Patologia vegetale

La patologia vegetale ha accelerato la sua ridefinizione e questo grazie all’introduzione di

metodi di diagnostica che sono rapidi e sono ripetibili e soprattutto sono le biotecnologie che

accelerano rapidamente la capacità di creare test diagnostici.

Una delle parti (in termini lavorativi) della patologia vegetale è nella diagnostica, che è

necessaria per indirizzare la lotta contro i patogeni, ma è importante (negli ultimi anni) anche

per quanto riguarda l’aspetto commerciale.

La diagnostica è la capacità di verificare, diagnosticare e identificare i patogeni, ma è anche la

capacità di identificare i microrganismi non solo pericolosi ma anche quelli utili e questo è

fondamentale sia in campo agroalimentare che agroambientale. Vi sono diversi metodi e

strumenti oggi a disposizione dei fitopatologi e grazie a tutte le conoscenze (identificazione

del patogeno, della malattia) è possibile definire appropriate strategie di protezione delle

colture. Il salto evolutivo che fanno in questo tipo di mestiere (di diagnostica) è quello di

isolare i patogeni, andando a capire di che patogeno si tratta e infine il modo corretto di agire

su di esso per eliminare la malattia che causa esso.

Tutta la diagnostica si basa (e si basava nel passato) sul riconoscimento morfologico. Oggi il

riconoscimento morfologico (fondamentale per dare un nome al patogeno) è il primo

passaggio per poi proseguire con i passaggi successivi.

Ma come faccio a capire se la malattia è eFettivamente malata (potrebbe essere malata a

causa di un attacco patogenico oppure perché è soggetta ad un’alterazione non parassitaria)?

Per comprendere al meglio, prima di tutto è fondamentale andare a distinguere l’azione

parassitaria da quella non parassitaria.

Il primo passaggio che si fa è l’osservazione dello spettro dell’ospite: si riferisce all’insieme

di specie vegetali che un determinato patogeno è in grado di infettare. Alcuni patogeni hanno

uno spettro ristretto (malattie parassitarie), cioè infettano solo una o poche specie

specifiche, mentre altri (malattie non parassitarie) hanno uno spettro dell’ospite ampio e

possono infettare molte specie diverse.

Dopodiché vado a vedere i sintomi, cioè come sono distribuiti questi:

Nella malattia non parassitaria: in una coltura, la distribuzione del sintomo sarà molto

è uniforme, ovvero tutti gli individui in quella coltura presentano lo stesso sintomo.

Nella malattia parassitaria: in una coltura, la distribuzione del sintomo è random

è (almeno all’inizio) per molte malattie delle parti aeree e per quelle trasmesse da

materiale da riproduzione (semi per esempio). La distribuzione può essere anche a

chiazze per le malattie telluriche

Successivamente vado a studiare l’evoluzione della malattia:

Nella malattia non parassitaria: molto rapida, infatti la carenza di acqua e nutrienti,

è determina il sintomo nell’arco di pochi giorni

Nella malattia parassitaria: è molto lenta e irregolare perché ci sarà resistenza da parte

è della pianta che andrà a rallentare l’evoluzione della malattia

Dopodiché vado a vedere i segni dei sintomi, ovvero le alterazioni morfologiche che possono

essere ricondotte direttamente alla presenza di un patogeno (presenza di essudati, marciumi

sulle foglie). I segni caratteristici del patogeno sono quelli che si manifestano dopo che

l’infezione sta facendo il suo corso (il patogeno sta nella fase di contaminazione):

Nelle malattie non parassitarie: non noto nessun segno

è Nelle malattie parassitarie: possono essere presenti o espressi dopo l’incubazione di

è reperti sintomatici

Ultimo passaggio è comprendere la diFusione della malattia:

Nelle malattie non parassitarie: la diFusione è connessa a un fattore irritante

è discontinuo, senza diFusione secondaria. La diFusione del sintomo nell’arco di tempo

breve sarà randomica, non costante.

Nelle malattie parassitarie: la diFusione è legata alle condizioni ambientali, cioè se le

è condizioni sono favorevoli al patogeno, la diFusione è costante.

