Radiobiologia

Curve di sopravvivenza cellulare dopo irradiazione in vitro; consentono anche di valutare gli effetti su

organi, sistemi ed apparati (surviving fraction SF2Gy). Un campo di studio della radiobiologia è la

quantificazione della relazione tra dose assorbita e percentuale di cellule uccise. Tale studio viene

effettuato mediante la determinazione delle curve di sopravvivenza. In pratica le cellule irradiate

vengono seminate in appositi terreni di coltura e dopo un tempo adeguato si conta quante colonie

visibili si sono formate. Confrontando il numero di colonie che si formano per diversi livelli di dose si

costruiscono le curve mostrate. Come si può osservare nelle figure la curva dose risposta è non lineare.

In altre parole il doppio della dose produce un effetto maggiore del doppio. Somministrare la stessa

dose in un’unica frazione produce un effetto molto maggiore che somministrarla in tante frazioni più

piccole.

Analisi degli effetti clinici negli individui o nelle popolazioni sottoposte ad esposizione per: cause

professionali, Radioterapia, bombardamenti nucleari: Hiroshima e Nagasaki, 1945, esperimenti nucleari:

Isole Marshall, 1954, esplosione di centrali nucleari: es. Chernobyl, 1984; Fukushima 2011. Lo studio dei

danni a livello molecolare ed a livello cellulare viene integrato con lo studio dei danni a livelli superiori

mediante esposizione sperimentale di animali e mediante lo studio retrospettivo degli effetti di

esposizioni umane dovute ad incidenti.

Sequenza degli eventi di interesse radiobiologico: emissione di energia da parte di una sorgente

naturale o artificiale. Trasferimento di energia attraverso lo spazio in forma di fascio di radiazioni.

Assorbimento di energia da parte degli atomi della materia. Rottura di legami nelle catene principali e/o

collaterali delle molecole. Formazione di ponti intra- e inter-molecolari. Modificazione strutturale delle

molecole biologiche. La specificità della radiobiologia è limitata alle prime tre fasi mostrate in figura. Gli

effetti prodotti dalle rotture dei legami chimici sono in larga misura indipendenti dalla causa che ha

provocato tali rotture; in particolare gli effetti delle radiazioni sono in gran parte sovrapponibili agli

effetti dei danni da radicali liberi. La durata della fase fisica dell’interazione tra radiazione e materia e

dell’ordine delle frazioni di secondo, gli effetti biologici si manifestano in tempi molto più lunghi. Si ha

una radiazione ionizzante dal sole ma abbiamo un sistema di difesa. Il danno cambia in base alla durata

dell’indagine diagnostica per maggiori radiazioni rispetto al sole.

Interazione radiazione-tessuti: Fase fisica = interazione tra fotoni ed elettroni orbitali degli atomi. Fase

chimica:= rapide reazioni chimiche immediatamente successive all’irradiazione. Fase biologica: =

processi, per la maggior parte geneticamente controllati, relativi alle manifestazioni biologiche del

danno.

Fase fisica: Eccitazione: spostamento di un elettrone ad un livello energetico superiore, con emissione

fotonica secondaria e innesco di eventuali ionizzazioni a cascata. Ionizzazione: espulsione di un

elettrone da un atomo e creazione di una coppia di ioni. Alla dose somministrata di 1 Gy, con radiazioni

a basso LET, avvengono circa 105 ionizzazioni nel volume del diametro 10 micron.

Fase chimica: Gli elettroni prodotti dalle ionizzazioni inducono la rottura di legami atomici e molecolari,

con la conseguente formazione di radicali liberi ad alta reattività. Interazioni con il DNA. Azione diretta:

rottura di legami all’interno della molecola di DNA. Azione indiretta: danneggiamento del DNA da parte

di radicali liberi. L’azione indiretta, attraverso radicali liberi, è di gran lunga la prevalente nella

determinazione degli effetti biologici. Nell’azione diretta la radiazione provoca la rottura di un legame

chimico della molecola di DNA; nell’azione indiretta la radiazione produce un radicale libero che poi

danneggia il DNA. Circa un terzo degli effetti biologici dei raggi X sono dovuti all’azione diretta delle

radiazioni sul DNA. Circa i due terzi degli effetti biologici dei raggi X sono dovuti all’azione indiretta

mediata dai radicali liberi.

Azione indiretta: La maggior parte delle ionizzazioni avviene in molecole di H2O.Circa 10-10 secondi

dopo l’irradiazione, sono presenti 3 prodotti della radiolisi dell’acqua. Radicali liberi = molecole instabili

(mancano di un e-). Cercano di appropriarsi di e- di altre molecole (meccanismo a catena). R° + O2 >

RO°2 = fissazione (fixation) del danno da parte dell’ossigeno molecolare. La presenza di ossigeno

stabilizza leggermente i radicali liberi > maggiore diffusibilità = L’ossigeno amplifica i danni indiretti. La

presenza di ossigeno stabilizza leggermente i radicali liberi prodotti dalle radiazioni e quindi permette

loro di diffondere a maggiore distanza. In definitiva la presenza di ossigeno amplifica gli effetti indiretti

delle radiazioni.

