Microbiologia ambientale

R L

termina a tR1 con produzione di cro, e a a tL1 con produzione della proteina N;

●​ fase precoce ritardata, la proteina N previene la terminazione a t e t permettendo

R1 L1

l’espressione di cII, cro, Q, cIII, xis e int. La decisione tra lisi e lisogenia dipende

dall’accumulo della proteina cII, che viene facilmente degradata da proteasi cellulari,

che sono il prodotto del gene hfl. Il sito cIII protegge cII dalla degradazione.

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Si ha lisogenia quando si accumula Si ha lisi quando cII è degradata, per cui

sufficiente cII, che si lega a P , attivando l’RNA polimerasi è incapace di iniziare la

RE

la trascrizione di cI, e a P , attivando la trascrizione da P o P , e la trascrizione

I RE I

trascrizione di int. continua da P e P .

L R

In successione: In successione:

●​ accumulo di cI (inibitore ●​ produzione di cro (inibitore

trascrizionale); trascrizionale) e Q;

●​ cI si lega a O e O reprimedno la ●​ Q previene la terminazione a t ,

R L R2

produzione delle proteine precoci e con espressione dei geni per le

l’espressione dei geni per il ciclo proteine strutturali da P ;

late

litico; ●​ cro lega O e O e reprime la

R L

●​ cI, per sopperire alla mancanza di produzione degli mRNA precoci;

cII attiva la propria espressione da ●​ Q è presente in quantità sufficiente

P ; da garantire la produzione dei

RM

●​ accumulo di integrasi. messaggeri tardivi.

Il repressore di cI di Lambda è una proteina di 236 aa in forma

dimerica, con 2 domini globulari connessi da un braccio. Il dominio

N-terminale costituisce il sito di legame all’operatore e il dominio

C-terminale è responsabile della formazione del dimero. Il repressore

è capace di legarsi al DNA solamente come dimero.

La scelta tra il ciclo litico e il ciclo lisogenico avviene a livello della regione di immunità

P /O . In questa regione è presente il promotore P per la trascrizione di cro e degli altri geni

R R R

verso destra, e il promotore P , orientato verso sinistra, per la trascizione di cI.

Rm

Sovrapposte ai due promotori vi sono le sequenze di tre siti operatori O , O , O : le

R3 R2 R1

sequenze sono molto simili tra loro ma non identiche. I tre operatori vengono riconosciuti sia

dalla proteina cro che dalla proteina cI ma con diversa affinità.

La proteina cro si lega con affinità decrescente a O (fase precoce) bloccando il promotore

R3

P e la sintesi del repressore di cI, dunque si lega a O e O , come pure a P e O , la

Rm R2 R1 L L

trascrizione dei geni precoci e attivando la trascrizione di P , che porta alla via litica. A

R

questo punto vengono trascritti solo i geni tardivi responsabili della sintesi della testa e della

coda.

Il repressore cI fa l’opposto, quindi si lega a partire da O interrompendo la trascrizione di

R1

P verso destra (controllo negativo) e quindi la sintesi di cro, poi altri dimeri di cI si legano a

R

O grazie al legame di cI in posizione O (legame cooperativo), così da attivare la

R2 R1

trascrizione di cI stesso (regolazione autigena). Con la repressione dei geni precoci, cI è

prodotta esclusivamente da P . L’unico gene a essere trascritto è il gene cI. Fintanto che il

Rm

repressore cI è presente in concentrazioni adeguate viene assicurato il blocco a livello di

P /O e P /O e viene mantenuto lo stato lisogenico. La continua trascrizione di cI assicura il

L L R R

mantenimento dello stato lisogenico, un eccesso di cI viene ricondotto alla norma grazie al

legame in posizione O .

R3

La ricombinazione sito-specifica è un meccanismo molto preciso e fondamentale per

integrare il DNA del fago Lambda nel cromosoma batterico (E. coli). La proteina Int,

ricombinasi della famiglia delle tirosina ricombinasi, catalizza la ricombinazione sito-specifica

tra due sequenze molto simili:

●​ attP, il sito di attacco sul DNA del fago;

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Int si lega ai siti attP e attB con l’aiuto di una proteina accessoria batterica chiamata IHF

(Integration Host Factor). Int taglia in modo preciso il DNA a livello dei due siti e scambia i

segmenti, ricombinandoli: il DNA del fago viene inserito nel cromosoma batterico e si

formano due nuovi siti chiamati attL (left) e attR (right). In pratica, Int incolla con precisione il

DNA del fago dentro quello del batterio, come se facesse un "taglia e incolla" molecolare. Se

poi il fago vuole uscire, ad esempio per passare alla fase litica, serve anche un'altra

proteina, chiamata Xis, che favorisce l'escissione del fago.

La presenza del repressore all’interno del batterio lisogeno spiega anche il fenomeno

dell’immunità alla superinfezione, ovvero un batterio lisogeno per Lambda non viene

ucciso da ulteriore infezione di altri fagi Lambda presenti nell’ambiente (ma può sempre

essere infettato da fagi diversi da Lambda). I dimeri di cI presenti nel batterio lisogeno si

legano immediatamente ai siti O /P e O /P del DNA infettante bloccando la trascrizione dei

R R L L

geni precoci. Il repressore codificato dal profago blocca la trascrizione dei geni precoci del

DNA infettante legandosi a O /P e O /P .