Una volta capito questo, si prosegue alle indagini successive, ovvero la diagnosi classica e

ogni phylum ha il suo metodo diagnostico. Tipicamente si distinguono per diagnosi:

1. Virus (vanno a “rompere le scatole” al trasporto dei nutrienti e causano un blocco nel

trasferimento dei nutrimenti e quindi ci sarà riduzione di crescita, e carenze

nutrizionali): diagnostica classica mediante l’osservazione dei sintomi

2. Batteri: attraverso isolamenti in piastre sterili, con l’osservazione delle colonie, ovvero

andare ad osservare la forma, la superficie, il margine di accrescimento, l’odore

(caratteristiche diFerenti per ogni batterio)

3. Oomiceti/funghi: anche qui posso fare isolamenti in piastre sterili

È però fondamentale non basarsi solamente sulle caratteristiche morfologiche che spesso e

volentieri possono essere ingannevoli e questo perché i batteri, i funghi possono crescere in

modo diverso, in terreni diversi, possono essere non isolabili e quindi rischio di dare dei

risultati falsi in diagnosi. E allora si procede con la diagnosi molecolare, ovvero l’insieme di

tutte quelle tecniche che individuano il patogeno nel campione vegetale attraverso il

riconoscimento del suo acido nucleico, andando appunto ad estrarre il suo DNA. Cioè vado

appunto ad estrarre il DNA, l’RNA, le proteine, dagli organismi per individuare i tratti

caratteristici che mi associno quel pezzo di DNA/RNA a un microrganismo.

Questo utilizzo di acidi nucleici si è evoluto ovviamente nel tempo, ma di contro, maneggiare

gli acidi nucleici è un processo molto delicato che necessita di personale qualificato e di

apparecchiature all’avanguardia.

Prima di tutto è necessario separare gli acidi nucleici dal resto delle molecole presenti nei

tessuti della pianta, ed esistono diverse tecniche i cui risultati variano per purezza

dell’estratto, concentrazione dell’acido nucleico ottenuta e la complessità del metodo di

estrazione. La scelta del metodo più adatto deve essere eFettuata considerando le

caratteristiche dell’analisi che poi verrà eFettuata.

Per quanto riguarda la diagnosi molecolare dei funghi e batteri: si fa l’estrazione del DNA dal

nostro campione e successivamente si fa l’amplificazione del DNA con dei primer facendo la

PCR. Vado quindi ad individuare dei primer che vanno a pescare una regione specifica del

DNA del patogeno. Infine, prendo ciò che ho amplificato e lo vado a sequenziare. Ciò che

ottengo lo devo inserire in una banca dati per andare a dare un nome al patogeno (inserisco la

sequenza e chiedo al software di cercare la sequenza, tra tutte le sequenze che ha e alla fine

mi darà un nome). Il sequenziamento che viene usato è la Nanopore attraverso il MinION e

nell’arco di poche ore otteniamo il risultato.

VIRUS e VIROIDI

Viroidi

à

Dobbiamo fare una distinzione tra virus e viroidi. I viroidi sono i patogeni più piccoli, li

possiamo definire come delle sotto parti di un virus (più piccoli del genoma dei virus). Sono

essenzialmente degli RNA autoreplicanti e sono presenti solo (probabilmente) nel mondo

vegetale e sono costituiti da RNA a singolo filamento, a basso peso molecolare.

L’RNA è a forma circolare e altamente strutturato, e a diFerenza dei virus, i viroidi non hanno

un capside proteico (rivestimento proteico che protegge il loro genoma) e non codificano per

proteine.

Theodor Otto Diener scoprì nel 1971 i viroidi. Identificò questo nuovo tipo di agente patogeno

nelle piante diverso dai virus. Diener inoltre vide che nonostante il trattamento con proteasi (e

lipasi) la capacità patogenica rimaneva costante.

Vi sono delle teorie/ipotesi riguardanti i viroidi:

1. Potrebbero essere dei fossili di quello che è stato l’origine della vita, basata

sull’RNA

Sono originati dagli introni (regioni non codificanti di un gene) di geni di piante,

durante il processo evolutivo (si tratta della teoria di Diener)

I viroidi interferiscono con il processo di maturazione dell’RNA ma anche con il processo di

espressione dell’RNA, andando a interferire con il sistema dell’RNA interferente.

