica appena descritto non è una peculiarità del nematode ma è qualcosa che è conservato nell'evoluzione di tutti gli organismi complessi. Dato che nell'uomo non ci sono sviluppi temporali, let-7 viene chiamato miRNA. È nata quindi una vera e propria rivoluzione che ha portato a rivisitare tutti i networks genetici trascrizionali trovati nell'uomo alla luce di queste nuove molecole. I miRNAs sono presenti in tutti i metazoi. Nell'uomo ne abbiamo più di 2.000. Sono presenti anche nei virus. I miRNAs controllano l'espressione genica a livello post-trascrizionale regolando la stabilità e

La traduzione. Come vengono prodotti i miRNAs? I miRNAs sono prodotti a partire da trascritti primari. Un miRNA può essere trasformato in siRNA e un siRNA può essere trasformato in miRNA. Infatti, la sintesi citoplasmatica è conservata. Quello che cambia è solo il modo con cui si appaiano al target. Il siRNA si appaia in modo perfettamente complementare. Il miRNA si appaia lasciando dei bulge. Questo avviene nell'uomo. Invece, nelle piante i miRNAs funzionano come i siRNAs. Nel nucleo invece le sintesi sono differenti. Nel nucleo non tutti gli organismi producono siRNAs. In Drosophila abbiamo enzimi che sono specifici o per i miRNAs o per i siRNAs. Infatti, i siRNAs in questi animali hanno un ruolo molto importante per la vita dell'organismo. Invece nell'uomo abbiamo una sola proteina perché l'interference nell'uomo non esiste, ma lo induciamo noi. Quello endogeno è molto poco rilevante. Vedremo la sintesi dei miRNAs nei mammiferi.

Nel pathway canonico il miRNA è trascritto da un precursore che viene chiamato pri-miRNA (primary). Questo trascritto primario è trascritto dall'RNA pol II. Quindi, ha un cap e una poliA. Il trascritto primario viene processato nel nucleo da un taglio endonucleolitico a doppio filamento che produce il pre-miRNA (precursor). Il pre-miRNA, che è grosso circa 70 nucleotidi, viene esportato nel citoplasma. A questo punto nel pathway canonico avviene un secondo taglio endonucleolitico a doppio filamento che produce un double strand RNA. A questo punto, i 2 filamenti (è raro che solo 1 venga incorporato) vengono incorporati nel complesso di silenziamento miRISC. Il complesso miRISC va poi a inibire l'espressione genica stimolando la deadenilazione o la traduzione. Se il miRNA è perfettamente complementare si comporta come un siRNA. Al pathway canonico si affiancano 2 pathway non canonici. Nel primo pathway non canonico il pre-miRNA viene fatto senza taglio.

endonucleolitico ma dallo splicing. L'endonucleasi che taglia nel nucleo si chiama Drosha. Quindi, questo primo pathway non canonico è un pathway Drosha indipendente.

Nel citoplasma esistono pre-miRNA che non sono tagliati dall'endonucleasi Dicer e sono percio pathways Dicer indipendenti. Quindi, abbiamo diverse proteine che sono responsabili di questo processamento. Drosha e Dicer sono 2 endonucleasi che tagliano l'RNA a doppio filamento e quindi hanno entrambe 2 domini che tagliano il filamento dalle 2 parti opposte. Queste 2 proteine riconoscono il double strand RNA. Drosha lega il pri-miRNA e Dicer lega il pre-miRNA. La loro efficienza di legame è abbastanza bassa. Quindi, sono aiutate da 2 cofattori ossia DGCR8 nel nucleo e TRBP nel citoplasma. Nel pathway di Drosophila ci sono proteine specifiche. I miRNAs sono fatti da un pri-miRNA che è un trascritto pol II. Possono essere presenti in introni, in 3'UTR, in esoni di geni codificanti.

