Liposomi

Targeting

Per targeting si intende un direzionamento/veicolazione selettiva del F che serve adaumentare l'efficacia terapeutica e ridurre la tossicità (riduco la distribuzione in altri siti.). La ricerca inizia dalla caratterizzazione del target. Il sistema veicolante deve avere una giusta longevità nell'organismo;

Il targeting può essere passivo ed attivo. Targeting passivo si realizza senza nessuna derivatizzazione superficiale del nano-carrier ma che sfrutta caratteristiche fisiologiche del sito patologico bersaglio e caratteristiche morfologiche, chimico-fisiche del carrier.

Il targeting passivo può essere utilizzando per il trattamento dei tumori solidi, per esempio sfruttando l'effetto EPR (Enhanced Permeability and Retention) che descrive l'abilità intrinseca di particelle, con uno specifico diametro, di accumularsi nei tessuti dei tumori solidi; nel particolare, nella cellula tumorale si ha: Un'elevata permeabilità.

legata alla formazione, mediante angiogenesi, di capillari aventi un endotelio fenestrato; ciò aumenta la penetrazione del nanocarrier nell'epitelio vascolare della tumorale

Uno scarso drenaggio linfatico: aumenta il tempo di permanenza del carrier nella cellula tumorale perché non viene allontanato dal sistema linfatico

Targeting attivo: è un processo di derivatizzazione che è basato sul riconoscimento selettivo tra una molecola posta superficialmente sul vettore (peptidi, anticorpi, molecole riconosciute selettivamente dalla cellula tumorale come acido folico o transferrina) ed una molecola espressa selettivamente o in prevalenza del sito d'azione (recettore, antigeni). Pure qui si frutta l'effetto EPR ma solo per localizzare il vettore sulla cellula tumorale e riconoscere il sito d'azione.

Il targeting attivo può essere distinto in:

1. Targeting sensibile agli stimoli: stimoli fisiologici e stimoli esterni (variazioni della T,
utilizzo di un campo magnetico alternato esterno, utilizzo ultrasuoni). Progettando dei nano-vettori pH-sensibili o T sensibili posso ottenere un targeting attivo. Un altro modo è sfruttare delle variazioni del campo magnetico: se metto delle particelle magnetiche nel carrier, applicando dall'esterno un B alternato in una zona specifica, queste particelle vanno in risonanza, si surriscaldano e rilasciano il pa per destabilizzazione del carrier 2) Targeting rivolto all'angiogenesi 3) Targeting rivolto sui recettori di superficie LIPOSOMI vescicole sferiche chiuse costituite da un nucleo acquoso circondato da uno o + doppi strati di fosfolipidi (lamelle o bilayer) separati da compartimenti acquosi. Oltre ai fosfolipidi, troviamo il colesterolo che si dispone parallelamente alle code dei fosfolipidi e conferisce rigidità (riduzione della mobilità dei fosfolipidi); ciò permette di ridurre la permeabilità del bilayer e quindi migliorare laritenzione del F all'interno dei liposomi. In virtù della loro natura, i liposomi sono in grado di inglobare sia Fidrofili che lipofili: Fidrofili (logP< 1,7) vengono incorporati e trattenuti all'interno dei compartimenti acquosi dei liposomi. F lipofili (log P>5) sono incorporati tra le catene idrocarburiche dei fosfolipidi del doppio strato. Parametro critico d'impaccamento (CPP): permette di valutare la tendenza dei fosfolipidi ad impacchettarsi in base alla propria struttura: dove v=volume della molecola; S = area della testa polare; l è la lunghezza della catena. 0 cCPP<0,5 indica che i fosfolipidi tenderanno ad avere una testa più ingombrante della coda (rappresentati a struttura a cono invertito) e tenderanno a formare micelle; se CPP=1 il fosfolipide assume una forma a cilindro e forma vescicole; se CPP>1 si ha una struttura a cono inversa (teste polari verso l'interno). Per avere un micella liposoma quindi CPPIl testo formattato con i tag HTML sarebbe il seguente:

dovrà essere compreso tra 0,5 ed 1

Esiste una fase termoreversibile detta “transizione principale” attraverso la quale la membrana passa da una fase “gel” ordinata ad una fase “liquido-cristallino” più fluida, disordinata e permeabile, ove la libertà di movimento delle singole molecole è >. Questa transizione è un processo endotermico che si verifica in uno stretto intervallo di T intorno ad un valore caratteristico T (main transition temperature).

Parametri chimico-fisici che caratterizzano le preparazioni liposomiali:

Dimensione L’indice di poli-dispersione (P.I) è un parametro che offre un’idea di quanto la popolazione liposomiale sia omogenea in termini di dimensioni e quindi; se P.I < 0,2-0,3 si ha una popolazione omogena e se P.I>1 0,4-0,5 eterogeneo.

Lamellarità: è importante da determinare nel caso in cui si voglia un campione multilamellare o unilamellareun

campione misto non è ottimale. Volume acquoso incapsulato: viene determinato includendo nel liposoma una sonda fluorescente.

Carica superficiale: lo misuro con il principio di elettroforesi (metto in una cella 2 elettrodi, faccio sviluppare ddp un elettrodo è positivo ed uno negativo e vedo il tipo di migrazione della vescicola).