Sono caratterizzati da:

Elevata complessità interna tra le basi (tendono a formare strutture secondarie)

è Non codificano per nessuna proteina

è Anche se sono autoreplicanti, non riescono ad autoreplicarsi al di fuori dell’ospite

è (sono come dei parassiti obbligati)

L’incremento della loro replicazione e dei sintomi è correlato all’intensità luminosa,

è alla temperatura (agli agenti atmosferici e naturali)

Possono causare:

Malattie gravi

è Malattie impercettibili

è

I viroidi li distinguiamo in base alla forma che assumono, poiché sviluppano delle strutture

secondarie che possono assumere diverse forme

- Bastoncello = singola elica che si ripiega su sé stessa grazie alla complementarità tra

le basi

- Quasi bastoncello

- Ramificato = complessa e irregolare

Vi sono 5 domini strutturali, sequenze ripetute in tanti viroidi:

1. Centrale conservato (CCR): dominio più conservato tra i viroidi ed è cruciale per la

replicazione dell’RNA viroide

2. Patogenico (P): è responsabile della virulenza della patogenicità del viroide. La sua

sequenza può influenzare il livello di gravità dei sintomi nella pianta ospite

3. Variabile (V): mostra maggiore variabilità tra le diverse specie di viroidi. Svolge un

ruolo fondamentale nella regolazione della replicazione e nella capacità del viroide di

adattarsi a diversi ospiti

4. Terminale destro (TR): facilita il movimento del viroide nelle cellule vegetali. Cruciale

per il trasporto sistemico del viroide all’interno della pianta, permettendo al patogeno

di diFondersi attraverso il sistema vascolare

5. Terminale sinistro (TL): è coinvolto nel movimento del viroide da una cellula all’altra.

Gioca un ruolo importante nel riconoscimento da parte delle proteine delle piante che

facilitano il trasporto attraverso i plasmodesmi

Nelle altre strutture secondarie di forma ramificata, vi è la presenza di strutture a “testa di

martello” che funzionano come ribozimi, ovvero sequenze di RNA capaci di agire come

catalizzatori biologici.

Possiamo dividere i viroidi in:

1. Pospiviroidae: assenza di ribozimi, hanno struttura bastoncellare, si accumulano e

replicano nel nucleo. Classificati a loro volta in:

- Pospiviroidi

- Hostuviroidi

- Cocadviroidi

- Apscaviroidi

- Coleviroidi

2. Avsunviroidae: vi è la presenza di ribozimi a forma di testa di martello e si accumulano

e replicano nei cloroplasti e a loro volta possono essere classificati in:

- Avsunviroid

- Pelamoviroidi

- Elaviroid

La replicazione può avvenire a seconda di quale gruppo viene considero:

1. Pospiviroidae: si replicano nel nucleo delle cellule vegetali. La replicazione inizia con

la produzione di un intermedio a doppio filamento dell’RNA viroidale, mediato da

un’RNA polimerasi dell’ospite. L’RNA viroidale agisce come un modello pe la sintesi di

un filamento complementare. Continua poi con il meccanismo di rolling circle e qui il

filamento di RNA viene replicato in un lungo RNA concatenato. La catena lunga viene

poi tagliata in singole unità circolari, un processo che avviene grazie alla scissione

autocatalitica di alcune sequenze RNA attraverso strutture a forcina (strutture

secondarie). Le molecole di RNA circolari risultanti possono quindi infettare altre

cellule, continuando il ciclo di infezione.

2. Avsunviroidae: si replicano dei cloroplasti delle cellule vegetali. La replicazione inizia

con la sintesi di un intermedio a doppio filamento che serve come matrice per la

replicazione.Anche qui c’è il rolling circle, ma la formazione del lungo RNA

concatenato avviene in un ambiente cloroplastico. Questi viroidi hanno strutture a

testa di martello che funzionano come ribozimi, che catalizzano la scissione dell’RNA

in forme circolari infettive. Il risultato finale è una serie di molecole di RNA circolari che

possono quindi infettare altre cellule vegetali.

I viroidi si possono trasmettere con diverse modalità:

- Contatto diretto tra le piante

- Uso di strumenti contaminati

- Propagazione attraverso vettori

I viroidi hanno una capacità di movimento attraverso i plasmodesmi, e appunto per spostarsi,

usano le proteine dell’ospite.

I sintomi causati dai viroidi (simili a quelli dei virus):

- Riduzione dello sviluppo: la taglia potrebbe essere ridotta rispetto alle piante sane

- Alterazione del colore e morfologia: macchie necrotiche, macchie clorotiche

- Diminuzione della produzione

- Morte della pianta (in casi gravi)

Sono parassiti del genoma e interferiscono con la replicazione, la trascrizione e la traduzione

dell’RNA. Sono in grado di accendere il meccanismo dell’RNA interferente. È un

silenziamento genico, sistema che le cellule eucariotiche utilizzano per controllare

l’espressione dei propri geni. Le cellule producono RNA interferenti (piccoli) che attivano il

sistema di silenziamento genico e vanno ad interferire con i processi di trascrizione e

traduzione di alcuni mRNA nel momento in cui la cellula decide di spegnere quell’RNA

(perché magari la cellula ne ha accumulati troppi). Cosa attiva il silenziamento genico? Gli

RNA che non servono tendono a complementare le proprie regioni, formando delle strutture a

doppio filamento. Questo è il campanello d’allarme che attiva il sistema di silenziamento.

