Ospiti e vettori di espressione

OSPITI E VETTORI DI ESPRESSIONE

Mercoledì 3 marzo 2021

Gli ospiti di espressione possono essere cellule eucariotiche o

 cellule procariotiche:

Procarioti :

Escherichia coli (ceppi specifici, ad es. BL21)

Bacillus subtilis (Gram+)

Eucariotici :

Saccharomyces cerevisiae (lievito)

Cellule di insetto (Sf9) richiedono infezione con baculo



virus

Cellule di mammifero in coltura (CHO etc.)

Animali transgenici

Piante transgeniche

Le cellule di espressione batteriche sono preferiti perché facili

 da usare, producono dei livelli di sovra espressione elevati,

possiamo controllare la produzione di proteasi e quindi ridurre il

tasso di proteolisi a cui possono essere soggette le proteine

che stiamo esprimendo e non posseggono delle modificazioni

post traduzionali che possono essere un vantaggio o uno

svantaggio a seconda della struttura e funzione della proteina

che vado a produrre se queste modificazioni sono

indispensabili per la proteina devo utilizzare un altro

organismo.

PS: Si parla di sovra espressione tutte le volte in cui si

raggiungono dei livelli di produzione della proteina target che

sono maggiori di quelle naturalmente prodotte nell’organismo di

presenza o quando in generale i livelli di produzione sono più

elevati rispetto a qualunque proteina presente nel proteoma del

ceppo ospite.

Posso utilizzare un sistema di tipo eucariotico in cui sono

 presenti modificazioni post traduzionale ma non è detto che un

organismo semplice come Saccharomyces cerevisiae possa

riprodurre fedelmente una modificazione che avviene

tradizionalmente in una cellula vegetale o in una cellula di

mammifero. Negli eucarioti inoltre è migliorata la caratteristica

di solubilità. La resa di produzione però potrebbe essere più

bassa a causa della presenza di proteasi e i tempi di

produzione sono molto più lunghi (tempi di duplicazione

maggiore)

Per altre proteine si ricorre alla fonte naturale (nativa) cui il

 consumo di risorse materiali e di tempo è ancora maggiore.

Gerarchia: batteri, lievito, cellule di insetto, Hela (mammifero),

 tessuto naturale.

Per i vettori ho la possibilità di utilizzare vettori adeguati alla

 sovra espressione di proteine in cellule di E. coli uno di questi

è il sistema Novagen pET (famiglia di vettori che funzionano

allo stesso modo).

Questi vettori hanno dei promotori (promuovono la trascrizione

 del gene target) molto forti derivati da virus ( promotori T7) il

gene codificante per la proteina di interesse si trova sotto il

controllo di un promotore che viene riconosciuto da una RNA

polimerasi di tipo virale (T7 RNa polimerasi) mentre quella delle

cellule batteriche non li riconosce. Sono forti perché riescono a

produrre una elevata quantità di RNA messaggero che darà

luogo a livelli di sovra espressione elevati

Sistema pET contengono tutti alcuni elementi

 

Il ceppo di E. coli in cui si usa il sistema pET è ingegnerizzato

 perché in queste cellule non troviamo naturalmente espressa la

T7 RNA polimerasi la si fa produrre in modo inducibile.

Abbiamo un elemento che deriva dal genoma virale (porzione

 DE3) in cui è presente il gene che codifica per la T7 RNA

polimerasi che poniamo sotto il controllo del promotore lac che

dipende a sua volta dalla produzione di un repressore che

impedisce l’interazione dell’RNA polimerasi con la regione DE3.

Quando interrompo la produzione del repressore ho la

 possibilità di dar luogo alla trascrizione, per opera dell’RNA

polimerasi di E. coli del gene della T7 RNA polimerasi.

L’induzione di questo sistema avviene ancora una volta

 utilizzando lattosio oppure un analogo con IPTG (isopropil

tiogalattoside) con di nuovo la differenza che l’IPTG non è

metabolizzabile quindi posso usare sempre le stesse molecole.

Il lattosio invece è consumato dalle cellule quindi devo

continuare ad aggiungerlo.

Perché venga innescata la sintesi della proteina di interesse

 quindi il ceppo deve contenere l’elemento DE3 che proviene

dal fago e che contiene il gene per la T7 RNA polimerasi. I

ceppi che fanno ciò sono un prodotto novagen e sono i più

diffusi per la produzione di proteine ricombinanti questi ceppi

si chiamano BL21 (cellule di E. coli BL21(DE3) )

Possiamo utilizzare un pET -21 anche come vettore di clonaggio

 lo utilizziamo in DH5alpha e non utilizziamo mai l’ospite



BL21 per operazioni di clonaggio e mantenimento. Quando

utilizziamo pET 21 come vettore di espressione lo traferiamo in

cellule BL21 (ospite di espressione) e posso usare delle

strategie di induzione. Ad esempio posso utilizzare condizioni in

cui promuovo la formazione di biomassa e poi avere una fase

in cui aggiungendo IPTG do inizio alla fase di espressione vera

e propria.

Uno dei motivi per cui è conveniente utilizzare un sistema di

 tipo inducibile invece che uno di tipo costitutivo è il fatto che io

possa produrre una biomassa (cioè fare in modo che le cellule

di E. coli si dividano e ottenere un coltura ad alta densità) e poi

fare un’induzione molto breve le cellule esprimono la

proteina di interesse fino ad un determinato livello e man mano

che la esprimono andranno incontro a lisi cellulare (ma a noi

non importa perché ci interessa la proteina).

La sovra espressione di una proteina target a livelli elevati

 (consentiti ad esempio dalle T7 polimerasi) sono spesso

incompatibili con la vita del ceppo ospite.

Il vettore pET 21 è solo uno della famiglia dei vettori pET e

 alcuni dei plasmidi di questa famiglia hanno una sequenza

segnale che rende possibile l’esporto del periplasma è una

sequenza che si trova all’inizio, nella regione N terminale di

alcune proteine tipicamente secrete nel periplasma d cellule di

E. coli.

Per la secrezione si può quindi usare una strategia con una

 sequenza segnale o attuare il clonaggio nel plasmide di

espressione giusto che consenta di porre il gene di interesse in

frame rispetto al peptide leader (deputato all’esportazione

della proteina di interesse).

Perché può essere opportuna la strategia basata sulla

 secrezione? per portare la proteina fuori da un ambiente

 degradazione

cellulare in cui potrebbe essere soggetta a ,

ambiente ossidante

perché l’ è più mentre quello

intracellulare è riducente e potrebbe ad esempio impedire la

formazione di ponti di solfuro che magari stabilizzano la

struttura della proteina, perché le proteine di interesse

effetto tossico.

potrebbero produrre un

Gli svantaggi associati all’utilizzo della sequenza leader/

 segnale invece dipendono da un effetto di diluzioneanziché

trovare la proteina over espressa nel citoplasma ce l’ho diluita

nel mezzo di coltura. Un ulteriore svantaggio dipende

dall’efficienza di traslocazione, cioè l’efficienza con cui la

proteina passa dall’essere tradotta nel citoplasma ad essere poi

asportata nel periplasma e infine all’esterno.

TAG = elementi indicati nei vettori, elemento accessorio che

 posso porre in frame rispetto alla sequenza codificante per la

proteina di interesse e si può trovare all’N o al C terminale. Ho

la possibilità di produrre un’unica molecola di RNA che non

contenga degli stop codon e che consente di tradurre la

sequenza dell’RNA in un’unica sequenza polipeptidica in cui sia