Patologia Vegetale - Marzia Beccaccioli - Laboratorio per lo studio dei materiali di origine vegetale

Replicazione del DNA

La sintesi è detta semiconservativa. Man mano che la bolla replicativa si apre, le SSB - single strand binding proteins evitano che la doppia elica si richiuda, infatti legano il DNA a singolo filamento e, respingendosi fra di loro, lo tengono aperto.

Il processo di sintesi inizia attraverso la RNA PRIMASI che sintetizza un breve filamento complementare allo stampo, infatti funge da innesco al processo ed il frammento è detto PRIMER che segna il punto di partenza per la costruzione del nuovo filamento di DNA.

Le DNA POLIMERASI hanno proprietà e caratteristiche simili, possono intervenire nel processo replicativo in momenti diversi. La DNA POLIMERASI EPSILON scorre sul filamento master e leggendo il codice aggiunge nucleotidi. Le DNA polimerasi scorrono in direzione 5' -> 3' rispetto al filamento master, e poiché i due filamenti sono complementari, mentre la sintesi di un filamento avviene in modo continuo, per l'altro filamento questa è discontinua.

citoplasma.

In secondo luogo come viene tradotta in proteina l'informazione contenuta nel dna, infatti, il codice del dna costituito da 4 nucleotidi diversi i quali danno origine alla sequenza di amminoacidi della proteina ma i diversi amminoacidi che possono essere contenuti nella sequenza di una proteina sono 20.

Il passaggio da dna a proteina richiede la presenza essenziale dell'acido ribonucleico RNA attraverso il quale l'informazione contenuta nei nucleotidi del dna viene TRASCRITTA e poi TRADOTTA nella sequenza dei 20 amminoacidi della proteina.

Il processo di TRASCRIZIONE inizia con l'apertura di un tratto di dna ovvero solo il gene che deve essere tradotto in proteina si srotola, a questo punto le molecole di mRNA sono assemblate a partire da uno dei due filamenti del DNA.

Nella prima fase, l'RNA polimerasi (complesso enzimatico) riconosce la sequenza del promotore (particolari sequenze nucleotidiche del dna) e si attacca ad esso, e inizia la lettura del

filamento in senso 5’—-> 3’ e sintetizza l’ibrido DNA-RNA, perciò durante la fase di allungamento l’RNA polimerasi comincia a leggere il DNA e appaiare le corrette basi azotate, quindi copia l’informazione contenuta sul DNA in una molecola di RNA messaggero.

Nella fase finale, l’RNA polimerasi incontra sul DNA una sequenza di arresto costituita da nucleotidi, tripletta, che bloccano il processo di trascrizione, quest’ultime sono gli introni che vengono poi eliminiate.

Prima che la trascrizione sia completa, cioè quando l’mRNA è lungo circa 20 nucleotidi, è aggiunto un particolare nucleotide all’estremità 5’ necessaria a far uscire l’mRNA dal nucleo, a questo punto il filamento di mRNA si stacca, abbandona il nucleo, e passa al citosol che compone il citoplasma e si deposita sui ribosomi, i siti della sintesi proteica cioè in cui la fase di TRADUZIONE del messaggio condurrà.

alla sequenza di amminoacidi. Le informazioni contenute nel DNA sono in codice, in particolare, nella molecola di DNA ad ogni tripletta di basi corrisponde un amminoacido. Poiché le basi azotate sono 4 le possibili triplette sono 64 (4^3). Perciò nonostante DNA e RNA contengano solo 4 diversi nucleotidi, la loro combinazione può portare alla sintesi di 20 amminoacidi, ad alcuni dei quali possono corrispondere più triplette.

CODONE - tripletta ad amminoacido corrisponde una volta

triplette - ad una tripletta corrispondono più amminoacidi

Il ribosoma accoglie il mRNA per la traduzione del messaggio avviene nel citoplasma. Il ribosoma, costituito da proteine e RNA, si chiude sul mRNA e scorre di tripletta in tripletta affinché il tRNA possa tradurre il messaggio da un linguaggio espresso mediante acidi nucleici ad uno espresso mediante amminoacidi.

Ogni RNA transfer è costituito da circa 80 nucleotidi legati insieme in una catena con configurazione a trifoglio.

costituenti dei ribosomi, ossia delle strutture nucleoproteiche costituite da due subunità, grazie alle quali avviene la traduzione del mRNA in proteine.

Nelle cellule eucariote le principali componenti del DNA ribosomale sono di 4 tipi: la 18s che va a formare la subunità piccola, la 5.8s, la 28s e la 5s che vanno a formare una unità grande o subunità larga.

Si tratta di regioni del DNA che sono molto conservate, cioè se leggo la sequenza nucleotidica di cui è fatta la 18s la troveremo non troppo diversa tra organismi che appartengono allo stesso genere (phylum - ordine - famiglia - genere - specie......).

Il tratto di DNA ribosomale maggiormente usato per fare barcoding negli eucarioti è non tanto il 18s ma regioni dette ITS (internal transcribe spaces) che mantengono una certa variabilità e sono così diversi tra un individuo e l'altro che sono caratterizzanti a livello di genere, il 18s arriva al massimo al...

Livello di famiglia mentre l'its riesce ad arrivare molto bene al livello di genere, mentre per la specie devo usare un'altra tecnica detta multi locus sequence site. Nei procarioti si trovano invece il 23s 16s e il 5s. Se voglio distinguere una cellula procariote e vedere quante tipologie di cellule e quante cellule ci sono, posso utilizzare il 16s come marcatore perché nelle cellule eucariote non è presente.

PCR: la reazione a catena polimerasi è una tecnica di biologia molecolare che serve per amplificare un frammento di DNA, cioè a partire da un numero di copie ridotte o una singola sequenza. Dopo una PCR si ottengono moltissime copie di quella stessa sequenza. Viene effettuata attraverso un enzima, ossia una DNA polimerasi termostabile, quindi resistente ad alte temperature.

Per effettuare una PCR sono necessari:

• Una provetta nella quale inserire il DNA target che si vuole riprodurre;
• La Taq polimerasi, ossia la DNA polimerasi (Thermus aquaticus), in grado

di vivere ad alte temperature)- due primer per dare avvio alla reazione, si tratta di filamenti di 20-15 nucleotidi che servono da innesco alla reazione, questi si appaiano sulla molecola di dna stampo in particolare tra le due estremità della sequenza che si vuole amplificare. Questi fungono da innesco in quanto per la sintesi di dna ossia per far formare un legame fosfodiesterico tra due nucleotidi contigui è necessario che il nucleotide antecedente abbia un OH libero al 3' del ribosio, con il quale andrà a reagire il fosfato del 5' del ribosio del nucleotide successivo, perciò i primer forniscono l'OH libero al 3' per la sintesi dei nuovi filamenti. La scelta dei due primer è molto importante, vengono identificati in base alla sequenza che voglio copiare, se la sequenza target inizia e finisce con una certa sequenza nucleotidica i primer saranno scritti basandomi sulla complementarietà con la regione di dna che voglio amplificare,