I viroidi possono essere diagnosticati attraverso i saggi biologici ( la diagnosi biologica,

consente il rilevamento della presenza di un patogeno in un campione, grazie alla sua

infettività) su piante indicatrici erbacee e legnose e si tratta di una diagnosi indiretta.

Possiamo anche fare la diagnosi attraverso sierologia, microscopia e attraverso le tecniche

molecolari (la diagnosi molecolare si basa sull’estrazione dell’RNA e attualmente si fa questa

diagnosi attraverso la RT-PCR e la qRT-PCR) e si tratta di diagnosi diretta.

Per quanto riguarda il controllo delle malattie causate dai viroidi, non vi sono i viroicidi per

appunto lottare o controllare l’infezione, ma quello che si può fare è sicuramente cercare di

prevenire.

Virus

à

Agenti infettivi microscopici che presentano caratteristiche uniche che li distinguono dagli

organismi cellulari. Sono composti da materiale genetico (RNA o DNA) racchiuso in un

rivestimento proteico chiamato capside. Sono generalmente molto più piccoli delle cellule

con dimensioni che variano da 20 a 300 nanometri. Il materiale genetico può essere a singolo

o doppio filamento e possono avere un genoma a RNA o DNA che può essere lineare o

circolare.

Sono nucleoproteine ovvero entità che hanno un genoma codificante racchiuso in uno o due

strati di capsula. Il genoma codificante trascrive per alcune proteine (tipicamente non danno

enzimi idrolitici), non producono tossine anche se possono produrre tossine (soppressori di

immunità virale) che interferiscono con il sistema dell’RNA interferente.

Si classificano in base all’acido nucleico e possono essere bastoncellari, isometrici,

poliedrici e altri sono bacilliformi, cilindrici.

Non possono replicarsi autonomamente, hanno bisogno di una cellula ospite per replicarsi e

produrre nuovi virus. Questa “dipendenza” li classifica come parassiti obbligati.

Il ciclo di replicazione comprende diverse fasi come l’adsorbimento, la penetrazione, lo

svuotamento della capsula, replicazione del materiale genetico, sintesi delle proteine virali,

assemblaggio e rilascio. Questo processo consente ai virus di moltiplicarsi e infettare altre

cellule contribuendo alla diFusione dell’infezione.

Causano la malattia attraverso l’uso di sostanze cellulari durante la riproduzione e alterano i

processi cellulari.

Si tratta di un VIRUS dato che possiamo leggere “genoma RNA” e possiamo subito notare la

decolorazione a macchie, chiamato mosaico. È un virus a RNA e la pianta attaccata è il

tabacco e quindi si tratterà di tabacco mosaic virus (virus del mosaico del tabacco). Si tratta

di un virus bastoncellare (immagine D) e la proteina di movimento MP viene codificata da

ORF 4 ed è responsabile del trasporto del genoma virale da una cellula all’altra. Abbiamo

anche la proteina del capside CP che ha il compito di assemblare e formare il capside virale,

struttura che avvolge e protegge l’RNA virale. Il capside superavvolge il filamento a RNA

positivo (RNA positivo= genoma a RNA che può essere tradotto direttamente dalle proteine

virali; RNA negativo= è uno “specchio” e si trova nell’RNA positivo. È una prima copia replicata

per replicare il l’RNA positivo) a singolo filamento.

Parte dai semi infatti (può però rimanere intatto nel tabacco incombusto dovuto alle sigarette

gettate. Può essere mangiato da insetti che poi possono essere dei vettori). Dal seme poi si

propaga e rimane all’interno dei tessuti e nella fase iniziale, latente, rimane nel germinello

(primo stadio della crescita dell’embrione della pianta che si sviluppa dalla semina fino a

diventare una pianta giovane).

Inizia poi a crescere per via sistemica, infetta vasi e le cellule floematiche. Mediante proteine

di movimento del gruppo 30K (classe di proteine virali che facilitano il trasporto del virus da

una cellula vegetale all’altra e il 30K fa riferimento alla loro massa molecolare

approssimativa), passa attraverso plasmodesmi (canali citoplasmatici che connettono le

cellule adiacenti nelle piante) da cellula a cellula, infettando tutte le foglie. Per prima cosa si

formano delle lesioni a V e dal parenchima che necrotizza, torna nello xilema e inizia

l’infezione sistemica della pianta. Può trovarsi nuovamente nell’ovario fiorale e nei semi,

oppure sopravvive nelle foglie che cadono e viene disperso attraverso piogge e wather splash

e mediante le radici penetra e incomincia di nuovo il ciclo d’infezione. Posso intervenire

mediante il controllo delle sementi (uno dei metodi di controllo di prevenzione) e questo

consente di abbassare il potenziale di inoculo.