Fenomeni di scavenging/fixation: Nel primo millisecondo dall’irradiazione si instaura una

“competizione” tra reazioni di fissazione del danno fixation = l’ossigeno è forse il più importante

fattore sensibilizzante (radiosensibilizzanti) e reazioni di annullamento dei radicali liberi, scavenging,

mediante composti con gruppi tiolici (-SH). Esempi di scavengers: glutatione, cisteina, cisteamina

(radioprotettori) [to scavenge = spazzare]. Se da un lato la presenza di ossigeno aumenta il danno da

radiazioni vi sono al contrario composti con effetto opposto. I cosiddetti scavenger come il glutatione

ed altre molecole, infatti contribuiscono a neutralizzare i radicali liberi prodotti dalle radiazioni e quindi

a diminuire l’effetto delle stesse. L’efficacia dell’ossigeno come radio-sensibilizzante è in genere molto

maggiore di quella degli scavenger come radioprotettori.

Fase biologica: Dopo che il danno indotto da radiazioni si è prodotto, si innescano una serie di fenomeni

che coinvolgono i meccanismi enzimatici e di riparazione dei danni al DNA. L’esito può essere triplice: la

cellula può riparare completamente il danno e sopravvivere immutata; il danno può portare la cellula a

morte; il dano può essere riparato ma in maniera non corretta e la cellula può quindi sopravvivere con

una mutazione del suo patrimonio genetico. Danneggiamento di una singola base. Rottura di un

filamento (Single Strand Break - SSD). Rottura di entrambi i filamenti (double strand break, DSB). DNA-

DNA crosslinks. I danni al DNA si possono classificare in diverse tipologie: Le rotture a catena singola

(single strand break) i danni di una base azotata, i danni agli zuccheri che fungono da “impalcatura“

sono più facilmente riparabili in quanto danneggiano solo una delle due metà della doppia elica e

quindi la metà sana può funzionare da “stampo”. Le rotture a catena doppia (double strand break o

DBS) ed i cross-link tra le due catene o tra DNA e proteine sono invece molto più difficilmente riparabili

e quindi portano spesso a morte la cellula. In particolare il tipo di danno letale più frequente è il double

strand break.

DNA damage: L’irradiazione a dosi terapeutiche provoca danni di entità notevole al DNA, la maggior

parte dei quali viene riparata con successo da processi cellulari specifici. Riparo cellula normale >>

cellula tumorale . Evidenze sperimentali indicano che la quota di cell-killing è legata sostanzialmente al

numero delle Double Strand Breaks radioindotte, che sono considerate le lesioni critiche. La possibilità

di utilizzare le radiazioni con finalità terapeutiche nella cura dei tumori è in gran parte legata alla

capacità delle cellule sane di riparare i danni al DNA prima e meglio rispetto alle cellule tumorali.

Danno cellulare da radiazioni: La cellula irradiata può andare incontro a morte secondo tre modalità:

Morte litica (immediata per alte dosi), Morte apoptotica («ordinata»), Morte riproduttiva (perdita della

capacità riproduttiva). Cellule proliferanti indifferenziate hanno maggiore radiosensibilità rispetto alle

cellule differenziate mature. La morte litica avviene quando la cellula non è più in grado di svolgere le

attività necessarie per mantenersi in vita. La cellula si rompe e rilascia il suo contenuto all’esterno.

Questa tipologia di morte cellulare provoca infiammazione. La morte in interfase o morte programmata

o apoptosi è una sorta di ‘suicidio’ in cui un danno di per se non letale innesca dei meccanismi attivi

per cui la cellula muore senza rilasciare il suo contenuto ma ‘impacchettandolo’ in modo da non

causare infiammazione. La morte riproduttiva avviene quando la cellula è in grado di mantenersi in

vita ma non di riprodursi. Questo si misura non osservando la cellula singola ma studiando la sua

capacità di crescere nel terreno di coltura.

Curva dose-risposta. Sono impiegate in radiobiologia clinica per correlare la dose somministrata con gli

eventi biologici prodotti. Esempi: curve dose/controllo locale (TCP); curve dose/complicazioni tessuti

sani (NTCP). Posizione e pendenza delle curve forniscono informazioni sulla radiosensibilità di tumore e

tessuti sani. Se da un lato è semplice misurare la sopravvivenza delle cellule in coltura è molto meno

facile misurare gli effetti nei pazienti. Esistono comunque diversi modelli per stimare gli effetti

terapeutici e gli effetti tossici delle diverse dosi di radiazioni. Tali modelli sono basati sia sulla

misurazione degli effetti clinici nei pazienti reali sia su una modellizzazione matematica. Uno dei

contributi fondamentali della radiobiologia può essere quello di stimare correttamente la finestra

terapeutica, ossi ala dose che dà il massimo di probabilità di cura con il minimo di rischio di effetti

collaterali. Con radioterapia si attende un tempo per far riprendere dal danno le cellule danneggiate.

Finestra terapeutica: Le posizione relativa delle curve dose-risposta per il controllo del tumore e per la

comparsa degli effetti radioindotti forniscono una stima della cosiddetta “finestra terapeutica”

(possibilità di somministrare una dose sufficiente con un livello accettabile di effetti acuti e tardivi).

Nel caso ideale (curve B in basso a sinistra) i tessuti sani sono molto più resistenti del tumore (ad

esempio nei tumori seminali del testicolo): è allora facile ottenere una buona possibilità di cura con una

bassa tossicità. Se invece le due curve sono vicine (curve A ,in alto a sinistra) è molto difficile ottenere

sia una buona probabilità di cura che un basso rischio di tossicità. Esiste la possibilità teorica di

utilizzare farmaci radio-sensibilizzanti o radioprotettori per allargare la finestra terapeutica (curve C e

D) purtroppo tale possibilità è difficilmente attuabile in pratica