R R L L

L’induzione del ciclo litico rappresenta una risposta a fattori ambientali, come luce UV,

sostanze chimiche ad azione mutagena che danneggiano il DNA dell’ospite. La cellula di E.

coli ha una risposta SOS molecolare, che è correlata all’aumento della concentrazione della

proteina RecA, che normalmente è responsabile della ricombinazione genetica. Ad alta

concentrazione, RecA interagisce con CI stimolando l'attività autoproteolitica del dominio

C-terminale: il risultato è la rottura di cI che si separa nei due domini N-terminale e

C-terminale. Non si possono formare dimeri di repressore, i soli domini N-terminali non sono

capaci di legarsi agli operatori in modo efficace e nel giro di poco tempo non è più presente il

repressore funzionale.

A volte il virus integrato nel cromosoma batterico, durante la fase di escissione, può

escindere in modo errato, per cui il fago porta con sé un pezzo del cromosoma batterico per

errore. I fagi trasducenti inoculano nei batteri anche questi pezzetti di DNA batterico, dando

vita al fenomeno della trasduzione specializzata.

La conversione lisogena si ha quando un fago temperato, una volta integrato nel genoma

del batterio, modifica il fenotipo del batterio ospite, cioè gli dà nuove proprietà.

I batteriofagi ΦX174 e M13 fanno parte della classe II della classificazione di Baltimore.

Sono batteriofagi con DNA a singolo filamento, ΦX174 è icosaedrico e M13 è filamentoso. Il

genoma che permette il processo di replicazione è circolare, per cui è necessario il

passaggio da DNA a singolo filamento a DNA a doppio filamento.

Il fago Φ174 è una particella molto piccola di circa 25 nm con genoma circolare, l’elemento

strutturale è una singola proteina che è presente in 60 copie, che sono unite ai vertici

dell'icosaedro con altre proteine formanti le protuberanze. Possiedono solo una limitata

quantità di informazione genetica (5.386 bp nel DNA a singolo filamento), e per la

replicazione usano il macchinario di replicazione del DNA dell'ospite. In funzione del genoma

ridotto presentano il fenomeno della sovrapposizione genica: i geni producono proteine

sovrapponendosi gli uni sugli altri, per cui la trascrizione avviene su regioni sovrapposte una

sull’altra. La proteina A* è codificata dal gene della proteina A, che serve per l’escissione dei

concatameri, la proteina A* inibisce la sintesi del DNA dell’ospite; la proteina E è necessaria

per la lisi batterica (inibizione dell'enzima coinvolto nella biosintesi della parete).

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La replicazione del genoma di ΦX174 avviene secondo 3 fasi:

●​ θ, si parte dal DNA a singolo filamento per sintetizzare il doppio filamento di DNA

tramite una prima sintesi del filamento mancante, processo che coinvolge gli enzimi

cellulari primasi, DNA polimerasi I e III, ligasi e girasi. Termina con la produzione di

forme replicative (RF) di DNA a doppio filamento, che vengono replicate con

formazione di una forchetta replicativa in senso bidirezionale;

●​ σ, replicazione rolling circle (cerchio rotante) con formazione di concatenameri, che

comprendono più unità genomiche del fago legate tra loro;

●​ escissione dei concatenameri a singolo filamento (proteina A) e circolarizzazione dei

genomi fagici, assemblaggio e lisi cellulare (proteina E).

I batteriofagi M13 hanno struttura filamentosa (filamento lungo e sottile di 880 nm di

lunghezza e 6,6 nm di larghezza) con genoma a singolo filamento di DNA costituito da 6,4

kb che codificano per 11 geni, alcuni sovrapposti anche se non in modo così evidente.

Infettano E. coli, sono maschio-specifici perché penetrano nella cellula ospite attraverso il

pilo sessuale. Il gene VIII codifica per la proteina strutturale maggiore p8, che forma una

struttura tubulare di 2700 subunità identiche; il gene III codifica per la proteina strutturale

minore p3, che presenta 3-5 copie localizzate all'estremità del capside e permette il legame

al pilo sessuale.

La replicazione del genoma di M13 avviene secondo diverse fasi:

●​ θ, replicazione del DNA e formazione della forma replicativa (RF) dsDNA, con inizio

della trascrizione e traduzione dei geni virali;

●​ σ, replicazione rolling circle con produzione singolo filamento e circolarizzazione;

●​ la proteina pV riveste il genoma di M13 (+) dalla degradazione, e questo si dirige

verso la membrana, dove la proteina pVI e altre proteine formano il poro di

fuoriuscita. La cellula batterica non viene distrutta ma il virus esce gemmando dal

poro;

●​ la proteina pV è rimossa e la proteina principale pVIII a altre ricoprono il DNA mentre

interagisce con la membrana e fuoriesce. La proteina capsidica principale pVIII, oltre

a pIII, pVII, pIX, è localizzata nella membrana di E. coli, per questo deve essere

acquisita.

Il batteriofago MS2 ha genoma a singolo filamento di RNA, per cui appartiene alla classe IV

della classificazione di Baltimore. Ha dimensioni di 26 nm, capside formato da 180 copie

della proteina capsidica che lega il pilo F di E. coli (fago sesso-specifico).

L’RNA di MS2 è costituito da 3.569 bp, ha polarità positiva. Presentano il fenomeno della

sovrapposizione genica

Codifica per 4 geni:

●​ proteina del capside;

●​ proteina della maturazione;

●​ proteina della lisi;

●​ subunità della RNA replicasi.

La replicasi di MS2 è una proteina ibrida virus-dipendente, formata dalla proteina P del virus

e da peptidi dell’ospite (appar