BATTERI

I batteri sono organismi unicellulari ed eucarioti, ma possono raggiungere un grado di

organizzazione diverso quando formano certi tipi di colonie. Hanno una parete e/o membrana

(il costituente base è il peptidoglicano) con materiale genetico non circondato da una

membrana; infatti, il DNA è libero nel citoplasma, nella regione chiamata nucleoide. Hanno il

citoplasma con ribosomi di tipo 70s (unità di sedimentazione che misura quanto

velocemente la molecola si muove in una centrifuga) e a loro volta sono costituiti da due

subunità, 30s e 50s.

Quando un ceppo batterico infetta una pianta e altri ceppi della stessa specie, prende il nome

di pathovar di quella specie.

Abbiamo una distinzione tra i batteri gram-negativi e i batteri gram-positivi. I primi presentano

un involucro costituito da membrana citoplasmatica, una sottile parete cellulare, una

membrana esterna e un periplasma (compartimento compreso tra la membrana

citoplasmatica e la membrana esterna). Per quanto riguarda i batteri gram-positivi, hanno

solo una membrana citoplasmatica e una spessa parete cellulare. Questa distinzione è

fondamentale perché ha consentito lo sviluppo di una colorazione specifica, ovvero la

colorazione Gram. Questa è stata messa a punto nel 1884 da Christian Gram ed è basata

sull’utilizzo di due coloranti, il Cristal violetto e la Safranina. Essi ci permettono di mettere in

evidenza i batteri i gram-negativi (rosa/violetto) e gram-positivi (blu):

Positivi: rimangono colorati di blu o viola dopo aver subito la colorazione di Gram. I

è batteri Gram-positivi sono in grado di trattenere la colorazione del Cristal violetto a

causa dello strato di peptidoglicano presente nella loro parete cellulare.

Negativi: non trattengono la colorazione di Gram perché hanno uno strato sottile di

è peptidoglicano interposto tra una membrana esterna a bilayer lipidico con LPS-

periplasma di mureina ed una membrana interna.

Alcuni batteri presentano il glicocalice che è un polimero gelatinoso costituito da proteine o

polisaccaridi. Se è ben organizzato viene chiamato capsula se non lo è, viene chiamato

strato mucoso.

I batteri possiedono anche delle strutture esterne:

- Flagelli: appendici lunghe e sottili, necessari per la locomozione. In funzione della loro

presenza e disposizione abbiamo i batteri:

a. Monotrichi: un solo flagello

b. Polari: flagelli alle due estremità

c. Peritrichi: distribuiti sull’intera superficie

- Fimbrie: appendici brevi e sottili ai poli o sull'intera superficie del batterio e

favoriscono l'adesione

- Pili: costituiti da pilina e sono coinvolti nella coniugazione o nel trasferimento dei

fattori di virulenza nelle cellule delle piante ospiti

La maggior parte dei batteri ha la forma bastoncellare, ma abbiamo una classificazione dei

batteri in base alla loro forma:

- Cocchi: sfere

- Bacilli

- Spirilli: spirale

- Vibrioni: virgola

I batteri fitopatogeni bastoncellari si riproducono asessualmente mediante il processo di

scissione binaria o fissione (la cellula madre è uguale alla cellula figlia e ci sarà poca

variabilità durante questa riproduzione). Questa avviene mediante una crescita verso

l’interno della membrana cellulare formando una membrana trasversale che divide il

citoplasma in due parti uguali. Due strati di parete cellulare continui con la parete esterna

sono poi sintetizzati tra i due strati di membrana. In condizioni favorevoli i batteri si dividono

ogni 20-50 min, in tal modo da 1 batterio se ne possono formare 10 in 24h

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Come si produce la variabilità nei batteri? Nella riproduzione asessuale, che avviene per

mitosi, si ha una bassa percentuale di variazione di informazione genetica, che è dovuta

principalmente a fenomeni di errori di replicazione e a rari eventi di crossing over mitotico

Nei batteri però esistono dei meccanismi di variabilità attraverso processi pseudo-sessuali

1. La coniugazione. Richiede contatto tra 2 batteri diversi che scamb