PREPARAZIONE DEI LIPOSOMI

Esistono diversi metodi di preparazione e quello più utilizzato è il "metodo d'idratazine del film lipidico":

1. Dissoluzione dei componenti lipidici in solvente organico (in genere è una miscela cloroformio-metanolo); ciò crea una soluzione omogenea di fosfolipidi e colesterolo.
2. Evaporazione del solvente organico fino ad ottenere un film lipidico sottile sulle pareti del recipiente composto omogeneamente da fosfolipidi e colesterolo.
3. Idratazione del film per aggiunta di una soluzione acquosa, sotto continua agitazione ad una T > a quella di transizione del fosfolipide.

impiegato (T > Tm). Dopo un periodo stabilito, la dispersione liposomiale viene riportata a T < alla Tm e conservati a 4 °C.

Problema di questo metodo è lo Scale-up, ovvero la produzione industriale: tempitroppo lunghi per l'evaporazione di ELEVATI VOLUMI DI SOLVENTI risuoluzione:evaporazione in flusso di azoto: velocizza l'evaporazione riducendo la pp del liquido.

ESTRUSIONE: Si ha la formazione di vescicole con dimensioni eterogenee (problema);ovvero si ha una sospensione contenente liposomi e componenti non strutturati;perciò si esegue un'operazione di filtraggio, utilizzando diversi filtri di dimensionediverse (dal > fino a quello avente un diametro desiderato)l'N andrà a far spingere la fuoriuscita di questa sospensione liposomiale attraverso il filtro ciò permette diridurre MLV in unilamellari. Una tecnica alternativa all'estrusione è la tecnica dellasonicazione: sonda immersa all'interno

della sospensione liposomiale o in un bagnettosonicatore controlo T(T deve essere T melting per rendere la struttura + fluida e lasonicazione ha un effetto disgregante sul liposoma unilamellare

Parametri che influenzano l'efficienza dell'intrappolamento:

• Condizioni tempod'idratazione
• Velocità di agitazione
• Spessore del film lipidico
• Composizione lipidica (PM non troppo elevato; molecole troppo grandi saranno infatti difficili da intrappolare o possono destabilizzare il liposoma)

METODI DI INTRAPPOLAMENTO DEI FARMACI IDROFILI:

1. SOLUBILIZZAZIONE NEL TAMPONE D'IDRATAZIONE DEL FILM LIPIDICO (fase 3)
2. GRADIENTE DI pH: all'esterno della vescicola si pone un pH neutro e dall'interno della vescicola si pone un pH acido: la forma indissociata del F attraverserà la membrana liposomiale ed all'interno della vescicola, essendoci un pH acido, il F si dissocia e rimane intrappolato nella vescicola
3. GRADIENTE DI CONCENTRAZIONE
l'intrappolamento dei farmaci lipofili includono la solubilità delle due specie non cariche, il pKa e la permeabilità. Nel caso specifico del Doxyl, i liposomi vengono preparati in un nucleo acquoso contenente solfato di ammonio o citrato. Questo crea un gradiente di solfato di ammonio attraverso il doppio strato lipidico dei liposomi. Quando la doxorubicina viene aggiunta, si diffonde attraverso la membrana liposomiale in forma indissociata e entra nel compartimento acquoso all'interno dei liposomi, dove forma la doxorubicina solfato che rimane intrappolata all'interno delle vescicole. Grazie a questo metodo, il farmaco può essere incapsulato con un'efficienza superiore al 90% (metodo di carico remoto). I metodi di intrappolamento dei farmaci lipofili includono: 1) Solubilizzazione del farmaco con i lipidi in un solvente organico (fase 1) 2) Co-deposizione del farmaco con i lipidi nel film lipidico mediante evaporazione 3) Idratazione del film con un solvente acquoso Questi fattori influenzano l'efficienza e l'efficacia dell'intrappolamento dei farmaci lipofili.l'intrappolamento dei F lipofili: tipo di liposoma, caratteristiche chimico-fisiche del F (coefficiente di ripartizione), composizione lipidica CLASSIFICAZIONE IN BASE AL TIPO ED ALLE DIMENSIONI I liposomi possono avere un diametro che oscilla tra 30 nm e qualche μm. I liposomi sono classificati in base alle loro dimensioni e al numero di lamelle in: Vescicole unilamellari piccole (SUV): dimensioni comprese tra 30-100 nm con un singolo bilayer. A causa delle loro piccole dimensioni presentano un basso rapporto tra volume acquoso all'interno e moli di lipide. Sono i più usati perché le piccole dimensioni permettono di "scappare" dalla captazione dei macrofagi permanendo più tempo in circolo (targeting passivo) e perché la produzione unilamellare è più facile di quella multilamellare. Vescicole unilamellari grandi (LUV): singolo bilayer lipidico di dimensioni > a 100 nm. Compartimento acquoso > rispetto a SUV. Utili per...veicolare F idrofili
Vescicole unilamellari giganti (GUV): diametro > di 1m
Vescicole multilamellari (MLV): formati da diversi bilayer concentrici di dimensioni >0,5m. Basso V acquoso (dovuto ai molteplici bilayer); perciò utili per l'inglobamento di F lipofili
Vescicole oligolamellari (OLV): pochi bilayer concentrici e con diametro variabile tra 0,1-1m
Liposomi multilamellari sono utili per includere un F lipofilo e quindi amplio la superficie utile per l'intrappolamento.

CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLA CARICA SUPERFICIALE:
Liposomi neutri: (uso fosfolipidi neutri come la fosfatidilcolina o la sfingomielina): minori interazioni elettrostatiche (es: con le proteine)
Liposomi anionici: formulati con una carica anionica (fosfatidilserina)
Liposomi cationici: formulati con una carica cationica (vedi dopo).

CLASSIFICAZIONE IN BASE ALLA COMPOSIZIONE CHIMICA ED ALLORA LORO APPLICAZIONE:
1) Conventional (convenzionale)