Oppure possono essere anche presenti in geni non codificanti ma anche in geni senza introni. La stragrande maggioranza (circa il 40%) è presente in introni di geni codificanti. La sintesi del miRNA distrugge il precursore del gene codificante. Però dato che facciamo più trascritto di quello che ci serve, comunque la loro esistenza non altera l'espressione dei geni che li ospitano. Circa il 30% è intergenico. Un altro 20% è presente in introni di lncRNA. Spesso sono presenti in cluster, cioè abbiamo più miRNAs vicini. Drosha e Dicer sono 2 endoribonucleasi, ossia enzimi che tagliano l'RNA all'interno. Non fanno un taglio netto. Per esempio, Drosha produce un 3' overhang. Quindi, Drosha riconosce lo stem loop e taglia alla base di questo stem loop producendo un pre-miRNA. Dicer, attraverso il dominio PAZ, riconosce proprio il 3' overhang prodotto da Drosha. Questo dominio poi posiziona dalla parte opposta il dominio nucleasico.

Questo farà ancora una volta un taglio sfalsato. Drosha riconosce il double strand RNA. Il double strand RNA deve essere fiancheggiato da regioni non appaiate. La struttura del pri-miRNA è importante per il riconoscimento e il taglio. È molto facile trovare questi tipi di sequenze all'interno dei precursori. Drosha da sola non ha un legame forte all'RNA e ha bisogno del cofattore DGCR8 (Pasha). DGCR8 si posiziona nelle regioni a singolo filamento e posiziona correttamente Drosha. Ci sono moltissime altre proteine che possono influenzare positivamente o negativamente il taglio. Dicer invece riconosce sia il double strand RNA sia il 3' overhang. Deve essere aiutata dal cofattore TRBP. Una volta che abbiamo tagliato e fatto il double strand RNA, la proteina Dicer passa il double strand RNA ad Ago. Noi abbiamo 2 filamenti ma quale filamento diventerà il miRNA? Tutti e 2. Infatti, c'è sempre una produzione del filamento complementare al

miRNA. Cosa regolare l'espressione dei geni che contengono il miRNA? Naturalmente, il gene ospite. Il promotore che produce la trascrizione del miRNA è il promotore del gene ospite. Trascrivere un miRNA non è sufficiente, lo devo poi processare. La sintesi per processamento può comunque non essere correlata all'espressione trascrizionale. È molto frequente che ci sia un feedback positivo o negativo tra il miRNA e il fattore di trascrizione che ne regola l'espressione. Questo è un modo per controllare l'omeostasi. Quindi, un eccesso di proteina va a targettare lo stesso gene mentre un eccesso di miRNA va a targettare il fattore di trascrizione che lo fa esprimere. Oltre alla trascrizione è importante considerare il processamento. Quindi, ci sono tantissime proteine che possono favorire o sfavorire il processamento. Poi ci sono anche alcune modifiche post-traduzionali che vanno a regolare l'attività del complesso.

Il testo tratta di sumoilazioni, fosforilazioni, PARilazioni. Quindi, abbiamo tantissime modifiche che avvengono sulle proteine che fanno parte del complesso miRISC. Abbiamo quindi visto la sintesi. Vediamo ora come funzionano questi miRNAs. I miRNAs nell'uomo si appaiano in modo non perfettamente complementare al 3'UTR dei messaggeri target. Nelle piante invece i miRNAs funzionano come i siRNAs: si appaiano al messaggero e lo tagliano. Nell'uomo diventa più complicato trovare i target del singolo miRNA. Quando analizziamo questi appaiamenti abbiamo sempre che la regione 5' del miRNA ha un appaiamento più lungo rispetto al 3'. Questa regione viene chiamata seed e va dai 2 agli 8 nucleotidi. 8 nucleotidi appaiati consecutivi danno la massima efficacia. Non bisogna considerare solo il singolo appaiamento ma bisogna considerare anche quante volte il miRNA si appaia al target. Esistono anche dei siti non canonici di appaiamento. In questi casi oltre

all'appaiamento del seed abbiamo un appaiamento lungo anche al 3'. Questo avviene nel meno del 5% dei miRNAs. Quindi, è